Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài vitex limonifolia wall. ex c.b.clark và vitex trifolia l

p xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ lưỡng sắc tròn (CD), độ quay cực ([]D). 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính kháng viêm in vitro được đánh giá qua tác dụng ức chế sự sản sinh NO trong tế bào BV2, kích thích bởi LPS. 4 Xét nghiệm về hoạt tính kháng virus in vitro được thực hiện với phương pháp SRB. 2.3. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia Hình 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. limonifolia 2.3.2. Các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia Hình 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài V. trifolia 5 2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập 2.4.1. Thông số vật lí của các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 12 hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia. 2.4.2. Thông số vật lí của các hợp chất phân lập từ loài V. trifolia Phần này trình bày thông số vật lý và dữ kiện phổ của 16 hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia. 2.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 2.5.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia. - 12 hợp chất (VL1-VL12) được đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên sự ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2, kích thích bởi LPS. Kết quả đánh giá hoạt tính ở nồng độ 20 µM được thể hiện như bảng dưới. Bảng 2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sự sản sinh NO của các hợp chất VL1-VL12 trên tế bào BV2 Hợp chất % tế bào sống sót IC50 (µM) VL1 87,062,43 >50 VL2 120,757,80 2,500,34 VL3 147,828,55 7,130,87 VL4 87,1211,28 24,701,52 VL5 104,519,50 39,673,14 VL6 86,633,23 19,161,09 VL7 96,935,10 45,315,31 VL8 104,519,50 >50 VL9 141,198,73 44,232,48 VL10 119,536,65 15,881,17 VL11 59,045,83 - VL12 80,503,25 >50 L-NMMA 22,101,20 (-) Không đánh giá hoạt tính kháng viêm ở các nồng độ do tỉ lệ % sống sót nhỏ (< 80%) 6 2.5.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất Từ loài V. limonifolia: Các hợp chất VL1-VL12 được tiến hành đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71) theo phương pháp thử nghiệm SRB. Bảng 2.2. Hoạt tính kháng virus CVB3, HRV1B và EV71 của một số hợp chất từ loài V. limonifolia. Kí hiệu CC50 (M) IC50 (M) Coxsackievirus B3 (CVB3) VL4 >50 0,21±0,06 VL6 >50 1,86±0,18 Rupuntrivir >50 0,12±0,06 Human rhinovirus 1B (HRV1B) VL4 >50 0,61±0,21 Ribavirin >50 48,07±1,46 Enterovirus 71 (EV71) VL4 >50 32,05±0,94 Rupuntrivir >50 0,11±0,05 Từ loài V. trifolia: Các hợp chất VT1-VT16 được đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71 ở nồng độ 10 M. Bảng 2.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng một số chủng virus của các hợp chất từ loài V. trifolia Hợp chất % tế bào sống sót Coxsackievirus B3 Human rhinovirus 1B Enterovirus 71 VT1 2,38 5,41 1,30 VT2 3,52 4,23 5,97 VT3 4,99 -1,51 -4,34 VT4 13,27 0,71 3,37 VT5 1,94 -0,12 2,29 VT6 -2,31 -1,87 -5,16 VT7 4,20 -3,10 6,44 VT8 1,85 -0,68 1,42 7 VT9 77,14 80,20 43,35 VT10 -5,98 -1,75 -4,99 VT11 3,44 1,03 -4,94 VT12 1,89 -3,34 -1,17 VT13 6,23 -0,95 -1,87 VT14 -0,63 -0,20 1,53 VT15 -0,19 -2,30 -0,19 VT16 1,32 -1,79 -8,83 CHƯƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được: 28 hợp chất * 12 hợp chất từ loài V. limonifolia: Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. limonifolia 3 hợp chất mới gồm: vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 9 hợp chất đã biết gồm: flavonoid, 5,4′- dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), vitecetin (VL5), 5,4′-dihydroxy- 7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxyurs-12- 8 en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo- 18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10), maslinic acid (VL11), maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12), trong đó, các hợp chất VL4, VL6, VL7, VL10 và VL12 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex. * 16 hợp chất từ loài V. trifolia: Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài V. trifolia 9 2 hợp chất mới gồm: 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26-oic acid (VT1), matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); 14 hợp chất đã biết gồm: ecdysone (VT3), 20- hydroxyecdysone (VT4), 20- hydroxyecdysone 2,3-monoacetonide (VT5), turkesterone (VT6), polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'- dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin (VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O-rhamnosylvitexin (VT14), euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16). Trong đó, hợp chất VT5 lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex, các hợp chất VT3, VT4, VT6 lần đầu tiên phân lập từ loài V. trifolia. 3.1.1. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. limonifolia Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 12 hợp chất được phân lập từ loài V. limonifolia. 3.1.1.1. Hợp chất VL1: Vitexlimolide A (hợp chất mới) Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo Hợp chất VL1 phân lập được dưới dạng chất bột vô định hình, màu trắng. Công thức phân tử của VL1 được xác định là C20H30O4 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion tại m/z 369,1830 [M+Cl]‒ (tính toán lý thuyết cho công thức [C20H30O4Cl]‒, 369,1838). 10 Hình 3.4. Các tương tác HMBC, COSY, NOESY chính của hợp chất VL1 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL1 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu của ba nhóm methyl liên kết trực tiếp với carbon bậc bốn tại δH 0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s) và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (dd, J = 4,0, 8,0 Hz), ba proton olefin tại δH 4,65 (s), 5,13 (s) và 6,01 (d, J = 2,0 Hz). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VL1 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong đó có ba carbon methyl tại δC 14,3, 22,0 và 33,8, bảy methylene tại δC 20,4, 32,0, 32,5, 39,8, 43,3, 67,2 và 110,0, năm methine tại δC 47,6, 48,8, 67,2, 74,7 và 114,4, bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5, 150,6 và 177,5 và một carbon carbonyl tại δC 176,5. Tất cả các dữ liệu phổ trên gợi ý cấu trúc của VL1 là một diterpene khung labdane [42]. Thêm vào đó, số liệu phổ NMR của VL1 tương tự với hợp chất vitexolide E (VL1a), được phân lập từ V. vestita [42], ngoại trừ việc xuất hiện thêm nhóm hydroxy tại C-7. Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên kết đôi tại C-8/C-17 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H- 17 (δH 4,65 và 5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC 150,6)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC 48,8)/C-6 (δC 32,5)/C9 (δC 47,6). Trên phổ 1H- NMR của VL1, hằng số tương tác của H-6 và H-7 nhỏ, J = 3,0 Hz [H-7: δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz)], gợi ý cấu hình của nhóm hydroxy tại C-7 là axial (α). Điều này được khẳng định thêm dựa trên sự so sánh với hằng số tương tác của H-6 và H-7 của hợp chất có nhóm 7β-hydroxy, J = 11,5 Hz 11 [7β-hydroxyisocupressic acid: δH 3,83 (1H, dd, J = 5,0, 11,5 Hz), H-7, đo trong CD3OD)] [120] và hợp chất có nhóm 7α-hydroxy, J  0 Hz [7α- hydroxylabd-8(17)-en-15,18-dioic acid-15-methyl ester: δH 4,38 (br s), H-7, đo trong CDCl3] [121]. Các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 6,01) và C-12 (δC 67,2)/C-13 (δC 177,5)/C-15 (δC 176,5)/C-16 (δC 73,0); giữa H-16 (δH 5,01) và C-14 (δC 114,4)/C-15 (δC 176,5); giữa H-12 (δH 4,58) và C-9 (δC 47,6)/C-11 (δC 32,0)/C-13 (δC 177,5)/C-14 (δC 114,4)/C-16 (δC 73,0) khẳng định sự có mặt của vòng γ-lactone chưa bão hòa tại carbon β (C-13) và vị trí nhóm hydroxy tại C-12. Bằng so sánh độ bội của H-12 (δH 4,58, dd, J = 4,0, 8,0 Hz) của VL1 với các hợp chất có nhóm 12α- hydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz, H-12), đo trong acetone-d6] [42] và hợp chất có nhóm 12β-hydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s, H-12), đo trong acetone-d6] [42], đã gợi ý nhóm hydroxy tại C-12 có cấu hình α. 210 220 230 240 250 260 270 280 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0  , nm   , re la ti v e u n it s V L 1 (c = 1 0 -4 M ) 1 a V L 1 (c = 1 0 -2 M ) 1 b Hình 3.5. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất VL1 và tính toán CD theo lý thuyết của hai epimer 1a và 1b. Để xác định chính xác cấu hình tuyệt đối của C-12, hợp chất VL1 được tiến hành đo phổ CD. Phổ CD thực nghiệm của hợp chất này được so sánh với các tính toán theo lí thuyết (phương pháp TDDFT) [122] của hai epimer 1a (7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide) và 1b (7α,12β-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide)-cấu trúc chỉ khác nhau ở cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12. Kết quả cho thấy, phổ CD 12 của VL1 có hiệu ứng Cotton dương tại max = 218 nm khi đo ở bước sóng 200-244 nm (nồng độ 10-4 M), và hiệu ứng Cotton âm tại max = 251 nm khi đo ở bước sóng 245-280 nm (nồng độ 10-2 M). So sánh với phổ CD của hợp chất 1a (có hiệu ứng Cotton dương tại max = 221 nm và hiệu ứng Cotton âm tại max = 249 nm) và hợp chất 1b (có hiệu ứng Cotton âm tại max = 221 nm). Như vậy, phổ CD của hợp chất VL1 có giống với của 1a, do đó có cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12 được chứng minh là α (tức cấu hình R). Từ những phân tích trên, cấu trúc của hợp chất VL1 được xác định là 7α,12α-dihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là vitexlimolide A. Bảng 3.1. Số liệu NMR của hợp chất VL1 và hợp chất tham khảo C δC δC a,b DEPT δHa,c (J = Hz) 1 39,7 39,8 CH2 1,19 (ddd, 3,0, 12,5, 13,0, α)/1,74 (m, β) 2 20,1 20,4 CH2 1,54 (m, α)/1,64 (m, β) 3 43,0 43,3 CH2 1,30 (m, α)/1,45 (brd, 13,0, β) 4 34,3 34,1 C - 5 56,4 48,8 CH 1,75 (m) 6 25,3 32,5 CH2 1,60 (m, α)/1,91 (ddd, 2,5, 3,0, 14,0, β) 7 39,0 74,7 CH 4,38 (t, 3,0) 8 149,5 150,6 C - 9 52,8 47,6 CH 2,60 (dd, 4,0, 9,0) 10 40,1 40,5 C - 11 32,1 32,0 CH2 1,76 (m) 12 67,3 67,2 CH 4,58 (dd, 4,0, 8,0) 13 176,3 177,5 C - 14 114,2 114,4 CH 6,01 (d, 2,0) 15 174,1 176,5 C - 16 71,8 73,0 CH2 5,01 (m) 17 107,1 110,0 CH2 4,65 (s)/5,13 (s) 18 22,1 33,8 CH3 0,92 (s) 19 34,0 22,0 CH3 0,86 (s) 20 15,2 14,3 CH3 0,74 (s) #C của vitexolide E (VL1a, đo trong acetone-d6) [41], ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz. 13 3.1.1.2. Hợp chất VL2: Vitexlimolide B (hợp chất mới) Hình 3.14. Cấu trúc hóa học VL2 và hợp chất tham khảo (VL1) Hợp chất VL2 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. Công thức phân tử của VL2 được xác định là C20H30O5 dựa vào kết quả phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 385,1772 [M+Cl] ̶ (tính toán lý thuyết cho công thức [C20H30O5Cl] ̶ : 385,1787). Trên phổ 1H-NMR của hợp chất VL2 (đo trong CD3OD) xuất hiện tín hiệu proton của ba nhóm methyl liên kết với carbon bậc bốn tại δH 0,74 (3H, s), 0,86 (3H, s) và 0,92 (3H, s), hai proton hydroxymethine tại δH 4,38 (t, J = 3,0 Hz) và 4,58 (br s), ba proton olefin tại δH 4,78 (s), 5,13 (s) và 6,04 (s). Trên phổ 13C-NMR và DEPT của VL2 xuất hiện tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, trong đó có ba carbon methyl tại δC 14,2, 22,0 và 33,8, sáu methylene tại δC 20,3, 31,2, 32,4, 39,8, 43,3 và 110,5, sáu methine tại δC 66,9, 47,6, 49,0, 74,7, 100,2 và 117,1, bốn carbon không liên kết trực tiếp với hydro tại δC 34,1, 40,5, 150,0 và 173,1 và một carbon carbonyl tại δC 173,1. Số liệu phổ NMR của VL2 khá giống với hợp chất VL1 gợi ý đây cũng là một hợp chất khung labdane. Tuy nhiên, so sánh số liệu phổ NMR của hai hợp chất trên có điểm khác biệt lớn, đó là tín hiệu của nhóm oxymethylene (δH 5,01 và δC 73,0) ở hợp chất VL1 14 được thay thế bằng nhóm hemiacetal (δH 6,23 và δC 100,2) trong hợp chất VL2. Tín hiệu cộng hưởng của các proton trong vòng γ-hydroxy-γ- lactone trên phổ 1H-NMR của VL2 rộng và thấp, cũng như tín hiệu cộng hưởng của C-14 (δC 117,1) và C-16 (δC 100,2) rất khó quan sát trên phổ 13C-NMR gợi ý tồn tại một cân bằng giữa hai đồng phân epimer tại C-16. Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất VL2 Vị trí của nhóm hydroxy tại C-7 và liên kết đôi tại C-8/C-17 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-17 (δH 4,78 và 5,13) đến C-7 (δC 74,7)/C-8 (δC 150,0)/C-9 (δC 47,6); từ H-7 (δH 4,38) đến C-5 (δC 49,0)/C-6 (δC 32,4)/C-9 (δC 47,6). Vị trí của nhóm hydroxy tại C-12 được xác định dựa trên các tương tác HMBC từ H-11 (δH 1,65 và 1,73)/H-14 (δH 6,04) đến C-12 (δC 66,9) và tương tác COSY giữa H-9 (δH 2,62)/H-11 (δH 1,65 và 1,73)/H-12 (δH 4,58). Cấu hình của nhóm hydroxy tại C-12 được xác định là β dựa trên sự so sánh độ bội của H-12 (δH 4,58, br s) của VL2 với các hợp chất có nhóm 12α-hydroxy [vitexolide A: δH 4,56 (br d, J = 10,6 Hz), H-12, đo trong acetone-d6] [42] và hợp chất có nhóm 12β- hydroxy [12-epivitexolide A: δH (4,61 br s), H-12, đo trong acetone-d6] [42]. Từ những phân tích trên, cấu trúc của hợp chất VL2 được xác định là 7α,12β,16-trihydroxylabda-8(17),13-dien-15,16-olide. Đây là hợp chất mới và được đặt tên là vitexlimolide B. 15 Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất VL2 và hợp chất tham khảo C δC δC a,b DEPT δHa,c (J = Hz) 1 39,8 39,8 CH2 1,19 (ddd, 3,0, 13,0, 13,0)/1,71 (m) 2 20,4 20,3 CH2 1,53 (m)/1,63 (m) 3 43,3 43,3 CH2 1,26 (m)/1,45 (brd, 13,0) 4 34,1 34,1 C - 5 48,8 49,0 CH 1,75 (m) 6 32,5 32,4 CH2 1,61 (dd, 3,0, 13,0)/1,90 (m) 7 74,7 74,7 CH 4,38 (t, 3,0) 8 150,6 150,0 C - 9 47,6 47,6 CH 2,62 (br d, 12,0) 10 40,5 40,5 C - 11 32,0 31,2 CH2 1,65 (m)/ 1,73 (m) 12 67,2 66,9 CH 4,58 (br s) 13 177,5 173,1 C - 14 114,4 117,1 CH 6,04 (s) 15 176,5 173,1 C - 16 73,0 100,2 CH 6,23 (s) 17 110,0 110,5 CH2 4,78 (s)/5,13 (s) 18 33,8 33,8 CH3 0,92 (s) 19 22,0 22,0 CH3 0,86 (s) 20 14,3 14,2 CH3 0,74 (s) #C của vitexlimolide A (VL1, đo trong CD3OD), ađo trong CD3OD, b125MHz, c500MHz. 3.1.2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài V. trifolia Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 16 hợp chất được phân lập từ loài V. trifolia. 3.1.2.2. Hợp chất VT2: Matairesinol 4’-O-β-D-glucopyranoside (hợp chất mới) Hợp chất VT2 thu được dưới dạng chất bột vô định hình màu trắng. VT2 có công thức phân tử là C26H32O11 dựa vào phổ HR-ESI-MS xuất hiện pic ion tại tại m/z 521,2009 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức [C26H33O11]+, 521,2017). 16 Hình 3.51. Cấu trúc hóa học của VT2 và hợp chất tham khảo Trên phổ 1H-NMR của VT2 xuất hiện tín hiệu của các proton thuộc 2 vòng thơm hệ ABX tại δH 6,49 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,55 (d, J = 1,6 Hz), và 6,66 (d, J = 8,0 Hz); 6,64 (dd, J = 1,6, 8,0 Hz), 6,73 (d, J = 1,6 Hz), và 7,04 (d, J = 8,0 Hz), hai nhóm methoxy tại δH 3,75 (s) và 3,79 (s), một proton anome tại δH 4,84 (d, J = 8,0 Hz). Phổ 13C-NMR của VT2 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử carbon, trong đó 18 carbon thuộc khung lignan, hai methoxy và sáu carbon thuộc một đơn vị đường. Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của VT2 tương tự với số liệu đã công bố của hợp chất VT2a (matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside) [134], ngoại trừ sự thay đổi vị trí của đơn vị đường glucopyranosyl với khung lignan từ vị trí C-4 chuyển sang vị trí C-4′. Hình 3.52. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của VT2 17 Các tương tác HMBC giữa H-9 (δH 3,91 và 4,16) và C-9′ (δC 181,5); tương tác COSY giữa H-8′ (δH 2,66)/H-8 (δH 2,47)/H-9 (δH 3,91 và 4,16) đã gợi ý sự có mặt của vòng butanolide trong cấu trúc phân tử hợp chất VT2. Các tương tác HMBC giữa H-7 (δH 2,52) và C-1 (δC 131,3)/C-2 (δC 113,3)/C-6 (δC 122,2)/C-8 (δC 42,6)/C-9 (δC 72,9)/C-8′ (δC 47,6); giữa proton nhóm methoxy (δH 3,75) và C-3 (δC 149,0); giữa H-7′ (δH 2,85) và C-1′ (δC 134,2)/C-2′ (δC 114,8)/C-6′ (δC 123,0)/C-8′ (δC 47,6)/C-9′ (δC 181,5)/C-8 (δC 42,6); giữa proton nhóm methoxy (δH 3,79) và C-3′ (δC 150,6) đã khẳng định vị trí của hai nhóm 3-methoxy-4-hydroxyphenyl tại vị trí C-7 và C-7′. Hằng số tương tác proton giữa H-1 và H-2 của hợp phần đường, JH-1″/H-2″ = 8,0 Hz và độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của các nguyên tử carbon trong phân tử đường: C-1′′ (δC 102,9), C-2′′ (δC 74,9), C-3′′ (δC 77,8), C-4′′ (δC 71,3), C-5′′ (δC 78,1) và C-6′′ (δC 62,5) đã gợi ý sự có mặt của phân tử đường β-D-glucopyranosyl. Thêm vào đó, các tương tác HMBC giữa glc H-1″ (δH 4,84) và C-4′ (δC 146,8) xác định vị trí của đường tại C-4′. Cấu hình tuyệt đối của aglycone được xác định nhờ phổ NOESY và phổ CD. Các tương tác NOE giữa H-8′ (δH 2,66) và Hα-9 (δH 3,91); giữa H-8 (δH 2,48) và Hβ-9 (δH 4,16)/H-7 (δH 2,52); giữa H-7 (δH 2,52) và Hα-9 (δH 3,91), gợi ý cấu hình của H-8 và H-8′ là cấu hình trans. Trên phổ CD, VT2 cho hiệu ứng Cotton âm tại bước sóng 226 và 275 nm xác định cấu hình (8R,8′R) trong hợp phần matairesinol [134]. Từ những phân tích trên, cấu trúc của VT2 được xác định là matairesinol 4′-O-β-D- glucopyranoside. Tra cứu cấu trúc của VT2 trên Scifinder cho thấy chưa có công bố/công trình nào liên quan đến hợp chất này, chứng tỏ đây là hợp chất mới. 18 Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất VT2 và hợp chất tham khảo C δC δC a,b δHa,c (J = Hz) 1 132,6 131,3 - 2 112,9 113,3 6,55 (d, 1,6) 3 148,8 149,0 - 4 145,1 146,2 - 5 115,3 116,2 6,66 (d, 8,0) 6 120,5 122,2 6,49 (dd, 1,6, 8,0) 7 36,9 38,9 2,52 (m) 8 40,8 42,6 2,47 (m) 9 70,8 72,9 3,91 (dd, 8,0, 8,8, α) 4,16 (dd, 7,2, 8,8, β) 3-OMe 55,6 56,4 3,75 (s) 1 129,0 134,2 - 2 113,5 114,8 6,73 (d, 1,6) 3 147,5 150,6 - 4 145,1 146,8 - 5 115,4 117,8 7,04 (d, 8,0) 6 121,6 123,0 6,64 (dd, 1,6, 8,0) 7 33,8 35,3 2,85 (dd, 6,8, 12,8) 8 45,7 47,6 2,66 (m) 9 178,6 181,5 - 3-OMe 55,6 56,7 3,79 (s) 4-O-glc 1 100,2 102,9 4,84 (d, 8,0) 2 73,3 74,9 3,46 (dd, 8,0, 9,2) 3 77,1 77,8 3,45 (m) 4 69,7 71,3 3,38 (m) 5 76,9 78,1 3,38 (m) 6 60,7 62,5 3,67 (dd, 4,0, 10,8) 3,85 (br d, 10,8) #C của matairesinol 4-O-β-D-glucopyranoside (đo trong DMSO-d6) [134], ađo trong CD3OD, b100MHz, c400MHz. 19 3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 3.2.1. Hoạt tính kháng viêm in vitro của các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia Đầu tiên 12 hợp chất (VL1-VL12) từ loài V. limonifolia được đánh giá độ độc trên dòng tế bào BV2 ở nồng độ 20 M. Kết quả sàng lọc cho thấy hợp chất VL11 có độc tính mạnh (tỉ lệ sống sót 59,04% < 80%), không được lựa chọn đánh giá hoạt tính kháng viêm. Các hợp chất còn lại không gây độc dòng tế bào BV2 (tỉ lệ sống sót > 80%). Tiếp đó, các hợp chất VL1-VL10, VL12 được đánh giá sàng lọc ức chế sự sản sinh NO trên dòng tế bào BV2, kích thích bởi LPS ở 50 µM. Kết quả sàng lọc cho thấy tất cả các hợp chất được đánh giá đều thể hiện tác dụng ức chế sự sản sinh NO mạnh (% ức chế > 50%) vì thế được đánh giá ở các nồng độ nhỏ hơn: 1,0, 5,0, 10, 20 µM để xác định giá trị IC50. Các hợp chất VL2 và VL3 gây ức chế mạnh sự sản sinh NO mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34 và 7,130,87 M. Các hợp chất VL6 và VL10 thể hiện khả năng ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 với giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17 M, mạnh hơn chất đối chứng dương L-NMMA (IC50 22,101,20 M). Bốn hợp chất VL4, VL5, VL7 và VL9 cũng gây ức chế đáng kể sự sản sinh NO với các giá trị IC50 nằm trong khoảng 24,70 đến 45,31 M (Thấp hơn chất đối chứng dương, L-NMMA). Các kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 của các hợp chất từ loài V. limonifolia đã gợi ý một số nhận định ban đầu về mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng viêm của các hợp chất này như sau: - Trong số các hợp chất labdane phân lập được (VL1-VL3), hợp chất VL2, VL3 thể hiện hoạt tính ức chế mạnh sự sản sinh NO trên tế bào 20 BV2 (giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34, 7,130,87 M) trong cấu trúc phân tử có nhóm hydroxy tại C-16, trong khi hợp chất VL1 (hoạt tính yếu) không có nhóm hydroxy ở vị trí trên; đặc biệt hợp chất VL2 có thêm nhóm hydroxy tại C-12 so với hợp chất VL3 thì thể hiện hoạt tính ức chế NO mạnh hơn. - Các hợp chất flavonoid phân lập được (VL4, VL5 và VL6) thể hiện hoạt tính ức sự sản sinh NO ở mức độ trung bình (giá trị IC50 từ 19,16 đến 39,67 M). 3.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất 3.2.2.1. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. limonifolia Các hợp chất VL1-VL12 phân lập được từ loài V. limonifolia được tiến hành đánh giá hoạt tính kháng các chủng virus coxsackievirus B3 (CVB3), human rhinovirus 1B (HRV1B) và enterovirus 71 (EV71). Kết quả cho thấy, hai hợp chất flavonoid VL4 và VL6 thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh đối với tế bào nhiễm virus CVB3 với các giá trị IC50 lần lượt là 0,21 ± 0,06, 1,86 ± 0,18 μM và đều có giá trị CC50 >50 µM (chất đối chứng dương rupintrivir có IC50 là 0,12 ± 0,06 μM). Đồng thời, hợp chất VL4 còn thể hiện tác dụng ức chế virus HVR1B (với giá trị IC50 là 0,61±0,21 μM và CC50 >50 µM) mạnh hơn so với chất đối chứng dương ribavirin (IC50 là 48,07±1,46 μM). Hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính kháng virus EV71 ở mức độ trung bình (với giá trị IC50 là 32,05±0,94 μM). Kết quả này cho thấy phạm vi kháng virus của hợp chất VL4 đối với các chủng entrovirus khá rộng Các kết quả về hoạt tính kháng virus enterovirus của các hợp chất từ loài V. limonifolia cho thấy 2 hợp chất khung flavonoid (VL4 và VL6) thể hiện hoạt tính kháng virus mạnh. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố 21 cũng cho thấy khả năng kháng một số chủng enterovirus của các hợp chất flavonoid. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng virus in vitro từ các hợp chất phân lập từ loài V. limonifolia đã góp phần gợi mở mối liên hệ về khả năng kháng các chủng enterovirus của hợp chất flavonoid. 3.2.2.2. Hoạt tính kháng virus in vitro của các hợp chất từ loài V. trifolia Các hợp chất VT1-VT16 đã được phân lập từ loài V. trifolia đã được đánh giá khả năng ức chế đối với ba chủng entrovirus là CVB3, HRV1B, và EV71 ở nồng độ 10 M. Qua đánh giá sơ bộ về hoạt tính kháng một số chủng entrovirus, hợp chất VT9 cho thấy hiệu quả tác dụng chống lại các chủng virus CVB3/ HRV1B/ EV71 ở nồng độ 10 M với giá trị tỉ lệ phần trăm tế bào sống sót lần lượt là 77,14%, 80,20%, 43,35%. Các hợp chất còn lại không thể hiện hoạt tính kháng các chủng virus thử nghiệm. KẾT LUẬN Từ lá của 2 loài Vitex limonifolia và Vitex trifolia, chúng tôi đã phân lập và xác định cấu trúc 28 hợp chất và nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất này. 1. Từ loài Vitex limonifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất. Trong đó, có 3 hợp chất mới là vitexlimolide A (VL1), vitexlimolide B (VL2) và vitexlimolide C (VL3); 5 hợp chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Vitex là 5,4′-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavone (VL4), 5,4′-dihydroxy-7,3′-dimethoxyflavone (VL6), verrucosin (VL7), 2α,3α-dihydroxy-19-oxo-18,19-seco-urs-11,13(18)-dien-28-oic acid (VL10) và maltol O-β-D-glucopyranoside (VL12); và 4 hợp chất đã biết khác là vitecetin (VL5), 2α,3α-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid (VL8), euscaphic acid (VL9) và maslinic acid (VL11). 22 2. Từ loài Vitex trifolia đã phân lập và xác định cấu trúc 16 hợp chất. Trong đó, có 2 hợp chất mới là 3α-hydroxylanosta-8,24E-dien-26- oic acid (VT1) và matairesinol 4′-O-β-D-glucopyranoside (VT2); 1 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Vitex là 20-hydroxyecdysone 2,3- monoacetonide (VT5); 3 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ loài V. trifolia là ecdysone (VT3), 20-hydroxyecdysone (VT4) và turkesterone (VT6); và 10 hợp chất đã biết là polypodine B (VT7), rubrosterone (VT8), luteolin (VT9), (2S)-7,4'-dihydroxy-5-methoxyflavanone (VT10), vitexin (VT11), orientin (VT12), homoorientin (VT13), 2-O- rhamnosylvitexin (VT14), euscaphic acid (VT15) và tormentic acid (VT16). 3. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro thông qua ức chế sự sản sinh NO trên tế bào BV2 của 12 hợp chất (VL1 - VL12) phân lập được từ loài Vitex limonifolia. Kết quả cho thấy, các hợp chất VL2, VL3 thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 2,500,34, 7,130,87 M; hợp chất VL6, VL10 thể hiện hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 lần lượt là 19,161,09, 15,881,17M, giá trị này nhỏ hơn so với chất đối chứng dương được sử dụng là L-NMMA (IC50 là 22,101,20 M). Các hợp chất VL4, VL5, VL7 và VL9 thể hiện hoạt tính kháng viêm trung bình với các giá trị IC50 từ 15,88 đến 72,50 M. 4. Đã nghiên cứu hoạt tính kháng virus in vitro đối với ba chủng virus coxsackievirus B3, human rhinovirus 1B và enterovirus 71 của 12 hợp chất (VL1-VL12) phân lập từ loài Vitex limonifolia và 16