Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính kháng viêm, kháng ung thư các hợp chất lai coxib – Combretastatin

y những hợp chất điều trị ung thư theo cơ chế này vẫn đang được ứng dụng rộng rãi và luôn là một hướng nghiên cứu nhận được nhiều sự quan tâm. - Tổng quan về các hợp chất combretastatin, thuộc lớp chất cis-stilben, một nguồn phong phú của các hợp chất dẫn đường trong việc tìm kiếm các loại thuốc mới, các hợp chất điển hình như resveratrol và combretastatin A-4 phosphat hiện đang được thử nghiệm để điều trị bệnh Alzheimer và ung thư trên lâm sàng. Các stilben mới được phân lập gần đây đã cho thấy có nhiều hoạt tính sinh học đa dạng, bao gồm tính chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống sốt rét, gây độc tế bào, bảo vệ gan và chống viêm. Combretastatin A-4 (CA4) cũng được xem là tác nhân gây độc tế bào tiềm năng do ức chế mạnh sự trùng hợp vi ống bằng cách gắn vào điểm gắn kết của colchicin trên tubulin. CA-4 có độc tính cao trên nhiều mô hình tế bào ung thư, do vậy nó là một cấu trúc mục tiêu hiện đang rất được quan tâm. - Tổng quan về Pyrazol là các dị vòng có năm cạnh tạo thành một nhóm các hợp chất đặc biệt hữu ích trong tổng hợp hữu cơ. Chúng là một trong những nhóm hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất trong họ azol. Pyrazol được báo cáo qua các tài liệu hiện có và SAR cho thấy, nó là cần thiết cho việc thiết kế các chất ức chế chọn lọc COX2. Một trong các hợp chất quan trọng và thông dụng 4 nhất trong các hợp chát pyrazole được ứng dụng trong thương mại đó là celecoxib, một chất được biết đến với hoạt tính kháng viêm mạnh, là thuốc ức chế chọn lọc COX2 thông qua hoạt động của prostaglandin gây ra trong quá trình viêm và đau mà không tác dụng lên các prostaglandin COX1 có tác dụng bảo vệ đường tiêu hóa. Hơn nữa Celecoxib ức chế cả sự tăng sinh trên mô hình in vitro tế bào ung thư vú ở người như MCF7 và MDAMB-231. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng celecoxib và các hợp chất liên quan có thể gây ra sự bắt giữ chu kỳ tế bào ở giai đoạn G0 /G1 dẫn đến tế bào chết theo chu trình apotosis, ức chế sự phát triển của khối u và ngăn chặn sự hình thành mạch của khối u khi không có sự hiện diện của COX2 Qua đó có thể thấy các hợp chất lai hóa combretastatin celecoxib là những lớp chất đầy hứa hẹn vẫn còn mới về mặt phát triển cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học góp phần xây dựng chung cho những công trình nghiên cứu mới tìm kiếm các loại thuốc kháng ung thư trong ngành hóa dược. 5 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị 2.1.1. Hóa chất và dung môi 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu 2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ 2.2.3. Phương pháp thử hoạt tính sinh học 2.3. Tổng hợp các hợp chất lai coxib- combrestatin 2.3.1. Tổng hợp các dẫn chất este của chất lai este coxib - combretastatin Hình 2.2. Tổng hợp dẫn chất este của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin (i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1 mmol, 1 eq) (77), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan; phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78). Tổng hợp được 20 chất lai dang lai hóa dạng este của coxib - combretastatin là các chất từ 79 đến 98. 2.3.2. Tổng hợp hợp chất lai coxib - combrestastatin chứa nhóm CF3 Hình 2.5. Tổng hợp hợp lai hóa coxib - combretastatin chứa nhóm CF3 (a) 100 (1.0 mmol), 99 etyl trifluoroacetat (1,2 eq) và NaH (2,5 eq) trong THF (5 mL), 6 h. (b), EtOH (5 mL), axit (1.0 eq); arylhydrazin hydrochlorid 78 (1.0 mmol) được thêm liên tiếp vào cặn và hồi lưu trong 6 giờ. Chất 102 được phân lập qua sắc ký cột. 6 2.3.3. Tổng hợp các dẫn chất axit của hợp chất lai hóa coxib - combrestatin Hình 2.8. Tổng hợp khung lai ghép combretastatin và coxib dạng axit (i) Kiềm: t-BuOLi (3 mmol, 3 eq), đun hồi lưu, (ii) Ethyl chlorooxoacetate (1 mmol, 1 eq), 5 ml THF; (iii) HCl (4 mmol); đun hồi lưu, 5 ml C2H5OH khan; phenylhydrazin (1 mmol, 1 eq) (78). Sản phẩm thu được sau phân lập qua sắc ký cột được hòa tan trong hệ dung môi THF/MeOH/H2O = 3:1:1, sau đó NaH (1,2 eq) được thêm vào hỗn hợp. Thực hiện phản ứng trong 3h thu được chất lai hóa dạng axit 103-122. Tổng thành công 20 chất lai dang lai hóa dạng axit của combretastatin-coxib là các chất từ 103-122 2.5. Thử nghiệm hoạt tính sinh học các hợp chất nghiên cứu Các hợp chất đã tổng hợp được tiến hành sàng lọc hoạt tính kháng ung thư vú MCF7, ung thư đại tràng HT-29, ung thư biểu mô gan Hep-G2 và ức chế sản sinh NO. 7 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Những ưu điểm của việc sử dụng một phân tử lai so với việc đồng thời kết hợp nhiều loại thuốc riêng lẻ có thể cải thiện các hạn chế về phản ứng phụ và sự kháng thuốc [107]. Tuy có hoạt tính nổi trội, nhưng combretastatin vẫn còn nhiều những tác dụng không mong muốn. Đây là lý do nhóm nghiên cứu đặt mục tiêu kết hợp combretastatin, một hợp chất kháng ung thư, và celecoxib, một chất kháng viêm theo cơ chế COX2, là các chất bắt nguồn cho các hợp chất lai mới với hy vọng tìm ra những chất mang các đặc điểm hoạt tính sinh học lý thú như kháng ung thư và kháng viêm của chất gốc đồng thời ít gây tác dụng phụ. 3.1. Thiết kế cấu trúc và hoạt tính sinh học của phân tử lai 3.1.1. Thiết kế cấu trúc phân tử lai Nghiên cứu đã áp dụng chiến lược lai ghép để lai hóa các nhóm dược lý quan trọng của hai hợp chất gốc celecoxib và CA4 trong một phân tử duy nhất. Vòng pyrazole được thay thế bởi 1,2-diphenyl của khung celecoxib như một cấu trúc tương tự như cis-1,2-diphenylethylene trong CA4. Sự thay thế liên kết đôi bằng vòng 5 đã được khẳng định về mặt hoạt tính gây độc tế bào và ức chế tubulin [108]. Các hợp chất bị khóa dạng cấu hình cis này thể hiện một số lợi ích như ngăn chặn quá trình đồng phân hóa từ dạng cis thành trans, giúp tăng độ đặc hiệu của hoạt chất này với các mục tiêu tế bào và cải thiện tiềm năng điều trị của nó. Sự hiện diện của các nhóm trimethoxybenzene của CA4 cũng là cần thiết cho hoạt tính độc tế bào [76]. Chúng tôi đặc biệt quan tâm đến việc duy trì nhóm sulfonamid hoặc các đặc điểm liên quan đến celecoxib vì điều này dường như dẫn đến việc bảo tồn được tính chọn lọc COX2 của chất lai thu được [109]. Tác dụng ức chế COX2 nếu có sẽ góp phần vào tổng thể hoạt động chống khối u của các phân tử lai mới. 8 Hình 3.1. Cấu trúc của celecoxib, Combretastatin A4 và hợp chất lai combretastatin – coxib 3.1.2. Thiết kế hoạt tính sinh học phân tử lai Tác dụng gây độc tế bào của những hợp chất này chống lại ba dòng thế bào ung thư ở người HT-29, Hep-G2, MCF-7 cũng như ức chế sản sinh NO bằng cách kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) tế bào đại thực bào RAW 264.7. Vai trò của NO trong khối u rất phức tạp, nó có vai trò kích thích hoặc ức chế quá trình tế bào tùy thuộc vào điều kiện, vì vậy sự ức chế sản sinh NO không liên quan trực tiếp đến độc tính tế bào. Nhưng NO thể hiện một loạt các đặc tính dược lý có ích tương tự như prostaglandin trên hệ tim mạch bao gồm sự giãn mạch, sự ức chế kết tập tiểu cầu và sự điều hòa các mảng bám của bạch cầu vào thành mạch [110]. Hơn nữa, việc sử dụng celecoxib trong phòng chống ung thư vú và các khối u ác tính đã bị hạn chế bởi các tác dụng phụ của nó, đặc biệt là nguy cơ biến chứng của tim mạch liên quan chủ yếu đến khả năng giảm sản sinh prostacyclin PGI2 [111]. Nhờ đó có thể thấy sự duy trì sản sinh NO cùng với những đặc tính ức chế COX2 của celecoxib có thể giúp tránh nguy cơ biến chứng tim mạch, do vậy một chiến lược nhằm thiết kế một loạt phân tử đa 9 đích bằng cách kết hợp ức chế chọn lọc COX2 với các hoạt động phụ thuộc nitric oxide (NO) đã được triển khai [112-114]. Trong quá trình viêm nhiễm, các tế bào miễn dịch được kích hoạt như đại thực bào tiết ra một số chất trung gian gây viêm như cytokine tiền viêm, oxit nitric (NO) và prostaglandin E2 (PGE2). Hơn nữa, có một mối liên quan rõ ràng giữa mức độ prostaglandin trong các khối u vú ở người với sự phát triển của di căn và khả năng sống sót [115]. Prostaglandin E2 tồn tại với nồng độ cao trong các khối u vú và ở những thể trạng ung thư di căn, khi thiếu thụ thể estrogen và progesterone [116-117]. Do đó, khả năng ức chế sản xuất PGE2 có thể được coi là một chiến lược tốt trong việc thiết kế các chất chống ung thư. Tuy nhiên, các tế bào ung thư vú MCF7 sản sinh mức PGE2 rất thấp theo báo cáo khác [109]. Do đó, hiệu lực hoạt tính của các hợp chất lai đã được thử nghiệm đáp ứng viêm gây ra bởi LPS thay bằng ức chế PGE2 trên MCF7 [118]. Do vậy, các dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF-7 và khả năng ức chế sản sinh NO được lựa chọn là các công cụ bước đầu sàng lọc hoạt tính kháng viêm của lớp chất nghiên cứu. Và để xác định được cơ chế kháng viêm và kháng ung thư của các chất lai, nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2, các phương pháp phân tích chu kỳ tế bào, các phương pháp nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3, nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phương pháp trắc lưu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI. Sau cùng, các chất đã được chọn lọc và nghiên cứu cơ chế sinh học sẽ được thử nghiệm tương tác với các đích tác dụng tubulin và COX2 bằng phương pháp docking phân tử để khẳng định độ chính xác hoạt tính sinh học của mô hình in vitro. 3.2. Tổng hợp các hợp chất lai coxib - combretastatin 10 Phương pháp một bình phản ứng đã được áp dụng để điều chế các dẫn chất etyl 1,4,5-triaryl-1H pyrazole-3-cacboxylat từ ethyl oxalyl chlorid, 1,2- diarylethanon và ethyl oxalyl chlorid arylhydrazin hydrochlorid (Hình 2.1, Hình 2.2, Hình 2.7, Hình 2.8) [109]. Phản ứng ngưng tụ Claisen giữa hai thành phần 1,2-diarylethanon và ethyl oxalyl chloride với tác nhân kiềm sử dụng là tert-BuOLi, thu được sản phẩm trung gian muối lithium của ethyl 2,4-dioxo- 3,4-diarylbutanoat, phản ứng được tiếp tục với arylhydrazin hydrochlorid thông qua phản ứng Knorr được xúc tác bởi axit clohydric để tạo ra triarylpyrazole-3- cacboxylat (hợp chất lai 79 đến 98) và (hợp chất lai 103 đến 122). Một chu trình điều chế dạng dẫn chất của celecoxib cũng được áp dụng (Hình 2.4, Hình 2.5) 3,4,5-trimethoxyphenyl - 1,1,1-trifluoro-2,4-butanedion (43, 102) thu được từ sự ngưng tụ Claisen giữa các dẫn xuất acetophenon và etyl trifluoroacetat sau đó tiếp tục phản ứng với muối halogenua 4-sulfamidophenyl hydrazin để tạo thành 3,4,5-trimethoxyphenyl, một chất có cấu trúc tương tự celecoxib. Theo các quy trình phản ứng được mô tả trong Hình 2.1, Hình 2.2, 20 hợp chất lai coxib - combretastatin –đã được tổng hợp thành công với hiệu suất từ 64 – 83% (Bảng 3.1) 02 hợp chất chứa nhóm CF3 với hiệu suất lần lượt là 95%. 78% (bảng 3.2). 20 hợp chất dạng axit của chất lai coxib - combretastatin với hiệu suất từ 54 – 74 % ( bảng 3.3); các chất được xác định cấu trúc bằng các phương pháp tinh chế và phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 1D, 2D. Trong số các hợp chất lai thu được, các chất 79 đến 98 và 102 đến 122 lần đầu tiên được tổng hợp và chưa từng được công bố trước đây. Và 01 hợp chất đã được công bố và cũng được dùng như một chất so sánh là celecoxib (43) được biết đến với nhiều công trình nghiên cứu [78-79]. 3.3. Hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin 11 3.3.1. Sàng lọc hoạt tính sinh học các hợp chất lai coxib - combretastatin Sàng lọc hoạt tính của 20 hợp chất lai hóa coxib - combretastatin dạng este và 02 chất lai chứa nhóm CF3 Độc tính tế bào của 20 hợp chất lai hóa coxib dạng este và 02 hợp chất chứa nhóm CF3 đã được đánh giá về tỷ lệ ức chế sự phát triển tế bào trên ba dòng HT-29, Hep-G2 và MCF-7 bằng phương pháp được phát triển bởi Monks và cộng sự [120]. Kết quả được tóm tắt trong Bảng 3.4 theo hoạt tính giảm dần. Các hoạt tính chống tăng sinh của celecoxib thể hiện trên các tế bào ung thư ở người như ung thư vú (MCF-7), ung thư gan (Hep-G2) ung thư trực tràng (HT- 29) đã được công bố [121-123]. Trong phạm vi công trình nghiên cứu này 12 hợp chất lai hóa mới 102, 96, 81, 82, 94, 93, 91, 92, 89, 90, 97, 85 thể hiện độc tính tế bào trên các dòng MCF-7 mạnh hơn celecoxib và năm hợp chất 102, 96, 81, 82, 94 có IC50 < 10 µM. Trong đó một số các hợp chất như 102, 96, 94, 93 và 97 cũng có độc tính Hep-G2 tương đương với chất gốc celecoxib (65). Hơn nữa, 05 hợp chất lai 96, 94, 90, 97, 80 cho thấy khả năng chống lại tế bào HT- 29 mạnh hơn 3-6 lần so với chất gốc celecoxib và hợp chất 90 có IC50 10 µM. Qua đó có thể khẳng định, sự hiện diện của các nhóm thế chứa nitơ, halogen tại vị trí para- của cả hai vòng phenyl liền kề 96, 93, 91, 92, 97 góp phần làm tăng độc tính tế bào. Hợp chất 102 mang đầy đủ các đặc điểm cấu trúc của khung celecoxib và CA4 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào nổi trội với dòng MCF-7. 21 hợp chất và celecoxib (65) cũng được thử tác dụng ức chế oxit nitric (NO) khi kích hoạt lipopolysaccharide (LPS) trên đại thực bào RAW 264.7 [124]. Điều thú vị là, ngoại trừ các hợp chất 102 và 98 có hoạt tính kép mạnh nổi trội đối với việc ức chế sản xuất NO cũng như hoạt động gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF-7, các hợp chất khác trong nhóm này thể hiện hoạt động ức 12 chế sản xuất NO yếu hơn , nhấn mạnh rằng chúng có thể có tính an toàn tốt hơn trên hệ thống tim mạch so với celecoxib [110]. Bảng 3.4. Tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng este đối với ba dòng tế bào ung thư HT-29, Hep-G2, MCF7 và ức chế sản xuất NO STT Hợp chất R R’ R’’ IC50 (µM) Ức chế sản xuất NO HT-29 Hep-G2 MCF-7 1 102 3,4,5- triOMe 4-NH2SO2 1.95±0.11 43.0 ± 6.0 39.96± 3.36 4.63± 0.59 2 96 H 4-F 4-NH2SO2 81.6 ± 10.6 18.7 ± 1.7 29.37± 1.90 7.97±0.51 3 81 H H 4-CN 116.83±7.7 37.6±3.5 >254 8.20± 0.93 4 82 H H 4-NO2 129.88±15.7 21.2±2.1 >242 9.67± 0.92 5 94 H 4-OH 4-NH2SO2 92.3 ± 7.2 18.8 ± 1.5 14.51±1.36 8.90± 0.79 6 93 H 4-Br 4-NH2SO2 73.7 ± 2.6 23.5 ± 1.8 35.48±2.85 19.27±0.27 7 91 H 4-Br 4-CN 116.01±13.6 32.6± 3.0 >211 20.16± 1.83 8 92 H 4-Br 4-NO2 91.58±7.8 153.2± 10 >203 21.30± 1.40 9 89 H 4-Br 4-OMe 21.01±4.3 39.6±2.9 >209 21.51± 1.48 10 90 H 4-Br 4-CF3 > 233 10.0±0.7 75.87±4.41 21.65± 1.86 11 97 H 4-Cl 4-NH2SO2 122.2 ± 9.7 14.1 ± 1 37.04±4.95 23.79± 3.11 12 85 4-OMe 4-OMe 4-CF3 134.10±15.7 107± 10 >201 29.80± 2.71 13 43 4-Me 4-NH2SO2 83.59 ± 5.0 58.4 ± 3.4 37.11±2.14 30.67±3.79 14 98 H 4,6- diOMe 4-NH2SO2 4.41±0.17 136.0 ± 12 >197 39.93± 2.64 15 83 H H 4-NH2SO2 > 233 100 ± 10 54.35±4.57 40.54±2.56 13 Bảng 3.5. So sánh tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất lai hóa dạng axit và dạng este đối với tế bào ung thư MCF-7 và ức chế sản xuất NO 16 79 H H 4-OMe 30.0±13.4 >251 21.43±1.93 43.19±4.86 17 87 4-OMe 4-OMe 4-NO2 148.85±8.4 >211 >211 48.81± 2.62 18 86 4-OMe 4-OMe 4-CN 76.42±9.4 110.3±7.0 >220 48.86± 3.13 19 84 4-OMe 4-OMe 4-OMe 67.06±3.7 160±15 >218 49.32± 1.72 20 80 H H 4-CF3 59.52±5.5 17.3±2.0 63.17± 3.01 50.66± 4.46 21 88 4-OMe 4-OMe 4-NH2SO2 103.4 ±10.5 99.0±6.3 58.57± 4.70 68.43± 7.05 22 98 H 4,6-diOH 4-NH2SO2 > 208.5 173.9 ± 12 64.03± 5.75 83.60± 3.44 L-NMMA 8.39±0.31 Ellipticine 0.18± 0.04 0.44± 0.05 0.36± 0.04 STT R R’ R’’ IC50 (µM) Este (NO) Acid (NO) Este (MCF-7) Acid (MCF7) 1 3,4,5-triOMe 4-NH2SO2 1.95±0.11 43.0 ± 6.0 39.96± 3.36 4.63± 0.59 2 H 4-F 4-NH2SO2 81.6 ± 10.6 194.5±7.6 7.97±0.51 187.7±9.5 3 H H 4-CN 116.83±7.7 256.7±22.1 8.20± 0.93 154.5±15.1 4 H H 4-NO2 129.88±15.7 >261.1 9.67± 0.92 187.6±10.4 5 H 4-OH 4-NH2SO2 92.3 ± 7.2 75.8±2.6 8.90± 0.79 34.6±2.6 6 H 4-Br 4-NH2SO2 73.7 ± 2.6 >202.0 19.27±0.27 149.5±7.3 7 H 4-Br 4-CN 116.01±13.6 97.9±9.4 20.16± 1.83 70.1± 4.6 8 H 4-Br 4-NO2 91.58±7.8 111.2±8.7 21.30± 1.40 34.0±6.4 9 H 4-Br 4-OMe 21.01±4.3 >223.7 21.51± 1.48 >223.7 14 Ghi chú: * : Cột thống kê hoạt tính các chất este **: Cột thống kê hoạt tính các chất axit Các hợp chất lai 102, 96, 81, 82, 94 và celecoxib thể hiện hoạt tính vượt trội tiếp tục được chuyển sang thử nghiệm về sản sinh PGE2 nhằm sàng lọc kỹ hơn về hoạt tính kháng viêm lẫn kháng ung thư của hoạt chất. 3.3.2. Nghiên cứu cơ chế kháng viêm và kháng ung thư 3.3.2.1. Nghiên cứu hoạt tính ức chế sản sinh PGE2 Các hợp chất tiêu biểu là 102, 96, 81, 82, 94, celecoxib tiếp tục được thử nghiệm về khả năng ức chế sản sinh PGE2. 10 H 4-Br 4-CF3 > 233 80.0±6.3 21.65± 1.86 129.5±9.7 11 H 4-Cl 4-NH2SO2 122.2 ± 9.7 >220.7 23.79± 3.11 191.1±20.6 12 4-OMe 4-OMe 4-CF3 134.10±15.7 140.3±16.7 29.80± 2.71 136.0±8.4 13 4-Me 4-NH2SO2 83.59 ± 5.0 30.67±3.79 30.0±3.3 14 H 4,6- diOMe 4-NH2SO2 4.41±0.17 >208.7 39.93± 2.64 94.0±6.4 15 H H 4-NH2SO2 > 233 >239.8 40.54±2.56 178.9±12.9 16 H H 4-OMe 30.0±13.4 >271.7 43.19±4.86 209.3 ± 20.0 17 4-OMe 4-OMe 4-NO2 148.85±8.4 185.9±9.8 48.81± 2.62 31.8±3.7 18 4-OMe 4-OMe 4-CN 76.42±9.4 157.0±12.2 48.86± 3.13 83.0±10.3 19 4-OMe 4-OMe 4-OMe 67.06±3.7 145.7±15.2 49.32± 1.72 75.7±6.9 20 H H 4-CF3 59.52±5.5 109.4±5.8 50.66± 4.46 203.8 ± 5.1 21 4-OMe 4-OMe 4-NH2SO2 103.4 ±10.5 >209 68.43± 7.05 150.0±14.7 22 H 4,6-diOH 4-NH2SO2 > 208.5 >222.0 83.60± 3.44 >222.0 L-NMMA 8.39±0.31 Ellipticine 0.36± 0.04 15 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các hợp chất thử nghiệm đến việc sản xuất PEG2 trong các đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS PGE2 (pg/ml) Nồng độ (µM) 102 96 81 82 94 Nồng độ (µM) Celecoxib (43) 20 65.31 223.82 253.60 155.07 246.88 100 41.45 4 133.59 326.20 277.23 383.49 488.82 20 129.83 0.8 225.56 399.56 490.73 478.52 560.34 4 278.64 LPS 329.60 3.3.2.2. Phân tích chu kỳ tế bào Hợp chất 96, 81, 82 và 94 gây ra sự tăng số lượng tế bào trong pha G0 /G1 và giảm số lượng ở pha S và G2 /M tương tự như celecoxib. Celecoxib và các hợp chất liên quan cũng được biết là có khả năng ức chế sự phát triển của khối u và tạo ra quá trình apoptosis. Sự bắt giữ tế bào ở pha G0 /G1 của celecoxib cũng được xác định là không có sự tham gia của COX2 cũng như của PGE2 [104]. Mặt khác, hợp chất 102 tạo ra sự bắt giữ tế bào tại pha G2 M đồng thời giảm tế bào trong các pha S. Việc bắt giữ tế bào tại Pha G2 /M dẫn đến ngăn cản tế bào thoát khỏi quá trình nguyên phân, tính năng này được thể hiện bởi các tác nhân ức chế vi ống giống colchicin hoặc combretastatin [78]. Trong trường hợp hợp chất 102, thay thế liên kết đôi của CA4 với vòng pyrazol của celecoxib mà vẫn duy trì gốc trimethoxybenzen của CA4 chỉ ra là rất quan trọng để thu được các tính năng gây độc tế bào và kháng phân bào của chất gốc [98, 115]. Bảng 3.8. Phần trăm tế bào theo pha của các hợp chất được thử nghiệm với MCF7 STT Hợp chất Phần trăm tế bào theo phase (%) % G0/G1 % S % G2/M 1 Negative control (DMSO 0,5%) 42.46 40.47 13.15 2 102 (10 µM) 40.72 35.09 21.04 3 96 (10 µM) 49.00 34.17 14.17 4 81 (10 µM) 45.22 34.46 17.45 5 82 (10 µM) 50.96 30.75 14.80 6 94 (10 µM) 49.55 34.50 14.34 7 Celecoxib (30 µM) 46.80 36.69 11.45 16 Đối chứng 102 96 81 82 94 Celecoxib (43) Hình 3.3. Phân tích chu kỳ tế bào của các hợp chất được thử nghiệm bao gồm 102, 96, 81, 82, 94 và Celecoxib (43) tại nồng độ 10 µM trên MCF-7 3.3.2.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hai chất 82 và 102 Vì hai hợp chất 102 và 82 là các chất ức chế hoạt động chống tăng sinh tiềm năng, ức chế sản sinh PGE2 mạnh hơn celecoxib và ức chế chu kỳ tế bào một cách có chọn lọc do vậy nó được chọn để đánh giá thêm khả năng gây apoptosis. 17 Nghiên cứu hoạt tính gây apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342 Bảng 3. 9. Phần trăm sự ngưng tụ hoặc phân mảnh của nhân tế bào do hợp chất 102 và 82 gây ra Tế bào Apoptosis (%) 82 (20 µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) 102 (20 µM) 102 (10 µM) 102 (5 µM) Camptotheci n (5µM) (-) Đối chứng 5.33 ± 0.34 2.69± 0.22 2.42± 0.27 12.38± 0.96 5.18± 0.33 3.55± 0.39 22.71± 2.01 2.71± 0.29 Các mẫu nghiên cứu thu được Hình ảnh tế bào MCF7 sau khi được nhuộm Hoechst 33342 ở các nồng độ khác nhau: Đối chứng âm Camptothecin (5 µM) 102 (20 µM) 102 (10 µM) 82 (20 µM) 82 (10 µM) 18 Hình 3.4. Hình ảnh tế bào MCF7 dưới tác động của các mẫu nghiên cứu được nhuộm Hoechst 33342 ở các nồng độ khác nhau Nghiên cứu hoạt tính gây apotosis bằng chỉ thị caspase ‑ 3 Bảng 3.10. Hoạt tính caspase - 3 của 102 và 82 % Tế bào Apoptosis Hợp chất 102 (20 µM) 102 (10 µM) 102 (5 µM) 82 (20µM) 82 (10 µM) 82 (5 µM) Camptothecin (5µM) (-) Đối chứng Giá trị 1.36* 1.21* 1.01 1.08 1.12 1.11 1.67** 1.00 Độ lệch 0.033 0.013 0.037 0.023 0.056 0.040 0.020 0.070 - * P<0.05 and ** P<0.01 Nghiên cứu cảm ứng apoptosis bằng phƣơng pháp trắc lƣu tế bào nhuộm FITC-anexin V và PI Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào apoptosis Mẫu thí nghiệm % tế bào hoại tử % tế bào apoptosis sớm % tế bào apoptosis muộn % tế bào apoptosis ĐC âm 0.22 18.32 1.90 20.22 82 (20 µM) 1.39 18.49 4.08 22.57 82 (10 µM) 0.27 21.62 4.59 26.21 82 (5 µM) 0.16 22.74 3.27 26.01 102 (20 µM) 0.42 42.24 6.73 48.97* 102 (10 µM) 0.49 19.90 3.45 23.35 102 (5 µM) 0.27 15.84 2.17 18.01 Camptothecin (5µM) 0.08 73.83 4.96 78.79** Ghi chú: * là P<0.05; ** là P<0.01 Tế bào ủ với mẫu 82 (20 Tế bào ủ với mẫu 82 Tế bào ủ với mẫu 82 19 µg/ml) trong 48h (10 µg/ml) trong 48h (5 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 102 (20 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 102 (10 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với mẫu 102 (5 µg/ml) trong 48h Tế bào ủ với 0.5% DMSO trong 48h Tế bào ủ với 5 µM Camptothecin trong 48h Hình 3.5. Tác động của mẫu nghiên cứu đến quá trình apoptosis tế bào thông qua Alexa Fluor® 488 annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Các mẫu thử được phân tích bằng hệ thống trắc lưu tế bào. Trục x thể hiện mức độ nhuộm mầu FITC-Anexin V, trục y thể hiện mức độ nhuộm mầu PI theo đơn vị Log. Phần kết luận xác định khả năng cảm ứng apoptosis của 2 mẫu nghiên cứu Qua việc xác định cảm ứng apoptosis qua ba phương pháp phát hiện apoptosis của hoạt chất nhờ nhuộm nhân tế bào với Hoechst 33342, caspase - 3 và trắc lưu tế bào có thể tổng kết: 20  Mẫu 82 ở các nồng độ thử nghiệm làm tăng nhẹ tỉ lệ tế bào ở giai đoạn apoptosis sớm và apoptosis muộn so với đối chứng âm, đạt từ 22.57- 26.21%.  Mẫu 102, ở nồng độ 20 µg/ml làm tăng cao tỉ lệ tế bào ở giai đoạn apoptosis sớm và muộn so với đối chứng âm từ 18.3% đến 42.2% và 1.90% đến 6.7%, một cách tương ứng. Ở nồng độ thấp hơn làm tăng nhẹ (10 µg/ml và 5µg/ml) tỉ lệ tế bào apoptosis so với đối chứng âm.  Camptothecin - đối chứng dương tăng tỷ lệ tế bào apoptosis, đạt từ 78.79%.  Mẫu 82 chưa thể hiện rõ khả năng cảm ứng apoptosis với các nồng độ nghiên cứu trong các thử nghiệm được thực hiện;  Mẫu 102 ở nồng độ 10 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào MCF7 thông qua cảm ứng sinh caspase 3 với hàm lượng tăng 1.21 lần so với đối chứng âm (P<0.05);  Mẫu 102 ở nồng độ 20 µM có khả năng cảm ứng apoptosis trên tế bào MCF7 thông qua: gây ra sự cô đặc hoặc phân mảnh nhân tế bào với tỉ lệ 12.386%; cảm ứng sinh caspase -3 với hàm lượng tăng 1.36 lần so với đối chứng âm (P<0.01); quần thể tế bào apoptosis tăng và đặc biệt là quần thể apoptosis sớm tăng 42.24% thông qua kĩ thuật trắc lưu tế bào (P<0.05) Qua đó, dựa trên kết quả thử hoạt tính độc tế bào, kháng viêm NO, PGE2 và cảm ứng apoptosis đã khẳng định được cơ chế và đặc điểm về hoạt tính của các hợp chất lai thu được. Kết quả chỉ ra phân tử lai cả về mặt cấu trúc phân tử lẫn hoạt tính sinh học theo mô hình mục tiêu thiết kế của phân tử lai ban đầu. Chúng tôi đã tiếp tục lựa chọn phân tích docking phân tử để mô phỏng tương tác giữa chất lai thiết kế với các mục tiêu COX2 và tubulin. 21 4. Docking phân tử Theo tiêu chí xếp hạng của AutoDock 4.2.6, giá trị càng âm của năng lượng thì khả năng liên kết của hợp chất với thụ thể nhắm mục tiêu càng tốt. Hợp chất 102 và 82 được chứng minh là hai ứng cử viên tiềm năng với năng lượng kết nối tốt cho cả hai mục tiêu và có thể được coi là chất ức chế kép COX2 /tubulin tiềm năng, các tương tác của chúng được phân tích thêm bằng cách sử dụng mô hình Studio Visualizer. Tính toán thu được kết quả có thể được sử dụng để dự đoán chất ức chế tốt hơn cho mô hình protein dựa trên độ lệch (Δ) giữa giá trị tương tác của COX2 và tubulin (Phương trình 1–2). Docking của hợp chất 102 với COX2 cho thấy ba tương tác liên kết hydro giữa nhóm sulfonamid (NH2) và Gln178, Leu338, Phe504 (khoảng cách = 2.71; 2.93; 3.33 Å, tương ứng), trong khi vị trí liên kết của tubulin chỉ ra rằng nhóm này tạo ra ba liên kết hydro với Asn258, Met259, Lys352 (khoảng cách = 2.91; 3.20; Tương ứng là 2.86 Å). Ngoài ra, sự tương tác giữa hợp chất 102 và tubulin được tăng cường hơn nữa thông qua hai liên kết hydro do trimethoxybenzen với Asn101, Ala250. Phân tích liên kết của hợp chất 82 cũng chỉ ra các liên kết