Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thay đổi Lysyl oxidase của tế bào nội mô mạch máu võng mạc ở môi trường nồng độ glucose cao

nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (63 ± 8% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). Thêm vào đó, khi các tế bào nuôi cấy trong môi trường glucose nồng độ cao được ủ với LOXsiRNA hoặc BAPN, hoạt động AKT tăng rõ ràng (87 ± 8% nhóm đối chứng, và 76 ± 10% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). * Tác động của thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình 0 100 200 300 400 16 Số lượng tế bào chết/1000 tế bào tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao so với môi trường bình thường (4.68 ± 0.9 và 1.48 ± 0.32, tương ứng, p<0.05, n=6) và giảm khi tế bào được ủ LOXsiRNA (2.78 ± 0.37, p<0.05, n=6). Tương tự như vậy, với thử nghiệm BAPN, môi trường nồng độ cao có ủ BAPN ức chế hoạt động của LOX, số lượng tế bào chết/1000 tế bào giảm đáng kể so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ cao đơn thuần (2.85 ± 0.34 và 4.38 ± 0.84, tương ứng, p<0.05, n=6). 3.3. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao 3.3.1. Thay đổi sự bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào 3.3.1.1. Trong protein toàn phần Nghiên cứu chỉ ra sự tăng đáng kể lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein toàn phần của các tế bào được nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao so với nhóm tế bào nuôi cấy trong môi trường bình thường (144±12% nhóm đối chứng và 168±11% nhóm đối chứng, p<0.05, n=6). 3.3.1.2. Trong protein chất nền ngoại bào Lượng LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (138±20% nhóm đối chứng và 156±21% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). 3.2.2. Thay đổi mật độ liên kết của LOX với protein chất nền ngoại bào 3.3.2.1. Trong protein toàn phần 17 Mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein toàn phần tăng rõ rệt ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (192±21% nhóm đối chứng, và 183±19% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). 3.3.2.2. Trong protein chất nền ngoại bào Mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN trong protein chất nền ngoại bào tăng đáng kể ở các tế bào nuôi cấy trong môi trường nồng độ glucose cao (143±10% nhóm đối chứng và 158±15% nhóm đối chứng, tương ứng, p<0.05, n=6). Chương 4: BÀN LUẬN 4.1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao 4.1.1. Thay đổi mức độ biểu hiện của LOX Màng đáy mao mạch dày lên từ lâu đã được phát hiện trong bệnh võng mạc đái tháo đường và được chứng minh có liên quan đến cơ chế bệnh sinh của bệnh này. Điều nghịch lý là màng đáy mao mạch dày lên lại gây tăng rò rỉ mạch máu trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Để giải thích cho hiện tượng này, các báo cáo đã đề xuất rằng có sự thay đổi các liên kết chéo giữa các thành phần của màng đáy gây ảnh hưởng đến quá trình hình thành và cấu trúc của màng đáy, do đó tổn hại hàng rào mạch máu võng mạc. Nghiên cứu của Lucero, Rodriguez và Nishioka cho thấy rằng tính toàn vẹn của màng đáy và cấu trúc chất nền ngoại bào đòi hỏi lượng thích hợp liên kết chéo phụ thuộc LOX. LOX là một enzym liên kết chéo đóng vai trò thiết yếu trong sự phát triển và trưởng thành của màng đáy. LOX điều hoà quá trình hình thành liên kết cộng hoá trị giữa các sợi collagen tạo thành dạng collagen không bị hoà tan và có độ bền kéo cần thiết cho chức năng của mô liên kết bình thường, từ đó tạo nên lớp chất nền ngoại bào bền vững. Tuy nhiên, nếu các liên kết chéo này quá nhiều có thể dẫn đến dày và tổn hại 18 chức năng màng đáy do hình thành các bó sợi collagen bất thường, gây tích luỹ chất nền ngoại bào. Nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy có sự biểu hiện quá mức enzym LOX ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường. Tuy nhiên sự thay đổi của LOX ở mức độ tế bào cũng như tác động của sự thay đổi đó tới hoạt động của tế bào còn chưa biết rõ. Do đó trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá mức độ biểu hiện, hoạt động của LOX và tác động của sự thay đổi này tới độ thẩm thấu tế bào và hiện tượng chết tế bào theo chương trình ở tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong điều kiện môi trường nồng độ glucose cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ ra rằng nồng độ glucose cao ảnh hưởng đáng kể tới mức độ biểu hiện LOX. Đây là nghiên cứu đầu tiên phân tích chi tiết tác động của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy tới mức độ biểu hiện của LOX ở bên trong và bên ngoài tế bào. Theo đó, lượng LOX trong protein toàn phần tăng, trong khi lượng LOX quay trở lại tế bào giảm sau khi nuôi cấy tế bào trong môi trường nồng độ glucose cao. Thêm vào đó, nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy tác động của môi trường nồng độ glucose cao đối với mức độ biểu hiện LOX ở môi trường ngoại bào có sự biến thiên theo thời gian. Ngoài ra môi trường glucose cao cũng gây tăng mật độ LOX và hoạt động LOX. Sự rối loạn này được điều chỉnh bởi các chất ức chế LOX như LOXsiRNA và BAPN. Kết quả này củng cố thêm cho phát hiện trước đây là nồng độ enzym LOX tăng ở võng mạc chuột mắc đái tháo đường và có sự tăng các liên kết chéo phụ thuộc LOX ở collagen da trong đái tháo đường. Hiện nay có rất ít thông tin liên quan đến biểu hiện LOX ở võng mạc bệnh nhân đái tháo đường. Nghiên cứu gần đây trên mẫu dịch kính bệnh nhân mắc võng mạc đái tháo đường tăng sinh biểu hiện tăng đáng kể nồng độ LOX so với người không mắc bệnh đái tháo đường. Không có sự khác biệt đáng kể về mức LOX trong dịch kính ở nam và nữ của cả 2 nhóm đái tháo đường và không đái tháo đường. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với các phát hiện của chúng tôi, thể hiện nồng độ glucose cao hoặc 19 đường huyết cao gây tăng mức biểu hiện LOX trong các tế bào nội mô mạch máu võng mạc trên thí nghiệm và trong các tế bào mạch máu võng mạc ở chuột đái tháo đường. Dịch kính được coi như bể chứa các chất trung gian của quá trình viêm, hình thành tân mạch võng mạc và các phần khác của mắt. Các nghiên cứu tiếp theo cần được thực hiện để xác định liệu mẫu dịch kính của LOX có thể sử dụng như một chất chỉ điểm sinh học và hỗ trợ trong sự xác định quá trình tiến triển bệnh võng mạc đái tháo đường. Thêm nữa, nó cung cấp thông tin cơ bản cho các nghiên cứu sâu hơn để xác định liệu ức chế LOX có thể là phương pháp hữu ích trong ngăn ngừa tổn thương mạch máu võng mạc liên quan tới cơ chế bệnh sinh của bệnh võng mạc đái tháo đường. 4.1.2. Thay đổi hoạt động của tế bào liên quan đến thay đổi mức độ biểu hiện của LOX 4.1.2.1. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tới độ thẩm thấu tế bào Các kết quả từ nghiên cứu này chỉ ra rằng sự biểu hiện quá mức của LOX trong các tế bào nội mô mao mạch võng mạc liên quan đến môi trường nồng độ glucose cao có liên quan đến tăng độ thẩm thấu tế bào và thúc đẩy quá trình chết tế bào theo chương trình. Độ thẩm thấu của tế bào tăng rõ rệt khi tế bào được nuôi cấy ở môi trường glucose nồng độ cao và được điều chỉnh khi môi trường này được ủ thêm các chất ức chế LOX như LOXsiRNA hoặc BAPN. Điều này chỉ ra hàm lượng và hoạt động LOX có tác động tới độ thẩm thấu của tế bào. Sự dư thừa liên kết chéo xúc tác bởi LOX hình thành các bó sợi collagen bất thường gây tổn hại sự toàn vẹn siêu cấu trúc màng đáy. Từ đó gợi ý một cơ chế tiềm tàng gây rò mạch võng mạc liên quan đến dày màng đáy trong bệnh võng mạc đái tháo đường. 20 4.1.2.2. Tác động của sự thay đổi mức độ biểu hiện LOX tới hiện tượng chết tế bào theo chương trình Trong khi LOX được biết đến chủ yếu với vai trò hình thành các liên kết chéo, các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, tăng lượng LOX có thể khởi động hiện tượng chết tế bào theo chương trình. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng LOX dư thừa góp phần gây chết tế bào theo chương trình bằng cách tổn thương đường tín hiệu AKT. Đặc biệt là khi lượng LOX được điều chỉnh về mức gần bình thường nhờ LOXsiRNA hoặc hoạt động của LOX bị kìm hãm bởi BAPN, hoạt động AKT được cải thiện rõ rệt. Những điều trên chỉ ra rằng có sự liên quan mật thiết giữa sự biểu hiện của LOX và hoạt động AKT. Phát hiện này củng cố thêm cho các nghiên cứu trước đó rằng LOX tăng quá mức làm tổn hại hoạt động AKT góp phần gây chết tế bào theo chương trình. Tương tự trên mô hình động vật trong nghiên cứu của Kim và cộng sự, võng mạc của chuột đái tháo đường cũng biểu hiện tăng lượng LOX và tổn hại hoạt động AKT. Ở chuột LOX +/- mắc đái tháo đường do tiêm Streptozotocin, hoạt động AKT không bị tổn hại đáng kể. Tóm lại, những phát hiện trên đây của chúng tôi chỉ ra rằng, môi trường nồng độ glucose cao gây tăng hàm lượng và hoạt động của LOX liên quan đến rối loạn chức năng tế bào nội mô mạch máu võng mạc và tăng độ thẩm thấu tế bào quá mức. LOXsiRNA và BAPN có tác dụng ức chế sự biểu hiện và hoạt động của LOX giúp bảo vệ hàng rào mạch máu võng mạc. Do đó giảm mức độ biểu hiện của LOX có thể là một mục tiêu đích tiềm năng trong ngăn ngừa các tổn thương liên quan đến bệnh võng mạc đái tháo đường. 21 4.2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc trong môi trường nồng độ glucose cao N: Môi trường bình thường. HG: Môi trường nồng độ glucose cao Hình 3. Tác động của môi trường nồng độ glucose cao tới sự kết dính của LOX với chất nền ngoại vào và LOX quay trở lại tế bào ! 1 ngày N 5 ngày N 7 ngày N 3 ngày N ! Pro!LOX! LOX!PP! LOX! !Tế!bào! Chất!nền! ngoại!bào! 1 ngày HG 5 ngày HG 7 ngày HG 3 ngày HG 22 Bất thường về hình thái của màng đáy mạch máu võng mạc của bệnh nhân đái tháo đường phản ánh quá trình tái cấu trúc ít được biết đến. Những bất thường cấu trúc này có thể là kết quả của sự dư thừa các liên kết chéo biểu hiện bằng hiện tượng dày màng đáy mao mạch võng mạc, một đặc trưng chủ yếu của bệnh võng mạc đái tháo đường. Sự tăng các thành phần màng đáy như FN, Coll IV và laminin trong bệnh đái tháo đường đã được biết rõ, và những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra vai trò của nó trong tăng tính thấm mạch máu võng mạc. Bất thường màng đáy mạch máu xảy ra do mất cân bằng quá trình tổng hợp và giáng hoá các thành phần màng đáy. Trong bệnh võng mạc đái tháo đường, quá trình tổng hợp tăng đáng kể so với quá trình giáng hoá các thành phần ngoại bào dẫn đến lắng đọng các thành phần màng đáy, từ đó gây dày màng đáy. Mặc dù LOX được xem như 1 enzym ngoại bào, các nghiên cứu cũng phát hiện LOX ở bên trong nhân và bào tương. Vì LOX trưởng thành di chuyển từ ngoài tế bào vào trong tế bào, nên trong nghiên cứu này chúng tôi đánh giá liệu môi trường nồng độ glucose cao có làm rối loạn quá trình này thông qua việc tăng kết dính giữa LOX với protein chất nền ngoại bào. Phát hiện từ nghiên cứu chỉ ra rằng môi trường nồng độ glucose cao kích thích kết dính giữa LOX với protein chất nền ngoại bào (FN và Coll IV) bên ngoài tế bào và làm giảm lượng LOX trong tế bào. Điều này tạo nên tín hiệu ngược gây tăng sản sinh LOX dẫn đến tăng hàm lượng LOX gặp trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Đây là nghiên cứu đầu tiên chỉ ra cơ chế gây tăng lượng LOX trong các tế bào nội mô mao mạch võng mạc do môi trường nồng độ glucose cao. 23 KẾT LUẬN 1. Sự thay đổi mức độ biểu hiện của LOX tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường nồng độ glucose cao. Hàm lượng LOX trong protein toàn phần và protein chất nền ngoại bào tăng (145±10% nhóm đối chứng và 154±9% nhóm đối chứng, tương ứng), trong khi hàm lượng LOX trong tế bào giảm (62 ± 9% nhóm đối chứng). Hàm lượng LOX trong môi trường nuôi cấy tế bào có sự biến thiên theo thời gian. LOX tăng nhẹ trong môi trường nồng độ glucose cao 1 ngày (124±8% nhóm đối chứng) và 5 ngày (117±6% nhóm đối chứng), tăng đáng kể trong môi trường glucose cao 3 ngày (158±11% nhóm đối chứng) và giảm trong môi trường glucose cao 7 ngày (78±5% của nhóm đối chứng). Hàm lượng LOX trở về gần mức bình thường (116 ± 13% nhóm đối chứng) khi môi trường glucose cao được ủ thêm LOXsiRNA. Mật độ LOX trong protein toàn phần và protein chất nền ngoại bào tăng (179±7% nhóm đối chứng và 160 ± 7% nhóm đối chứng, tương ứng). Mật độ LOX được điều chỉnh (114 ± 6% nhóm đối chứng) khi môi trường glucose cao được ủ thêm LOXsiRNA. Hoạt động LOX tăng rõ rệt trong môi trường nồng độ glucose cao (153±15% nhóm đối chứng). Hoạt động LOX được điều hoà (120 ± 9% nhóm đối chứng) khi môi trường glucose cao được ủ thêm BAPN. Độ thẩm thấu tế bào tăng mạnh trong môi trường nồng độ glucose cao (299±18% nhóm đối chứng) và giảm khi môi trường được ủ thêm LOXsiRNA (114± 8% nhóm đối chứng) hoặc BAPN (132±14% nhóm đối chứng) Hiện tượng chết tế bào theo chương trình tăng rõ rệt trong môi trường glucose cao so với môi trường bình thường (4.68 ± 0.9 tế bào 24 chết/1000 tế bào và 1.48 ± 0.32 tế bào chết/1000 tế bào, tương ứng) và giảm đáng kể khi tế bào được ủ với LOXsiRNA (2.78 ± 0.37 tế bào chết/1000 tế bào) và BAPN (2.85 ± 0.34 tế bào chết/1000 tế bào). 2. Sự thay đổi mức độ bám dính của LOX với protein chất nền ngoại bào tại tế bào nội mô mạch máu võng mạc chuột trong môi trường glucose cao. Hàm lượng LOX liên kết với Coll IV và FN tăng đáng kể trong protein toàn phần (144±12% nhóm đối chứng và 168±11% nhóm đối chứng, tương ứng) và protein chất nền ngoại bào (138±20% nhóm đối chứng và 156±21% nhóm đối chứng, tương ứng). Mật độ LOX liên kết với Coll IV và FN tăng rõ rệt trong protein toàn phần (192±21% nhóm đối chứng và 183±19% nhóm đối chứng, tương ứng) và protein chất nền ngoại bào (143±10% nhóm đối chứng và 158±15% nhóm đối chứng, tương ứng). HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Những nghiên cứu tiếp theo cần được tiến hành để hiểu thêm về cơ chế mối liên quan giữa các thành phần màng đáy với LOX và ảnh hưởng của nó tới tính thấm mạch máu liên quan đến phá vỡ hàng rào mạch máu võng mạc trong bệnh võng mạc đái tháo đường. Đặc biệt là, cần thực hiện những nghiên cứu đánh giá hiệu quả lâu dài của giảm nồng độ LOX trong ngăn ngừa các tổn thương mạch máu võng mạc do đái tháo đường trên động vật và con người từ đó mở ra những phương pháp mới tiềm năng trong dự phòng và điều trị bệnh võng mạc đái tháo đường. 25 B. TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾNG ANH INTRODUCTION 2. Background Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness in the working age population. Studies have shown that retinal vascular basement membrane thickening is a histologic hallmark of diabetic retinopathy and can promote vascular cell loss. Moreover, overexpression of basement membrane components and subsequent thickening of the BM has been shown to be closely associated with the development of compromised blood-retinal barrier. Although histologic and functional changes that accompany diabetic microangiopathy have been well documented, specific intracellular and extracellular mechanisms pertaining to these changes that lead progressively to dysfunction of vessels as seen in diabetic retinopathy remain unclear. Lysyl oxidase (LOX) is an extracellular enzyme that plays a critical role in the development, maturation, and functionality of the vascular BM. Study of Song indicated that LOX is upregulated in retinas of diabetic rats and downregulation of LOX helps protect against retinal damage due to diabetes. Furthermore, LOX expression is regulated by hypoxia-inducible factors (HIFs), a key player in promoting retinal neovascularization in advanced diabetic retinopathy. Recent study on vitreous samples of diabetic patients expressed LOX overexpression compared to normal people. However, the mechanism of these disorders and LOX changes in the cells are unknown. Therefore, we conducted the study "Research on Lysyl oxidase changes of retinal vascular endothelial cells under high glucose condition" with 2 purposes: 1. Assess LOX expression changes of rat retinal endothelial cells under high glucose condition. 2. Analyze the change of LOX binding with extracelluar matrix proteins in rat retinal endothelial cells under high glucose condition. 26 2. New discoveries of the study: - This is the first study which completely analyzed the changes of LOX and associated disorders in rat retinal endothelial cells under high glucose condition. - This study indicated that LOX was upregulated in total protein, extracellular matrix protein, while LOX internalization reduced and LOX in the media changed over time in rat retinal endothelial cells under high glucose condition. - The change of LOX results in increasing cell permeability and promoting apoptosis. LOX inhibitors such as LOXsiRNA and BAPN help prevent those damages. - This study also indicated that the mechanism of these changes is the increase of LOX bound to extracellular matrix protein. High glucose condition enhances the binding of LOX and extracellular matrix protein and reduces LOX internalization. This causes negative feedback and results in LOX overexpression. These findings help improve the knowledge of the pathogenesis of diabetic retinopathy and suggest future study on detection and early treatment of this disease. 3. Thesis layout: The thesis has 102 pages, including Background (2 pages), 4 chapters: Chapter 1: Overview (27 pages), Chapter 2: Objects and methodology (23 pages), Chapter 3: Results (27 pages), Chapter 4: Discussion (21 pages), and Conclusion (2 pages). There are also: references, 15 appendices, tables, charts, images that illustrate the results of experiments. 27 CHAPTER 1: OVERVIEW 1.1. Histological features of retinal capillary Capillary wall is thin and has three layers including endothelial cells, basement membrane and pericytes. 1.1.1. Endothelial cells Endothelial cells form a single cell layer on the inner walls of the capillary. Endothelial cells connect each other through gap junctions. 1.1.2. Basement membrane Basement membrane is a thin layer with the thickness of 50nm, between endothelial cell layer and pericyte layer. Basement membrane includes extracellar matrix proteins arranged in a highly organized manner. Vascular basement membrane serves as a substratum for cell attachment, provides a selective permeability barrier, and regulates cell survival. The basement membrane consists of various components that participate in the construction of the intricate basement membrane architecture. Some of the major components are type IV collagen (coll IV), fibronectin (FN), laminin, and heparan sulfate proteoglycans. 1.1.3. Pericytes Pericytes are perivascular cells imbedded within the basement membrane of the endothelium of capillaries. 1.1.4. The changes of retinal cappillary in diabetic rats In general, rats have been routinely used in many in vivo studies since they are small in size and therefore easy to handle and inexpensive to house. They also have relatively short life span that allows a shorter experimental turnover time. More importantly, the availability of a collection of transgenic and knockout mice allows researchers to study the role of particular genes, which may even be cell type specific, in the development and pathophysiological progression of diabetic retinopathy. Indeed, mechanistic studies of diabetic retinopathy have been carried out extensively in rat as these models share similar symptoms of early diabetic retinopathy as in human. These damages include increased astrocyte and glial cell number, decreased retinal arteriorlar and venular blood flow rates, increased retinal vascular permeability, vascular leakage, acellular capillary and pericyte loss. 28 1.2. Pathogenesis of retinal vascular damage associated with hyperglycemia Figure 1. The pathogenesis of diabetic retinopathy 1.3. Lysyl oxidase Lysyl oxidase (LOX) is a crosslinking enzyme that plays a key role in the stability of connective tissue and vascular. Previous studies Mitochondrial dysfunction Gap junction damage Basement membrane thickening Apoptosis Acellular capillary Vascular leakage Diabetic retinopathy Diabetes Hyperglycemia 29 have shown the role of LOX in the changes of extracellular matrix result in fibrotic diseases in heart muscles, vascular, lung, skin, liver and diabetic nephropathy. 1.3.1. Structure LOX, also known as protein-lysine 6-oxidase, is an enzyme that is encoded by the LOX gene in 5q23.3-31.2. LOX is secreted as a 50 kDa, N-glycosylated proenzyme and then proteolytically cleaved to the catalytically active, mature enzyme (LOX 32 kDa) and LOX-propeptide 18 kDa (LOX-PP). Each member of the LOX family has a highly conserved carboxyl (C) terminal domain that contains a copper-binding motif, lysine tyrosylquinone residues and a cytokine receptor-like domain. 1.3.2. Location LOX expression has been identified in several tissues, including the skin, aorta, heart, lung, liver, cartilage, bone, kidney, retina, and brain. In the eye, LOX has been found in trabecular network, cilliary body, lens and retina. Mature LOX is secreted in extracellular environment and binds with extracellular matrix to form crosslinking. On the other hand, mature LOX has been shown to translocate from the extracellular environment into the cytosol and concentrate within the nucleus. 1.3.3. Function Many researches have shown the important role of LOX mediated crosslinking enzyme in integrity and function of tissue, especially vascular and connective tissue. LOX is also indicated to play an importance role in the stability and intergrity of basment membrane. Moreover, LOX promotes overexpression and secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF), therefore it may cause neovascularization. 1.4. Research situation in Vietnam and in the world Currently, in Vietnam, there are many researches on diabetic retinopathy, but most of them focus on epidemiology, clinical features and treatment. There are very few studies on pathogenesis of diabetic retinopathy and there is no study on the changes of LOX. In the world, there are some researches on the changes and effects of LOX in diabetes 30 and other diseases. According to the study of Erler, upregulation of LOX in several invasive cancers has provided additional support for the concept that a fibrotic matrix can be more permeable than a normal matrix. Research of Le Pape examining glomerular basement membrane collagen and LOX-mediated cross-links in experimental diabetes reported that the ratio of dihydroxylysinonorleucine to hydroxylysinonorleucine was increased, suggestive of altered cross- linking in diabetes. Electron microscopic investigation of Ortoland has revealed fine structural changes in the collagen fibrillar arrangement in diabetes. These differences included increased packing density of collagen fibrils, decreases in fibrillar diameter, and abnormal fibril morphology showing collagen fibrils that appeared twisted, curved, overlapping, and otherwise highly disorganized, suggestive of excess crosslinking that is known to tighten collagen fibrils. Diameter measurements on fibrils obtained during a time course of assembly have demonstrated that a fibril diameter distribution are dependent on late- stage assembly of fibrils that are in part regulated by LOX activity. Researches have shown that stabilization, fibril assembly, and polarity, essential components for functional integrity of the basement membrane, depend largely on proper cross-linking of collagen. Morphologic abnormalities of retinal capillary basement membrane of diabetic individuals appear to reflect a process of structural remodeling. These structural abnormalities may be the result of excessive cross- linking represented by the thickened retinal capillary basement membrane, one of the prominent characteristics of diabetic retinopathy. According to research of Rodriguez and Lucero, excess cross-linking mediated by LOX can lead to basement membrane thickening and compromised functionality due to the formation of disorganized assembly of the collagen fibrils, promoting abnormal extracellular matrix accumulation in fibrotic diseases. Although perhaps counter-intuitive, a study of Paszek have shown that an increase in stiffness of extracellular matrices can enhance cell migration through an ECM in part by altering integrin and cell surface receptor signaling complexes. Recently, our study indicated that LOX is upregulated in the retina of diabetic rats and LOX downregulation helps prevents diabetes-induced retinal vascular damage. However, the information associated with LOX expression, distribution and regulation in reti