Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình công nghệ chiết xuất để tạo sản phẩm có giá trị từ quả táo mèo (docynia indica (wall.) decne) ở Việt Nam

cần đánh sự hội tụ của mô hình thông qua phân tích phương sai. Nếu mô hình hội tụ thì ta xác định phương trình hồi quy và tiến hành tối ưu hóa thông số công nghệ bằng phương pháp hàm nguyện vọng của Harrington (1965). Sử dụng phần mềm Design Expert 7.0.0 để xây dựng mô hình và tối ưu hóa thông số công nghệ quá trình. CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Điều chế cao chiết tổng và cao chiết phân đoạn Quả táo mèo tươi 15 kg được phân loại, rửa sạch và thái lát. Sấy diệt men ở 1100C trong 20 phút và sấy mẫu tới khô ở 600C (hàm ẩm ≤ 10%). Táo mèo khô được nghiền mịn bằng máy nghiền (đường kính lỗ sàng 0.2 mm) thu dược 5 kg bột. Bột nguyên liệu táo mèo 2 kg được chiết siêu âm với methanol ở nhiệt độ phòng, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (3/1, v/w). Lọc dịch chiết và cô đặc bằng máy cô quay áp suất giảm thu 5 được 652 g cặn chiết methanol. Hòa tan cặn methanol với nước cất và chiết phân bố lần lượt với các dung môi các độ phân cực tăng dần là n- hexan, dichloromethane và ethyl acetate. Tiến hành lọc và cô đặc các dịch chiết phân bố thu được các cặn chiết tương ứng là cặn n-hexan (36,2 g); cặn dichloromethane (65 g); cặn ethyl acetate (258,8 g) và cặn nước (289,4 g). 3.1.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn EtOAc quả táo mèo Lấy 114 g cặn chiết ethyl acetate (EtOAc), tiến hành sắc ký cột silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2/MeOH (100:0  0/100) chia thành 8 phân đoạn ký hiệu từ E1 đến E8. Kiểm tra các phân đoạn thu được bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hiện màu bằng thuốc thử H2SO4 5% hoặc kiểm tra bằng máy soi UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm. Gom các phân đoạn giống nhau rồi cô quay đuổi dung môi thu được cao chiết các phân đoạn. Từ các phân đoạn E1 đến E8 tiếp tục tiến hành các phương pháp sắc ký để phân lập, thu các hợp chất sạch. Sơ đồ phân lập được thể hiện ở hình 3.1.1. Hình 3.1.1. Sơ đồ phân lập các thành phần hóa học từ quả táo mèo 3.1.2. Thông số vật lý và dữ kiện phổ các hợp chất (xem luận án) 3.2. Quy trình chiết phenolic và thiết lập mô hình nghiên cứu 3.2.1. Chiết xuất bằng phương pháp soxhlet Chuẩn bị bộ dụng cụ chiết soxhlet. Cân chính xác 10g bột nguyên liệu táo mèo cho vào túi giấy lọc, buộc kín. Đưa túi lọc chứa nguyên liệu vào ngăn chiết. Nạp 500 mL ethanol thực phẩm 96% vào bình cầu 1000 mL. Tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu kết nối thiết bị chiết soxhlet. Bật bếp 6 điện gia nhiệt lên 650C, thời gian chiết là 10 giờ. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được cô quay đuổi dung môi để thu cao chiết tổng. Sau đó sẽ tiến hành định lượng và phân tích hàm lượng phenolic tổng, flavonoid tổng. Hàm lượng cao chiết tổng Y (%) được tính theo khối lượng mẫu đem chiết. Kết quả nghiên cứu được sử dụng làm tiêu chuẩn để so sánh với các phương pháp chiết phenolic dưới đây 3.2.2. Chiết xuất sử dụng vi sóng 3.2.2.1. Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL, thêm 500 ml dung môi (được pha với nồng độ ethanol và độ pH cần nghiên cứu) vào bình cầu. Đưa bình cầu vào lò vi sóng và tiến hành lắp sinh hàn hồi lưu. Bật sinh hàn, bật lò vi sóng ở các mức công suất cần nghiên cứu. Thời gian chiết xuất được tính bắt đầu khi bật lò vi sóng. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết. 3.2.2.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố là Z1: Thời gian chiết xuất (phút); Z2: Nồng độ ethanol chiết xuất (%); Z3: Công suất vi sóng (W) và Z4: Độ pH dung môi chiết. Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lượng flavonoid tổng) và Y3 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Willson với k = 4, chọn cánh tay đòn α = 1.414 và số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm. 3.2.3. Chiết xuất sử dụng siêu âm 3.2.3.1. Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 1000 mL hoặc 2000 mL loại 3 cổ, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu (theo bố trí thí nghiệm). Lắp sinh hàn, nhiệt kế và thiết bị siêu âm đầu dò sau đó tiến hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết siêu âm ở các điều kiện nhiệt độ, công suất siêu âm và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết. 7 3.2.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 4 yếu tố là Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w), Z2: Nhiệt độ chiết siêu âm (0C), Z3: Công suất siêu âm (W) và Z4: Thời gian chiết (phút). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2, Z3 và Z4 lần lượt ký hiệu là A, B, C và D. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 4, số thí nghiệm tại tâm là 3. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 27 thí nghiệm. 3.2.4. Chiết xuất bằng phương pháp hồi lưu 3.2.4.1. Tiến hành thí nghiệm 100g bột nguyên liệu táo mèo được cho vào bình cầu 2000 mL, dung môi chiết sử dụng ethanol 65%, pH dung môi là 5.4 được thêm vào bình cầu ở các tỷ lệ nghiên cứu. Lắp sinh hàn và tiến hành gia nhiệt bằng bếp điện, chiết hồi lưu ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian cần nghiên cứu. Kết thúc quá trình chiết, dịch chiết được lọc qua phễu lọc buchner và cô đặc sẽ thu được cao chiết tổng. Xác định hàm lượng cao chiết tổng (%); hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g cao chiết) và flavonoid tổng (mg QE/g cao chiết) trong cao chiết. 3.2.4.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố là Z1: Thời gian chiết xuất (phút), Z2: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) và Z3: Nhiệt độ chiết xuất (0C). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng), Y2 (Hàm lương cao chiết tổng). Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B, và C. Với k = 3, lựa chọn cánh tay đòn α = 1.215 và số thí nghiệm tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm 3.3. Quy trình sấy phun và thiết kế mô hình 3.3.1. Tiến hành thí nghiệm Dịch sau chiết được lọc và cô đặc thu được 2.1 lít dịch có hàm lượng chất khô đạt 15-20%. Bổ sung chất trợ sấy maltodextrin với tỷ lệ nghiên cứu vào dịch chiết cô đặc. Bật máy khuấy dịch chiết, bật bơm lưu lượng, điều chỉnh lưu lượng dòng cấp ứng với điều kiện nghiên cứu và tiến hành quá trình sấy phun, tác nhân sấy (khí nóng) được thổi vào buồng phun dịch. Nhiệt độ tác nhân sấy được thay đổi theo điều kiện nghiên cứu. Thiết bị sử dụng nghiên cứu là máy sấy phun Buchi B290 mini spray dryer, tốc độ bơm dịch (15-35 mL/phút), nhiệt độ khí nóng đầu vào (120 – 2200C), lưu lượng khí nóng tối đa 35 m3/giờ, công suất bay hơi 1 L H2O/giờ (Viện Công nghệ sinh học – Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà nội). Bột sau sấy phun được phân tích hàm lượng phenolic tổng và hàm ẩm. 8 3.3.2. Thiết kế ma trận kế hoạch thực nghiệm Các yếu tố công nghệ nghiên cứu gồm 3 yếu tố là Z1: Hàm lượng chất trợ sấy maltodextrin (%, w/w), Z2: Nhiệt độ khí nóng đầu vào (0C) và Z3: Tốc độ phun dịch (mL/phút). Hàm mục tiêu là Y1 (hàm lượng phenolic tổng của sản phẩm sau sấy phun), Y2 (độ ẩm của sản phẩm sau sấy phun). Các biến mã hóa của Z1, Z2 và Z3 lần lượt ký hiệu là A, B, và C. Lựa chọn mô hình khảo sát theo Box-Behnken với k = 3, số thí nghiệm tại tâm là 1. Tổng số thí nghiệm của ma trận là 15 thí nghiệm. CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Các hợp chất phân lập được từ cặn EtOAC quả táo mèo Từ cặn chiết ethyl actate quả táo mèo đã phân lập và xác định được 25 hợp chất trong đó gồm: + 19 hợp chất phenolic (TM1, TM2, TM3, TM5, TM7, TM8, TM9, TM10, TM12, TM13, TM15, TM16, TM17, TM18, TM30, TM33, TM35, TM36, TM37). Trong đó có 1 hợp chất mới có tên là 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside (TM17) + 5 hợp chất triterpenoid (TM20, TM22, TM23, TM24, TM25) + 1 dẫn xuất của axit mạch thẳng: (TM6) Bảng 4.1. Các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAC quả táo mèo TT Kí hiệu Tên chất Khối lượng (mg) 1 TM1 Chlorogenic acid methyl ester 45,5 2 TM2 Quercetin 21,0 3 TM3 Protocatechuic acid 6,8 4 TM5 Hyperin 13,5 5 TM6 4-methyl malate 32,0 6 TM7 Naringenin-7-O- β-D-glucopyranoside 11,0 7 TM8 Phlorizin 10,8 8 TM9 3-methoxy, 4-hydroxy-benzoic acid 12,2 9 TM10 Astilbin 22,0 10 TM12 Gallic acid 19,0 11 TM13 Methyl gallate 6,5 12 TM15 Chrysin 9,5 13 TM16 Naringenin 5,6 14 TM17 (Chất mới) 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside 6,5 15 TM18 1-O-coumaroyl-β-D-glucopyranose 12,0 9 16 TM20 Pomolic acid 8,0 17 TM22 Euscaphic acid 7,6 18 TM23 23-Hydroxy ursolic acid 10,5 19 TM24 Ursolic acid 22,0 20 TM25 Maslinic acid 11,2 21 TM30 (2R/S)-5,7,3’,5’-tetrahydroxy-flavanone 7-O-β-D glucopyranosie 8,2 22 TM33 Phloretin-2’-O-(β-D-xylopyranosyl-(16)-O-β-D glucopyranoside) 11,3 23 TM35 Cis-p-coumaric acid 4-O-β-D-glucopyranoside 7,6 24 TM36 Myricitrin 7,2 25 TM37 2’,6’-dihydroxy-3’,4’- dimethoxychalcone 4,4 4.1.1. Hợp chất 3S-thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside (TM17) – Hợp chất mới Hợp chất TM17 thu được ở dạng chất rắn màu trắng. Trên phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của TM17 xuất hiện các píc ion giả phân tử lần lượt là [M - H]¯ tại m/z 433.1119, [M + 35Cl]¯ tại m/z 469.0890 và [M + 37Cl]¯ tại m/z 471.0870. Tính toán lý thuyết cho ion [C21H21O10]¯có m/z 433.1129, ion [C21H22ClO10]¯ có m/z 469.0896 tương ứng với đồng vị 35Cl và 471.0876 tương ứng với đồng vị 37Cl. Từ các dữ kiện trên phổ khối phân giải cao, CTPT của TM17 được xác định là C21H22O10. Độ quay cực của hợp chất TM17 là [α]D = - 69 0 (c = 0.1, MeOH) Hình 4.1.1.1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất TM17 Trên phổ 1H-NMR của hợp chất TM17 xuất hiện hệ spin AABB [δH 6.80 (d, J= 8.5 Hz, H-3′, 5′); 7.32 (d, J= 8.0 Hz, H-2′, 6′)] cho phép xác định vòng phenyl thế 2 lần trong hợp chất TM17. Bên cạnh đó, vòng thơm của nhân isocoumarin đặc trưng bởi tín hiệu cộng hưởng có độ chuyển [M + 35Cl]¯ [M - H]¯ [M + 37Cl]¯ CTPT: C21H22O10 10 dịch hóa học [δH 6.54 (br s, H-5); 6.52 (d, J= 2 Hz, H-7, TM17a); 6.51 (d, J= 2 Hz, H-7, TM17b)], trong khi vòng lactone xuất hiện với các tín hiệu cộng hưởng ở δH 5.61 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17a); 5.59 (t, J= 2.5 Hz, H-3, TM17b); 3.11 và 3.07 (H-4a); 3.34 (m, H-4b). Hình 4.1.1.2. Phổ 1H-NMR của hợp chất TM17 Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT cho thấy có 21 tín hiệu của nguyên tử carbon bao gồm 2 carbon nhóm methylene (-CH2), 12 carbon nhóm methine (-CH) và 7 carbon không liên kết với hydro. Trong đó có 1 tín hiệu của nhóm keton liên kết với nguyên tử oxy (O-C=O) đặc trưng của khung dihydroisocoumarin xuất hiện tại δC 169.25/169.18 ppm, 2 cặp tín hiệu carbon đối xứng của vòng B tại δC (ppm) 128.22/ 128.20 và 115.18 chứng tỏ vòng B bị thế ở 2 vị trí đối xứng nhau trên vòng (C-1’ và C4’), 2 tín hiệu carbon đặc trưng của vòng lactone tại δC (ppm) 80.0 và 33.66; Bên cạnh đó sự xuất hiện của 6 tín hiệu carbon ở độ chuyển dịch hóa học δC (ppm) 99.77/99.67; 73.06; 76.44; 69.51; 77.11 và 60.52 gợi ý đây là 6 tín hiệu carbon của 1 cấu tử đường. Trên phổ 2 chiều HMBC đã thể hiện sự tương tác của proton anomeric δH (ppm) 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) với nguyên tử carbon C-6 của phần aglycon. Hằng số tương tác của proton anomer J= 7.5 – 8.0 Hz cho phép khẳng định đây là đường dạng beta. Phổ HMBC cũng thể hiện các tương tác giữa H-7 (δH 5.51/5.52) với C-5 (δC 107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-4 (δH 3.08/3.34) với C-5 (δC 107.37/107.27), C-9 (δC 102.56/102.54); H-5 (δH 6.55) với C-4 (δC 33.66); H-3 (δH 5.61/5.59) với C-10 (δC 142.15), C-6’ (δC 128.22/ 128.20), C- 2’(δC 128.22/128.20); H-2’(δH 7.32), H-6’(δH 7.32) với C-4’ (δC 157.76); 11 H3’(δH 6.80), H-5’(δH 6.80) với C-1’(δC 128.47/128,45). Các tương tác trên cho phép xác định vị trí 2 nhóm thế hydroxyl tại C-8 và C-4’. Hình 4.1.1.3. Phổ 13C-NMR của hợp chất TM17 Hình 4.1.1.5. Phổ HSQC và HMBC của hợp chất TM17 Các tín hiệu trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR nêu trên có thể khẳng định phần aglycon của TM17 chính là thunberbinol C [72] Tiến hành thủy phân TM17 và chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao với các đối chứng chuẩn đã xác định được cấu tử đường trong phân tử TM17 là đường β-D-glucose. 12 Hình 4.1.1.6. Sắc ký đồ HPLC xác định cấu tử đường Trong cấu trúc hóa học của hợp chất TM17, vị trí carbon C-3 là carbon bất đối. Do đó, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất TM17, chúng tôi tiến hành đo phổ lưỡng sắc tròn (phổ CD). Kết quả trên phổ CD cho các hiệu ứng cotton âm xảy ra ở các bước sóng 227 nm (Δε -2.29), 255 nm (Δε -4.85) và 305 nm (Δε -1.21). Trong đó hiệu ứng cotton âm xảy ra mạnh nhất ở bước sóng 255 nm (Δε -4.85) (Hình 4.1.1.9). Tiến hành so sánh phổ CD của hợp chất TM17 với các hợp chất có cấu trúc hóa học và vị trí carbon bất đối tương tự hợp chất TM17 như các hợp chất: 3S- hydrangenol 4’-O-glucoside, 3S-thunberginol I 4’-O-glucoside và 3S- florahydroside. Ở 3 hợp chất vừa nêu, trên phổ CD của chúng đều xảy ra hiệu ứng cotton âm mạnh nhất lần lượt tại 260 nm (Δε -3.76), 255 nm (Δε -8.30) và 255 nm (Δε -0.79) [72-74]. Điều này chỉ ra hợp chất TM17 phù hợp với cấu hình dạng 3S của 3-aryl dihydroisocoumarin. Do đó, hợp chất TM17 được khẳng định là 3S-thunberginol C 6-O-β-D-glucopyranoside. Đây là hợp chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên. Tuy nhiên, trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu kép xuất hiện theo các cặp tín hiệu rất sát nhau (như trong bảng dữ liệu phổ 4.1.1). Chúng tôi đặt giả thuyết hợp chất TM17 tồn tại đồng thời ở 2 cấu dạng bền khác nhau nên khi đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân sẽ xảy ra hiện tượng như trên. Để chứng minh cho giả thuyết này, chúng tôi tiến hành tính toán lý thuyết năng lượng bền của các cấu dạng có thể của hợp chất TM17 thông qua việc tính toán enthalpy tương đối (ΔH) của hợp chất này, sử dụng phương pháp DFT (density functional theory method). Kết quả tính toán lý thuyết đã cho thấy 02 cấu dạng nửa thuyền tồn tại ở trạng thái năng lượng bền với ethalpy tương đối lần lượt là H = 0.0 kcal/mol và H = 0.2 kcal/mol. Điều này đã làm sáng tỏ giả thuyết nêu trên của chúng tôi rằng hợp chất 3S-Thunberginol C 6-O-β- D-glucopyranoside tồn tại ở 2 loại cấu dạng bền khác nhau (a/b). 13 Hình 4.1.1.7. Cấu trúc hóa học của TM17 Hình 4.1.1.8. Phổ CD của TM17 (a) (b) Hình 4.1.1.9. Hai cấu dạng bền kiểu nửa thuyền của hợp chất TM17 Bảng 4.1.1. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất TM17 và chất so sánh thunberginol C Vị trí C TLTK (DMSO-d6) [72] TM17 (DMSO-d6) δH (ppm) δC (ppm) δH (ppm) δC (ppm) 1 169.4 169.25 / 169.18 3 5.54 (1H, t, J= 3.0 Hz) 79.7 5.61 (1H, t, J = 2.5 Hz) / 5.59 (1H, t, J = 2.5 Hz) 80.0 4 3.03 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4a) 3.24 (1H, dd, J= 3.0; 17.0 Hz, H-4b) 33.6 3.11 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a)/3.07 (1H, t, J= 2.5 Hz, H-4a) 3.35 (overlap, H-4b) 33.66 5 6.3 (1H, d, J= 2.0 Hz) 106.8 6.55 (1H, br s) 107.37 / 107.27 6 164.4 162.99 7 6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz) 100.9 6.52 (1H, d, J= 2.0 Hz) / 6.51 (1H, d, J = 2.0 Hz) 101.76 14 8 11.1 (-OH) 163.3 11.09 (-OH) 163.28 9 100.3 102.56 / 102.54 10 142.2 142.15 1’ 128.6 128.47 / 128.45 2’ 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 128.0 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 128.22 / 128.20 3’ 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 115.1 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz) 115.18 4’ 157.6 157.76 5’ 6.8 (1H, d, J=9.0 Hz) 115.1 6.80 (1H, d, J = 8.5 Hz) 115.18 6’ 7.31 (1H, d, J=9.0 Hz) 128.0 7.32 (1H, d, J = 8.0 Hz) 128.22 / 128.20 1’’ 4.99 (1H, d, J = 7.5 Hz)/ 4.97 (1H, d, J = 8.0 Hz) 99.77 / 99.67 2’’ 3.24, m 73.06 3’’ 3.37, m 76.44 4’’ 3.18, m 69.51 5’’ 3.2, m 77.11 6’’ 3.46 (1H, m) 3.76 (1H, m) 60.52 4.2. Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết và các hợp chất phân lập được 4.2.1. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tim mạch (sEH) 4.2.1.1. Đối với cao chiết Cao chiết phân đoan n-hexan thì không thể hiện hoạt tính ở nồng độ 37.5 và 75 µM, thể hiện hoạt tính thấp ở 150 µM. Các phân đoạn còn lại thể hiện hoạt tính giảm dần: cao ethyl acetate > cao dichloromethane > cặn nước > cao tổng methanol. Bảng 4.2.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính sEH với cao chiết TT Phân Đoạn cao chiết Nồng độ thử (µM) Phần trăm ức chế I (%) 1 Dichloromethane 37.5 28.0 ± 3.4 2 75 57.9 ± 0.1 3 150 83.8 ± 2.7 4 Ethyl acetate 37.5 36.7 ± 2.5 5 75 68.7 ± 3.5 6 150 92.7 ± 1.2 7 Cặn nước 37.5 25.4 ± 1.2 15 8 75 45.9 ± 0.2 9 150 68.4 ± 0.1 10 Cao tổng methanol 37.5 4.9 ± 0.5 11 75 12.8 ± 1.7 12 150 21.1 ± 2.2 4.2.2.2. Đối với các hợp chất phân lập được Có 8 trên 25 hợp chất thể hiện hoạt tính bao gồm các chất là TM1, TM5, TM8, TM10, TM16, TM24, TM33 và TM37. Giá trị IC50 (µM) của 8 hợp chất này nằm trong khoảng từ 10.0 ± 0.6 đến 88.4 ± 0.2. Trong đó, 2 hợp chất TM9 và TM37 thể hiện hoạt tính mạnh nhất khi có các giá trị IC50 lần lượt là 19.3 ± 2.2 và 10.0 ± 0.6 µM. Bảng 4.2.2.2. Kết quả thử hoạt tính sEH với các hợp chất phân lập được TT Kí hiệu Phần trăm ức chế tại nồng độ 100 µM (%) IC50 (µM) đối chứng (+) Auda 16.8 ± 0.5 nM 1 TM1 73.3 ± 1.1 41.9 ± 1.1 2 TM5 72.8 ± 0.2 30.5 ± 0.1 3 TM9 >100 19.3 ± 2.2 4 TM10 79.9 ± 0.4 22.9 ± 0.2 5 TM16 76.8 ± 0.06 24.7 ± 2.5 6 TM24 74.0 ± 2.8 36.1 ± 0.6 7 TM33 52.7 ± 0.2 88.4 ± 0.2 8 TM37 >100 10.0 ± 0.6 4.2.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Trong tổng số 25 hợp chất đem thử thì có tới 14 hợp chất thể hiện hoạt tính với giá trị SC50 (µg/mL) nằm trong khoảng (18.05 ± 0.69 đến 49.34 ± 1.22). Đặc biệt trong 14 hợp chất thể hiện hoạt tính có 1 hợp chất thể hiện hoạt tính mạnh hơn cả đối chứng dương là hợp chất TM12 có giá trị SC50 là 18.05 (µg/mL). Bảng 4.2.1. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập Ký hiệu Giá trị SC50 (µg/mL) Ký hiệu Giá trị SC50 (µg/mL) Đối chứng (+) Ascorbic acid 26.40 ± 0.44 TM12 18.05 ± 0.69 TM1 35.48 ± 2.02 TM15 30.12 ± 0,15 TM2 31.37 ± 0.12 TM16 33.47 ± 0,51 16 TM3 28.18 ± 1.18 TM17 40.51 ± 0.78 TM5 29.17 ± 1.67 TM30 41.81 ± 0.45 TM7 49.34 ± 1.22 TM36 42.76 ± 2.12 TM9 29.11 ± 0.17 TM37 29,12 ± 0.38 TM10 42.32 ± 0.42 4.2.3. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết Chỉ có 2 cao chiết phân đoạn n-hexan và dicholoromethane (CH2Cl2) là thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thư cổ tử cung hela với giá trị IC50 lần lượt là 99.24 µg/mL và 67.2 µg/mL. Các cao chiết phân đoạn còn lại không thể hiện hoạt tính. 4.3. Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết phenolic từ quả táo mèo quy mô phòng thí nghiệm. 4.3.1. Kết quả chiết soxhlet thu cao chiết toàn phần Phương pháp chiết soxhet cho hiệu suất chiết rất cao do đây là phương pháp chiết kiệt nhất. Hàm lượng cao chiết tổng thu được trung bình đạt 36,07%. Hàm lượng phenolic tổng và hàm lượng flavonoid tổng cũng rất cao với giá trị trung bình lần lượt là 28,9 (mg GAE/g cao chiết) và 20,0 (mg QE/g cao chiết). 4.3.2. Mô hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết vi sóng 4.3.2.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.2.2. Thiết lập mô hình và xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu. Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng tôi lựa chọn mô hình nghiên cứu theo mô hình bậc 2 của Box-Willson. Các mức gốc (hay mức cơ bản) của các yếu tố và hệ số α = 1.414 (với k= 4) được thể hiện ở bảng 4.3.2.2a Bảng 4.3.2.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ Tên biến, khoảng biến thiên Mức nghiên cứu Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) -α -1 0 1 +α Z1: thời gian chiết (phút) A 15 9 15 30 45 51 Z2: Nồng độ ethanol (%) B 20 32 40 60 80 88 Z3: Công suất máy vi sóng (W) C 160 175 240 400 560 625 Z4: độ pH D 2 1.2 2 4 6 6.8 17 Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 27 thí nghiệm và đánh giá sự hội tụ của mô hình thông qua phân tích phương sai. Kết quả mô hình nghiên cứu được xác định là tương hợp với thực nghiệm. Sau khi loại bỏ các yếu tố không có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau: + Y1 = 29.42 + 2.93A + 0.88B + 1.78C + 0.76D – 0.89AB + 1.09AD – 1.02BC – 1.3B2 – 1.1D2 (1) + Y2 = 21.22 + 2.32A + 0.68B + 0.99C + 0.41D – 0.59AB + 0.62AD – 1.11BC + 0.39BD – 0.92B2 – 0.57D2 (2) + Y3 = 29.65 + 2.55A + 1.06B + 1.05C + 0.61D – 0.46AC + 0.49AD – 0.97BC – 0.91B2 (3) 4.3.2.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Quá trình chiết xuất cần được tối ưu sao cho cả 3 hàm mục tiêu Y1, Y2 và Y3 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, chúng tôi lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: Hàm Y1 (mức 5); hàm Y2 (mức 3); hàm Y3 (mức 2). Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.2.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.64 (mg GAE/g); Y2 = 25.1 (mg QE/g) và Y3 = 33.33 (%). Bảng 4.3.2.3a. Kết quả tối ưu các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực A B C D Thời gian (phút) Nồng độ ethanol (%,v/v) Công suất vi sóng (W) Độ pH dung môi 1.34 0.23 0.26 0.7 50.1 64.6 441.6 5.4 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất nhỏ. Chứng tỏ mô hình xây dựng có độ chính xác cao. 4.3.3. Mô hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết siêu âm 4.3.3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.3.2. Thiết lập mô hình và xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu. 18 Bài toán này dựa vào các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu, chúng lựa chọn mô hình nghiên cứu theo mô hình bậc 2 của Box-Behnken. Các mức gốc (0), mức thấp (- 1) và mức cao (+1), của các yếu tố (với k= 4) và khoảng biến thiên được thể hiện ở bảng 4.3.3.2a. Bảng 4.3.3.2a. Các mức thí nghiệm của các biến biến công nghệ Biến thực Biến mã Khoảng biến thiên (Δ) Mức nghiên cứu -1 0 1 Z1: Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) A 2 5 7 9 Z2: Nhiệt độ chiết (0C) B 15 30 45 60 Z3: Công suất siêu âm (W) C 40 100 140 180 Z4: Thời gian chiết (phút) D 15 45 60 75 Sử dụng phần mềm design expert để xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm với 29 thí nghiệm và đánh giá sự hội tụ của mô hình thông qua phân tích phương sai. Kết quả mô hình nghiên cứu được xác định là tương hợp với thực nghiệm. Sau khi loại bỏ các yếu tố không có ý nghĩa. Hàm mục tiêu được xác định và biểu diễn bằng phương trình hồi quy bậc 2 như sau: + Y1 = 33.60 + 1.35B – 0.94C + 1.1D – 1.52AC + 1.7BC + 2.49BD + 1.63CD – 2.45A2 – 4.8B2 – 4.58C2 – 3.30D2 (1) + Y2 = 28.59 + 2.44A + 1.75C + 5.97D + 2.39AB + 5.33AD – 2.27BC – 4.72A2 – 2.75B2 – 2.9C2 – 2.17D2 (2) 4.3.3.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất Tương tự như bài toán trước đó, quá trình chiết xuất nguyên liệu táo mèo cần được tối ưu sao cho cả 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 đều đạt giá trị lớn nhất. Điều này được giải quyết bằng việc tiến hành giải bài toán tối ưu bằng phần mềm Design expert 7.0 theo phương pháp hàm nguyện vọng với các mức độ ưu tiên (từ 1 đến 5). Trong bài toán này, với các mục tiêu đặt ra, nghiên cứu sinh lựa chọn mức độ ưu tiên cho các hàm mục tiêu như sau: Hàm Y1 (mức 5), hàm Y2 (mức 3). Tại điều kiện các thông số công nghệ như bảng 4.3.3.4, giá trị dự đoán của các hàm mục tiêu lần lượt là Y1 = 33.0 (mg GAE/g) và Y2 = 32.83 (%). Bảng 4.3.3.3. Kết quả tối ưu các biến công nghệ Biến mã hóa Biến thực A B C D Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (v/w) Nhiệt độ chiết siêu âm (0C) Công suất chiết siêu âm (W) Thời gian chiết (phút) 0.29 0.27 0.05 0.61 7.58 49.05 142 69.15 19 Tại điều kiện tối ưu, tiến hành thực nghiệm so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả tính toán lý thuyết cho thấy mức độ sai khác là rất nhỏ. Chứng tỏ mô hình xây dựng có độ chính xác cao. 4.3.4. Mô hình nghiên cứu và tối ưu quy trình chiết xuất phenolic bằng phương pháp chiết hồi lưu 4.3.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đơn biến đến hàm mục tiêu 4.3.4.2. Thiết lập mô hình và xác định phương trình hồi quy hàm mục tiêu Từ các số liệu thí nghiệm ảnh hưởng của các thông số công nghệ đơn biến đến hàm mục tiêu Y1 và Y2, nghiên cứu sinh lựa chọn mô hình bậc 2, kế hoạch hóa thực ngh