Tóm tắt Luận án Nghiên cứu xác định tên khoa học, quy trình nhân gống in vitro và hoạt tính sinh học của tinh dầu cây gừng bản địa ở Bắc Kạn (gừng đá)

ính sinh học tinh dầu và xây dựng quy trình nhân giống bằng công nghệ nuôi cấy mô từ lát cắt chồi. 2.2. Vật liệu nghiên cứu - Mẫu vật là những cây mọc tự nhiên (mẫu hoang dã) được thu thập tại 02 xã Liêm Thủy và Xuân Dương thuộc huyện Na Rì tỉnh Bắc Kạn, độ cao từ 846 - 862m so với mực nước biển. Tổng số mẫu được sử dụng để phân tích hình thái và giải trình tự gen ITS và gen matK là 06 mẫu. - Vật liệu sử dụng để nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro là chồi mới tái sinh từ cây mẹ khỏe mạnh, sạch bệnh. Kích thước chồi từ 6 – 8cm. 2.3. Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Xác định loài gừng bản địa Bắc Kạn dựa vào phân tích đặc điểm hình thái và giải trình tự đoạn gen ITS và gen matK. - Nội dung 2: Hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống cây gừng Bắc Kạn bằng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng in vitro. 5 - Nội dung 3: Đặc điểm nông sinh học cây gừng Bắc Kạn có nguồn gốc nuôi cấy mô. - Nội dung 4: Xác định thành phần hóa học và hoạt tính sinh học tinh dầu gừng Bắc Kạn. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm hình thái Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, tham khảo các chuyên khảo của Phạm Hoàng Hộ (2000) [20], Nguyễn Quốc Bình (2011) [6] và Thực vật chí Trung Quốc [48]. 2.4.2. Phương pháp phân loại thực vật dựa trên trình tự gen 2.4.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số 2.4.2.2. Điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA tổng số 2.4.2.3. Kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose 2.4.2.4. Kiểm tra chất lượng DNA bằng máy đo quang phổ 2.4.2.5. Khuếch đại DNA bằng kỹ thuật PCR 2.4.2.6. Giải trình tự sản phẩm PCR 2.4.2.7. Hiệu chỉnh trình tự 2.4.2.8. Xây dựng cây phát sinh loài 2.4.3. Phương pháp nuôi cấy mô 2.4.3.1. Nghiên cứu tạo mẫu sạch in vitro 2.4.3.2. Nghiên cứu tạo callus 2.4.3.3. Nghiên cứu tái sinh chồi từ callus 2.4.3.4. Nghiên cứu nhân nhanh chồi 2.4.3.5. Nghiên cứu tạo cây con hoàn chỉnh 2.4.3.6. Nghiên cứu chế độ luyện cây và giá thể ra ngôi 2.4.3.7. Nghiên cứu biến đổi sinh lý, hóa sinh cây in vitro giai đoạn ra ngôi 2.4.4. Đặc điểm sinh trưởng phát triển cây có nguồn gốc in vitro 2.4.5. Phương pháp phân tích sinh hóa 6 Chưng cất thu tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước. Việc phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N. 2.4.6. Phương pháp phân tích hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá khả năng kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng theo phương pháp của Vander Bergher và Vlietlinck (1991) và McKane & Kandel (1996). 2.5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Các nghiên cứu về phân tích đặc điểm hình thái được thực hiện tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam – 18 Hoàng Quốc Việt – Hà Nội. Các mẫu tiêu bản được gửi kiểm tra tại Viện Hàn lâm Khoa học Trung Quốc, Quảng Châu, Trung Quốc. Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017. Các nghiên cứu về giải trình tự đoạn gen đặc trưng được thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học -Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. Thời gian thực hiện: từ 01/2017 - 7/2017. Các nghiên cứu về nhân giống in vitro được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; Trường Đại học Hùng Vương – Thành phố Việt Trì – Tỉnh Phú Thọ. Thời gian thực hiện: từ 2/2016 - 6/2017. Các nghiên cứu về phân tích hóa sinh, hoạt tính kháng sinh được thực hiện tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam. Thời gian thực hiện: từ 7/2017 - 8/2018. Các nghiên cứu về đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô được thực hiện tại tỉnh Phú Thọ và Huyện Na Rì – tỉnh Bắc Kạn. Thời gian thực hiện: từ 4/2016 - 8/2018. 7 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Vị trí phân loại cây gừng Bắc Kạn 3.1.1. Đặc điểm sinh học của cây gừng Bắc Kạn 3.1.1.1. Một số đặc điểm hình thái nông học Bảng 3.1: Một số tính trạng đặc trưng của gừng Bắc Kạn TT Tính trạng Mức độ biểu hiện 1 Chiều cao cây Cao 80-150 cm 2 Hình dạng thân cắt ngang tới gốc: Tròn 3 Mùi của thân Có 4 Độ dài cuống lá Ngắn (3-6 mm) 5 Hình dạng lá Hình mác - elip 6 Chiều dài lá Từ 13 - 16 cm 7 Chiều rộng lá Từ 2,5 – 3,3 cm 8 Tỷ lệ dài/rộng lá Từ 3 – 5 9 Màu phiến lá Xanh đậm 10 Có vệt sọc trên lá Có 11 Mép lá Có lông mi 12 Màu mép lá Xanh đậm 13 Mùi của lá Có 14 Tần suất ra hoa Mỗi năm 1 lần 15 Số hoa/khóm Có 2 - 4 hoa 16 Cấu tạo hoa Dạng bông cụm 17 Màu sắc hoa Nâu đỏ, vàng 18 Hình dạng củ Phân nhánh 19 Kích thước củ Nhỏ (200g) 20 Màu vỏ củ Đỏ nâu 21 Màu thịt củ phần trung tâm Xám 22 Màu phụ ở thịt củ Có màu vàng 23 Năng suất củ/khóm (kg) 150 – 300g 24 Số củ con trên khóm 4 – 6 củ. 25 Dài củ 5 – 10cm 26 Rộng củ tại vị trí rộng nhất 2 – 3cm 27 Thời gian sinh trưởng Dài >10 tháng 8 3.1.2. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái. 3.1.2.1. Phân loại đến bậc chi Kết quả mô tả hình thái so sánh với khóa phân loại của Nguyễn Quốc Bình (2011), cây gừng Bắc Kạn với các đặc điểm cây có cụm hoa trên ngọn, thân có lá, nhị lép hình dùi, quả hình cầu, đây là các đặc điểm của các loài cây thuộc chi Riềng (Alpinia) để phân biệt với các loài trong các chi khác thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) [6]. Trên cơ sở đó chúng tôi xác định loài cây có tên là Gừng đá ở Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), đây là một trong những phát hiện mới có giá trị vì trước đó chúng được người dân gọi tên thông thường là “Gừng đá” và được hiểu là cây thuộc chi Gừng (Zingiber). 3.1.2.2. Phân loại đến bậc loài Sau khi xác định nguồn gen gừng Bắc Kạn thuộc chi Riềng (Alpinia), chúng tôi sử dụng khóa phân loại đến loài trong chi Riềng (Alpinia) ở Việt Nam [8]. Tuy nhiên, mô tả đặc điểm cho thấy loài này không giống bất cứ loài nào đã công bố tại Việt Nam. Trên cơ sở đó chúng tôi tiếp tục rà soát các khu vực lân cận (thuộc Trung Quốc), sử dụng danh mục các loài thực vật và khóa định loại các loài trong chi Riềng (Alpinia) của Trung Quốc [48] và so sánh với các loài gần, kết quả đã xác định được loài gừng Bắc Kạn có tên khoa học là Alpinia coriandriodora D.Fang với các đặc điểm đặc trưng là: có mùi thơm đặc trưng, rụng lá bắc. Đây là một loài bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam, nâng tổng số loài hiện biết của chi Alpinia Roxb. ở Việt Nam lên 34 loài [18]. Loài cây này đã được D. Fang công bố trong tạp chí Acta Phytotax. Sin. 16 (4): 79 năm 1978 [57]. 3.1.3. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS và gen matK 3.1.3.1. Tách chiết DNA tổng số Đã tách chiết được DNA của 6 mẫu nghiên cứu. Kết quả cho thấy 9 chỉ số A260/A280 của tất cả các mẫu đều dao động trong khoảng 1,8- 2,0, chứng tỏ DNA tổng số thu được đảm bảo cho việc làm các thí nghiệm sau này. 3.1.3.2. Phân tích các sản phẩm khuếch đại Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của cặp mồi matK có kích thước khoảng 900bp, sản phẩm PCR của cặp mồi ITS có kích thước khoảng 800bp phù hợp với kích thước lý thuyết. 3.1.3.3. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen ITS 3.1.3.3.1. Kết quả giải trình tự gen ITS Đã giải trình tự thành công 06 trình tự ITS mới và đăng ký trên Genbank với các mã số: MN227653, MN227654, MN227655, MN227656, MN227657 và MN227658 (Phụ lục 3). Sau khi chỉnh sửa và loại bỏ tất cả các vị trí trống vùng gen ITS, các mẫu gừng thu được có trình tự nucleotit vùng gen ITS tương đồng từ 99 - 100% và có chiều dài 698bp. Xuất hiện 02 vị trí nucleotit có sự sai khác giữa các mẫu, vị trí nu số 597 trong khi các mẫu GD01LT, GD02LT và GD01XD là nu loại T thì các mẫu còn lại GD03LT, GD02XD, GD03XD lại là nu loại C; vị trí nu số 605 trong mẫu GD03LT là nu loại T thì các mẫu còn lại là nu loại C. Sự sai khác giữa các nu ở các vị trí trên có thể cho thấy có sự đa dạng về mặt di truyền giữa các cá thể gừng Bắc Kạn, đây là cơ sở rất quan trọng để phục vụ cho nghiên cứu chọn dòng trội, lai tạo, chọn giống có năng suất chất lượng cao. Sáu trình tự gen ITS của các mẫu nghiên cứu được so sánh với các trình tự ITS của chi Alpinia (taxid:94326) công bố trên NCBI bằng công cụ Blast nucleotit. Kết quả cho thấy, các loài có trình tự ITS ở mức độ tương đồng cao nhất với trình tự ITS của mẫu gừng Bắc Kạn bao gồm: Alpinia chinensis (EU909426.1), Alpinia japonica (EU909427.1), Alpinia officinarum (EU909422.1), Alpinia pumila , Alpinia nieuwenhuizii. 10 3.1.3.3.2. Xây dựng cây phân loại bằng trình tự gen ITS Cây phân loại mẫu gừng Bắc Kạn bằng chỉ thị gen ITS (Hình 3.7) được xây dựng bằng phương pháp Maximum Likelihood với giá trị boostrap 1000, kết quả cho thấy 06 mẫu gừng Bắc Kạn được xếp cùng nhóm với các loài: Alpinia coriacea, A. pumila, A. japonica, A. polyantha, A. intermedia, A. stachyodes, A. maclurei, A. suishaensis, A. guangdongensis. Kết quả này khá phù hợp vì trong thực tế vì các loài trên đều có cùng khu vực phân bố với loài A. coriandriodora thuộc khu vực phía Nam Trung Quốc. 3.1.3.4. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự gen matK 3.1.3.4.1. Kết quả giải trình tự gen matK Đã giải trình tự thành công cho 06 trình tự gen matK mới và đăng ký trên Genbank với các mã số: MN335320, MN335321, MN335322, MN335323, MN335324, MN335325 (Phụ lục 4). Sau khi chỉnh sửa và loại bỏ tất cả các vị trí trống vùng gen matK, các mẫu gừng thu được (GD01LT, GD02LT, GD03LT, GD01XD, GD02XD, GD03XD) có trình tự nucleotide tương đồng 100% và có chiều dài 700bp. Sáu trình tự gen matK của các mẫu nghiên cứu được so sánh với các trình tự matK của chi Alpinia (taxid:94326) công bố trên NCBI bằng công cụ Blast nucleotit ( Kết quả cho thấy: Các loài có trình tự matK ở mức độ tương đồng cao nhất với trình tự matK của mẫu gừng Bắc Kạn bao gồm: Alpinia zerumbet, A. mutica, A. kwangsiensis, A. hainanensis, A. uraiensis, A. uraiensis, A. shimadae, A. formosana, A. japonica, A. japonica, A. chinensis, A. calcarata, A. oxyphylla. 3.1.3.4.2. Xây dựng cây phân loại bằng trình tự gen matK Dựa trên trình tự gen matK thu được từ các mẫu gừng Bắc Kạn và cơ sở dữ liệu trình tự gen matK của các loài trong chi Alpinia đã được công 11 bố, chúng tôi đã xây dựng được sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A. coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của vùng gen matK bằng phương pháp Maximum Likelihood (hình 3.9). Sơ đồ hình cây cho thấy, các mẫu gừng Bắc Kạn cùng nhóm với các loài: A. guinaensis, A. zerumbet, A. mutica, A. polyantha, A. mutan, A. blepharocalyx, A. rugosa, A.calcarata, A. macrlure, A. guangdongensis và A.japonica. 3.1.3.5. Phân loại gừng Bắc Kạn dựa trên trình tự kết hợp gen ITS và matK Kết quả phát sinh loài từ cây phát sinh được xây dựng bằng khối dữ liệu đơn như matK và ITS là tương đồng nhau, tuy nhiên chúng thể hiện rằng kết quả từ khối dữ liệu đơn là không rõ ràng và mức ủng hộ thấp. Do đó chúng tôi sử dụng cây phát sinh loài từ khối dữ liệu kết hợp matK và ITS để xác định mối quan hệ phát sinh loài của chi Alpinia và vị trí của loài Alpinia coriandriodora (Hình 3.10). Kết quả phân tích dữ liệu phân tử kết hợp bằng phương pháp maximum likelihood (ML) and Bayesian Inference (BI) đều ủng hộ mạnh mẽ rằng Alpinia không phải là nhóm đơn phát sinh (nonmonophyletic group) với chỉ số ủng hộ rất cao (BS: 100%, PP: 1.0) (Hình 3.10). Cây phân loại đã phân biệt 06 nhánh riêng biệt của Alpinia, kết quả này hoàn toàn tương đồng với nghiên cứu của Kress et al., (2005) [77]. Trong đó loài gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) được ghi nhận là một thành viên của chi Alpinia với vị trí phát sinh loài thuộc nhánh thứ VI (Hình 3.10). Kết quả phân tích cũng thể hiện rằng loài gừng Bắc Kạn (Alpinia coriandriodora) có mối quan hệ rất gần gũi với một số thành viên Alpinia ở nam Trung Quốc (Quảng Tây, Vân Nam, Quảng Đồng, Hải Nam) như A. japonica, A. coriacea và A. guangdongensis Kết quả này thể hiện rằng A. coriandriodora có sự tương đồng về di truyền với 12 các loài trong cùng vùng phân bố. Hơn nữa, kết quả này là căn cứ khẳng định chắc chắn cho ghi nhận loài bổ sung Alpinia coriandriodora cho hệ thực vật Việt Nam [51]. Hình 3.10. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa loài A. coriandriodora và các loài trong chi Alpinia dựa trên khối dữ liệu kết hợp của matK và ITS (A), và vị trí phát sinh loài của Alpinia coriandriodora trong chi Alpinia (B). Chỉ số ủng hộ ML và PP của phân tích BI được trình bày trên các nhánh. “–” thể hiện chỉ số ủng hộ thấp hơn 50%. Màu đỏ: Vị trí loài A. coriandriodora; Màu xanh: các loài thuộc cùng nhánh phân loại với loài A. coriandriodora) 13 3.2. Nhân giống gừng Bắc Kạn bằng công nghệ nuôi cấy lớp mỏng 3.2.1. Tạo mẫu sạch in vitro Công thức khử trùng hiệu quả đối với mẫu chồi non gừng Bắc Kạn là khử trùng kép bằng dung dịch NaOCl 2,5% và 0,5ml Tween20 trong thời gian lần 1 là 5 phút, lần 2 là 15 phút, giữa 2 lần mẫu được rửa sạch bằng nước cất tiệt trùng ít nhất 3 lần. 3.2.2. Tạo callus từ lát cắt chồi Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp TDZ và 2,4D đến khả năng tái sinh tạo callus của lát cắt chồi (sau 8 tuần nuôi cấy). Công thức Chất ĐHST (mg/l) Tỉ lệ tạo callus (%) Hình thái callus TDZ 2,4D ĐC 0 0 32,22 Một số mẫu không tạo được callus và bị hóa đen CT8 0,5 1,0 34,44 Bề mặt callus khô, chắc, màu trắng sáng. CT9 0,5 2,0 44,44 CT10 0,5 3,0 75,56 CT11 0,5 4,0 54,44 Một số mẫu không tạo được callus và bị hóa đen LSD0,05 5,05 P.value <0,001 Để tạo callus từ lát cắt chồi cây gừng Bắc Kạn có thể sử dụng tổ hợp 0,5 mg/l TDZ và 3 mg/l 2,4D, tỉ lệ tạo callus đạt 75,56%, callus có bề mặt khô, chắc, màu trắng sáng. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với công bố trước đó khi nghiên cứu nhân giống loài Curcuma kwangsiensis Lindl. và Alpinia purpurata thông qua con đường tạo callus [80, 114]. 3.2.3. Tái sinh chồi từ callus Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l Vitamin B1 và 3,0 mg/l BAP là phù hợp để tái sinh chồi từ callus, tỷ lệ bật chồi đạt 78,89%, hệ số tái sinh chồi đạt 9,71 chồi/callus. 14 3.2.4. Nhân chồi in vitro 3.2.4.1. Ảnh hưởng của BAP và Kin đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc sử dụng phối hợp 2,0 mg/l BAP; 1,0 mg/l Kin và 0,2 mg/l α-NAA đã làm tăng hệ số nhân chồi (đạt 5,98 lần) và chiều cao trung bình chồi (đạt 6,07 cm) so với việc sử dụng riêng rẽ 3,5mg/l BAP (hệ số nhân chồi đạt 5,03 lần, chiều cao trung bình chồi đạt 4,18cm) theo nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Hương và cộng sự (2014). 3.2.4.2. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tái sinh và nhân nhanh chồi in vitro Bảng 3.9 Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến hiệu quả nhân chồi (sau 4 tuần nuôi cấy) CT Nƣớc dừa (ml/l) Hệ số nhân (lần) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá) Hình thái chồi CT22 0 5,91 5,87 4,67 Chồi mập, thân lá xanh đậm, sinh trưởng phát triển tốt. CT23 100 6,32 5,90 5,00 Chồi mập, thân lá xanh đậm, sinh trưởng phát triển tốt. CT24 150 5,69 5,77 4,33 Chồi mập, thân lá xanh đậm CT25 200 4,71 5,27 3,67 Chồi trung bình, thân lá xanh nhạt CT26 250 3,71 4,67 3,33 Chồi nhỏ, thân lá xanh nhạt, một số lá vàng. LSD0,05 0,14 0,38 0,81 P-value <0,001 <0,001 0.0142 So với kết quả nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Hương (2014), việc sử dụng môi trường MS + 30g/l Succrose + 6 g/l agar + 2,0mg/l BAP + 15 1,0mg/l Kin + 0,2mg/l α-NAA + 100ml/l nước dừa đã cải thiện hệ số nhân chồi, tăng từ 5,03 lần lên 6,32 lần, đồng thời chất lượng chồi thu được tốt, chồi mập, lá to, thân lá xanh đậm, sinh trưởng phát triển tốt. Như vậy, hàm lượng nước dừa phù hợp để bổ sung vào môi trường là 100ml/l và môi trường phù hợp để nhân chồi gừng Bắc Kạn in vitro là: MS + 30g/l Succrose + 6 g/l agar + 2,0mg/l BAP + 1,0mg/l Kin + 0,2mg/l α-NAA + 100ml/l nước dừa. 3.2.5. Tái sinh rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức sử dụng môi trường MS có bổ sung 0,6mg/l NAA có hiệu quả tái sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh tốt nhất với thời gian ra rễ từ 19 – 21 ngày, chiều cao TB/cây là 9,63cm, số lá TB/cây là 5,33 lá, số rễ TB là 5,51 rễ/chồi và chiều dài TB rễ là 4,43cm. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với công bố trước đó của các tác giả khi nghiên cứu nhân giống cây họ gừng, đặc biệt khẳng định kết quả nghiên cứu của Trịnh Thị Thanh Hương và cộng sự (2014) khi nghiên cứu trên đối tượng gừng đá Bắc Kạn [19,51,112]. A B Hình 3.15. Hình thái cây hoàn chỉnh sau 6 tuần nuôi cấy A: Trên môi trường ½MS (hàm lượng NAA bổ sung từ 0,2 -1,0mg/l) B: Trên môi trường MS (hàm lượng NAA bổ sung từ 0,2 -1,0mg/l) 3.2.6. Giai đoạn ra ngôi 3.2.6.1. Giá thể ra ngôi 1,0 0,2 0,4 1,0 0,8 0,6 0,2 0,4 0,8 0,6 16 Trên giá thể 100% cát mịn, chất lượng cây được cải thiện đáng kể. Chiều cao cây, số lá và số rễ trung bình/cây của cây sau 15 ngày đạt 9,43 cm; 5,33 lá/cây; 5,33 rễ/cây so với chiều cao cây, số lá trung bình và số rễ/cây lúc đầu là 9,2 cm, 5 lá/cây và 5 rễ/cây. Đến ngày thứ 30 chiều cao trung bình của cây đạt 9,67 cm, số lá trung bình là 5,67 lá/cây và số rễ trung bình trên cây đạt 6,00 rễ/cây. 3.2.6.2. Sự biến đổi sinh lý, hóa sinh cây gừng Bắc Kạn trong thời kỳ ra ngôi 3.2.6.2.1. Hàm lượng nước tự do,nước liên kết và hàm lượng chất khô 3.2.6.2.2. Hàm lượng sắc tố quang hợp 3.2.6.2.3. Huỳnh quang diệp lục 3.2.6.2.4. Hoạt độ catalase 3.2.7. Quy trình nhân nhanh gừng Bắc Kạn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng 3.2.7.1. Sơ đồ quy trình 3.2.7.2. Mô tả quy trình * Bước 1: Chuẩn bị vật liệu * Bước 2: Tạo callus * Bước 3: Tái sinh chồi từ callus * Bước 4: Nhân chồi in vitro * Bước 5: Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro * Bước 6: Chuyển cây ra vườn ươm 3.3. Đặc điểm nông sinh học cây gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô Gừng Bắc Kạn nguồn gốc nuôi cấy in vitro được trồng tại Thành phố Việt trì – Tỉnh Phú Thọ trong điều kiện đồng ruộng để đánh giá các đặc điểm nông sinh học: Động thái tăng trưởng chiều cao cây; Động thái ra lá; Động thái đẻ nhánh; Một số yếu tố cấu thành năng suất. Thời gian trồng: Tháng 4/2016 17 3.3.1. Động thái tăng trưởng chiều cao cây Kết quả nghiên cứu cho thấy tốc độ tăng trưởng chiều cao cây của giống gừng Bắc Kạn trong suốt quá trình theo dõi là tương đối chậm. Ở 20 ngày sau trồng chiều cao cây trung bình đạt 4,39cm. Đến 50 ngày sau trồng, chiều cao cây trung bình đạt 8,88cm (tăng 4,49cm/30 ngày); 80 ngày sau trồng chiều cao cây trung bình đạt 13,60 cm (tăng 4,72 cm/30 ngày). Tốc độ tăng trưởng chiều cao cây đạt cao nhất đạt 5,41 cm/30 ngày (170-200 ngày sau trồng) và 4,73 cm/30 ngày (140 – 170 ngày sau trồng). Đến 290 ngày sau trồng, chiều cao cây trung bình đạt 41,85cm; 320 ngày sau trồng, chiều cao cây trung bình đạt 44,26 cm. 3.3.2. Động thái ra lá Kết quả nghiên cứu cho thấy, tương ứng với tốc độ tăng trưởng chiều cao cây, động thái ra lá của giống gừng Bắc Kạn cũng tương đối chậm. Ở 20 ngày sau trồng, số lá trung bình đạt 3,03 lá/thân chính; 50 ngày sau trồng, số lá trung bình đạt 3,59 lá/thân chính; tốc độ tăng trưởng là 0,56 lá/30 ngày. Từ 50 - 80 ngày sau trồng, tốc độ tăng trưởng dạt 0,55 lá/30 ngày; 80 – 110 ngày ngày sau trồng, tốc độ tăng trưởng dạt 0,48 lá/30 ngày. Từ 110 ngày sau trồng trở đi, tốc độ ra lá của cây gừng Bắc Kạn nhanh hơn giai đoạn đầu. Đến 320 ngày sau trồng, số lá trung bình đạt 9,48 lá/thân chính. 3.3.3. Động thái đẻ nhánh Kết quả cho thấy, trong 20 ngày sau trồng, tỉ lệ đẻ nhánh thấp, số nhánh trung bình đạt 1,10 nhánh/cây, giai đoạn này cây phải thích ứng với điều kiện môi trường đồng ruộng, khả năng tích lũy dinh dưỡng còn hạn chế. Sau 50 ngày, khi cây đã bén rễ hồi xanh, cây gừng Bắc Kạn bắt đầu có khả năng đẻ nhánh, số nhánh/cây đạt 1,57 nhánh và đến 80 ngày sau trồng đạt 2,23 nhánh/cây. Sau 140 ngày, cây gừng Bắc Kạn vẫn tiếp 18 tục đẻ nhánh nhưng mức độ đẻ nhánh thấp hơn giai đoạn đầu. Đến 320 ngày sau trồng, số nhánh/cây trung bình đạt 5,34 nhánh/cây. 3.3.4. Một số yếu tố cấu thành năng suất giống gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô Kết quả nghiên cứu cho thấy 320 ngày sau trồng số củ /khóm trung bình của giống gừng Bắc Kạn đạt 4,73củ/khóm, chiều dài củ trung bình đạt 5,41cm và chiều rộng củ trung bình đạt 2,26cm. Năng suất cá thể khối lượng củ/khóm của giống gừng Bắc Kạn đạt trung bình 147,7g/khóm. 3.4. Thành phần hóa học tinh dầu cây gừng Bắc Kạn 3.4.1. Kết quả tách chiết tinh dầu Tinh dầu thu được từ các mẫu thân lá có màu vàng nhạt, mùi thơm dễ chịu. Ở mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, từ 400g mẫu lá tươi thu được 0,440g tinh dầu, đạt hàm lượng 0,110 % (tính theo nguyên liệu mẫu tươi). Ở mẫu gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô, hàm lượng tinh dầu mẫu lá trồng tại Bắc Kạn và trồng tại Phú Thọ có tỉ lệ hàm lượng tinh dầu tương đương nhau, lần lượt là 0,131% và 0,133%, và đều cao hơn so với mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên. Điều này chứng tỏ việc trồng mẫu nuôi cấy mô ở hai địa điểm khác nhau (Bắc Kạn và Phú Thọ) không làm ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu (Bảng 3.17). Tinh dầu thu được từ các mẫu củ rễ có màu vàng đậm, cũng có mùi thơm dễ chịu giống như tinh dầu thu được từ phần lá. Khi so sánh với mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, các mẫu gừng nuôi cấy mô cho hàm lượng tinh dầu phần thân lá cao hơn phần củ rễ. Ở mẫu gừng Bắc Kạn tự nhiên, từ 500g mẫu rễ tươi thu được 0,412g tinh dầu, đạt hàm lượng 0,082 % (tính theo nguyên liệu mẫu tươi). Ở các mẫu gừng Bắc Kạn nuôi cấy mô, tinh dầu thu được từ bộ phận rễ có hàm lượng thấp hơn hẳn 19 so với tinh dầu thu được từ bộ phận lá (0,075% ở mẫu củ rễ so với 0,131% ở mẫu thân lá) (Bảng 3.17). 3.4.2. Thành phần hóa học tinh dầu Bằng phương pháp phân tích sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) đã xác định được thành phần tinh dầu thân lá mẫu TNBK gồm 14 cấu tử (chiếm 94,38%), mẫu CMBK gồm 13 cấu tử (chiếm 85,16%), mẫu CMPT gồm 18 cấu tử (chiếm 84,33%). Thành phần tinh dầu thân rễ mẫu TNBK gồm 15 cấu tử (chiếm 94,24%), mẫu CMBK gồm 14 cấu tử (chiếm 85,27%), mẫu CMPT gồm 18 cấu tử (chiếm 88,65%) (bảng 3.18). Tinh dầu thân lá chứa hợp chất chính là decenal (chiếm tới 80,78 %), tiếp theo đó là decen-1-ol (4,91 %), octenal (2,71 %), decanal (1,25 %) và 2-decenoic acid (1,03 %). Decenal là một thành phần chính của tinh dầu cây rau mùi Coriandrum sativum L. Decenal được sử dụng làm gia vị và là một tác nhân hương liệu [84]. Cũng giống như tinh dầu phần thân lá, trong tinh dầu thu được từ củ rễ gừng tự nhiên hợp chất chiếm hàm lượng cao nhất là decenal (chiếm tới 80,48 %), tiếp theo đó là octenal (3,01 %), 2-decenoic acid (1,69 %), decen-1-ol (1,53 %) và dodecanal (1,17 %). 20 Bảng 3.18: Thành phần hóa học của tinh dầu các mẫu nghiên cứu TT Hợp chất Mẫu thân lá (%) Mẫu thân rễ (%) Công thức phân tử TNB K CMB K CMP T1 CMP T2 TNB K CMB K CMP T1 CMP T2 1 Camphene - - - - 0,43 - 0,31 2,79 C10H16 2 Octanal 0,36 0,56 0,41 0,59 0,22 1,05 0,32 0,23 C8H16O 3 Cymene 0,67 0,23 0,68 1,18 0,25 0,15 0,38 0,87 C10H14 4 Limonene - - - 0,14 0,12 - - 0,98 C10H16 5 Cineole 1,8 - - 0,27 - 0,39 0,22 0,45 1,78 C10H18O 6 Octenal 2,71 0,71 1,64 3,42 3,01 0,32 1,36 4,47 C8H14O 7 Borneol - - 0,34 - 0,36 - 1,02 0,98 C10H18O 8 Decanal 1,25 0,58 0,76 1,85 0,91 - 0,25 1,00 C10H20O 9 Fenchyl acetate - - 2,54 - 2,25 2,11 3,35 5,25 C12H20O2 10 Decenal 80,78 39,60 47,11 53,48 80,48 22,21 42,52 61,59 C10H18O 11 Decen-1-ol 4,91 0,53 1,62 2,26 1,53 0,97 1,55 1,13 C10H20O 12 Bornyl acetate - - 1,41 - 0,84 1,16 2,35 2,51 C12H20O2 13 2-Decenoic acid 1,03 21,94 8,60 2,67 1,69 36,29 21,22 2,19 C10H18O2 14 Decenyl Acetate 0,46 16,89 15,90 9,25 0,60 16,11 11,75 2,36 C12H22O2 15 Dodecanal 0,98 1,14 1,17 - 1,17 0,64 0,94 0,99 C12H22O 16 Decanol 0,58 - 0,78 - - - - - C10H22O 17 Non-1-ene 0,20 0,17 - - - 0,12 - C9H18 18 Nonanal - 0,45 0,25 - - 0,64 0,25 - C9H18O 19 Nonanoic acid - 1,70 - - - 1,77 - - C9H18O2 20 Decanoic acid - 0,63 - - - - 0,37 - C10H20O2 Tổng 94.38 85,16 84,33 98,21 94,24 85,27 88,65 98,05 Ghi chú: TNBK: Mẫu mọc tự nhiên tại Bắc Kạn CMBK: Mẫu nuôi cấy mô trồng tại Bắc Kạn CMPT1: Mẫu nuôi cấy mô trồng tại Phú Thọ 01 năm tuổi CMPT2: Mẫu nuôi cấy mô trồng tại Phú Thọ 02 năm tuổi ( - ): Không phát hiện Khi so sánh với tinh dầu của một số loài thuộc chi Alpinia khác thì thấy rằng, tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên có sự khác biệt lớn với tinh dầu của các loài này: trong khi tinh dầu gừng Bắc Kạn tự nhiên chứa các thành phần chính là decenal, octenal, 2-decenoic acid, decen-1-ol và dodecanal thì tinh dầu Riềng nếp (A. galanga) chứa thành phần chính là 1,8-cineol, camphor, alpha-fenchyl acetate; tinh dầu A. conchigera chứa 1,8-cineol, 21 myrcen và farnesol là các thành phần chính và tinh dầu A. tonkinensis chứa các thà