Tóm tắt Luận án Phát hiện người mang đột biến gen ATP7B trong các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson

. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nhóm bệnh nhân và các thành viên trong gia đình 78 bệnh nhân Wilson thuộc 78 gia đình từ 3 đến 18 tuổi được chẩn đoán và điều trị tại khoa Gan-Mật, Bệnh viện Nhi Trung Ương từ tháng 1/2010 đến 31/11/2017. 208 thành viên thuộc 55 phả hệ của bệnh nhân bị đột biến trên 2 bản sao của gen ATP7B bao gồm: 49 người bố; 53 người mẹ; 83 anh, chị, em ruột của bệnh nhân; 23 các thành viên khác trong dòng họ của bệnh nhân bao gồm anh, chị, em họ, cô, dì, chú, bác Mẫu bệnh phẩm: 2ml máu ngoại vi chống đông EDTA. Nhóm chẩn đoán trước sinh Các thai phụ đã có con được chẩn đoán xác định mắc Wilson và đã phát hiện được đột biến trên 2 bản sao của gen ATP7B. Mẫu bệnh phẩm: 12-15 ml dịch ối đựng trong ống vô trùng sẽ được nuôi cấy và thu hoạch sau hai tuần để tách DNA tổng số và xác định đột biến đích. Tiêu chuẩn lựa chọn Bệnh nhân: tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân dựa trên Bảng đánh giá theo tiêu chuẩn của Leipzig 2001 (Ferenci và cs, 2012). Các thành viên trong gia đình trong gia đình bệnh nhân: các thành viên trong gia đình của bệnh nhân, bao gồm: bố, mẹ, anh, chị, em ruột và họ hàng có quan hệ huyết thống. Chẩn đoán trước sinh: thai phụ đã sinh con mắc bệnh Wilson và được chẩn đoán xác định bằng xét nghiệm di truyền, có 2 đột biến dị hợp tử trên 2 bản sao của gen hoặc 1 đột biến đồng hợp tử trên gen ATP7B. 1 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả, chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện trên cơ sở bệnh nhân có đủ tiêu chuẩn lựa chọn và các tiêu chuẩn loại trừ. Xây dựng phả hệ và thu thập mẫu Biến số nghiên cứu Vẽ phả hệ Công cụ thu thập số liệu Các phương pháp sử dụng trong phát hiện đột biến gen ATP7B Tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối: DNA tổng số được tách chiết bằng kit tách DNA của Qiagen (Qiagen-DNA blood mini kit, Đức) và điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR: 21 exon của gen ATP7B, trong đó exon 2 được chia thành 5 đoạn nhỏ sẽ được khuếch đại bằng các cặp mồi đặc hiệu. Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Kit tinh sạch của QIAGEN Qiagen, Đức) và giải trình tự trên máy đọc trình tự gen tự động ABI 3130 Applied Biosystems, Foster city, Hoa Kỳ). Các trình tự gen được, phân tích bằng phần mềm Chromas/Chromas Pro, Seqscape v2.5 và so sánh với trình tự chuẩn trên Ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank, NT_024524) bằng chương trình Blast. Đột biến được viết theo danh pháp quốc tế ”Genome Variation Nonmenclature” và tra cứu trong dữ liệu Human Gene Mutation database (HGMD- hoặc cơ sở dữ liệu về các biến dị di truyền ( Đột biến mới (novel mutation) không được tìm thấy trên các dữ liệu về đột biến gen quốc tế sẽ được phân tích bằng một số phần mềm tin sinh, chẳng hạn như SIFT, Polyphen-2, Mutation Taster, BDGP, để dự đoán sự ảnh hưởng của đột biến đến chức năng của gen. Phân tích đột biến gen ATP7B và xác định kiểu gen của thai nhi DNA của thai nhi sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR và giải trình tự gen để phát hiện các đột biến đích trên gen ATP7B. Nếu thai nhi chỉ bị một đột biến dị hợp tử, thì thai nhi mang gen bệnh. Nếu thai nhi không có đột biến của bố hoặc mẹ, thì kiểu gen của thai nhi hoàn toàn bình thường. Nếu thai nhi có cả hai đột biến thì thai nhi bị bệnh. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả phát hiện đột biến ATP7B trên 78 bệnh nhân Wilson 3.1.1. Kiểu gen của 78 bệnh nhân Wilson Tỷ lệ nam/nữ trong nghiên cứu là 1,4; tuổi phát bệnh trung bình của nam và nữ là 10,88±4,836, 11,50±4,015. Nghiên cứu đã xác định được 47 loại kiểu gen. Kiểu gen dị hợp tử kép chiếm 62,8%, kiểu gen đồng hợp tử chiếm 33,3%. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B Nghiên cứu đã phát hiện 27 đột biến gen ATP7B khác nhau, thuộc 4 thể đột biến, bao gồm: đột biến lệch khung; đột biến vô nghĩa; đột biến sai nghĩa; đột biến vùng cắt, nối. 20 đột biến đã được công bố: S105X, V176SfsX28, D765G, R778L, M769HfsX28, T850I, P902P, IVS12-2A>G, P992L, K1010T, D1027H, P1052L, I1148T, E1173K, P1245S, N1270S, P1273Q, G1281D, L1371P. 7 đột biến mới: H251AfsX19, P868PfsX5, (R723S; H724TfsX34), V1042CfsX79, F1026Y, IVS6+3A>G, IVS20+4A>G. Tỷ lệ các loại đột biến và các exon, intron xảy ra đột biến gen ATP7B Tỷ lệ alen bị đột biến là 96,8 % (151/156 alen nghiên cứu) Các đột biến có tỷ lệ phát hiện cao, bao gồm: S105X (37,1%), I1148T (7,3%), IVS14-2A>G (6,6%), L1371P (6,0%), T850I và V176SfsX28 (5,3%). Đột biến gen ATP7B được phát hiện trên 9 exon và 4 intron. Các exon và intron có tỷ lệ phát hiện đột biến cao, bao gồm: exon 2 (43,0%), exon 16 (9,9%), exon 8 (8,3%), exon 14 và intron 14 (6,6%). Phân tích các đột biến mới trên gen ATP7B bằng chương trình tin sinh Nghiên cứu phát hiện 4/7 đột biến là đột biến thêm/mất 1 nucleotid hoặc 1 đoạn nucleotid; 3 đột biến mới còn lại là đột biến thay thế và đột biến vùng cắt, nối gen. Đột biến F1026Y được phân tích bằng chương trình SIFT, Polyphen, Mutation Taster; IVS6+3A>G, IVS20+4A>G được phân tích bằng phần mềm BDGP và/hoặc MaxEntScan để dự đoán ảnh hưởng của đột biến đến protein ATP7B (Bảng 3.8). Bảng 3.7. Kết quả phân tích đột biến mới bằng chương trình tin sinh Số thứ tự Đột biến Kết quả phân tích acid amin cDNA Polyphen-2 (Score) SIFT Mutation Taster BDGP/ MaxEntScan 1 F1026Y c.3077T>A 1,0 0,00 0,99 2 IVS6+3A>G c.1946+3A>G + 3 IVS20+4A>G c.4124+4 A>G + Kết quả phân tích bằng chương trình SIFT, Popyphen-2 và Mutation Taster cho thấy F1026Y là đột biến gây bệnh. Đột biến IVS6+3A>G, IVS20+4A>G đã làm thay đổi vị trí cắt nối mRNA, và do vậy chúng có thể ảnh hưởng đến trượt gen. Từ các kết quả thu được, nghiên cứu đã xác định được vị trí và tỷ lệ xảy ra đột biến trên gen ATP7B (Hình 3.8) và qui trình phát hiện đột biến gen cho bệnh nhân nhi mắc bệnh Wilson (Hình 3.10). Hình 3.8.Vị trí và tỷ lệ các đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu Chú thích: chữ màu đỏ là các đột biến mới, chữ màu xanh là các đột biến đã được công bố; exon đổ màu đỏ là các exon có tỷ lệ phát hiện đột biến cao. Hình 3.10. Sơ đồ các bước phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhân Wilson 3.1.2.Kết quả xác định đột biến gen ATP7B trên các thành viên gia đình bệnh nhân 3.1.2.1. Kết quả sàng lọc đột biến đích trên các thành viên của 53 phả hệ Trong 55 phả hệ nghiên cứu, một số bố, mẹ của bệnh nhân đã mất hoặc không thể thu thập được mẫu nên nghiên cứu chỉ tiến hành phát hiện đột biến cho 49 người bố và 53 người mẹ (Bảng 3.11. Kết quả phân tích đột biến gen ATP7B cho thấy, bố mẹ bệnh nhân Wilson đều là người mang gen bệnh. Bảng 3.11. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở bố, mẹ của bệnh nhân Wilson Bố/mẹ bệnh nhân Kết quả Tỷ lệ (%) Có mang gen bệnh Không mang gen bệnh Người bố 49 0 100 Người mẹ 53 0 100 3.1.2.2. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B cho anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson Qua phân tích kết quả sàng lọc đột biến đích 83 cho anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson, kết quả phân tích đột biến được thể hiện trên Bảng 3.12. Bảng 3.12. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson Kết quả Tần suất (n) Tỷ lệ (%) Bị bệnh 13 15,7 Có mang gen bệnh 53 65,0 Không mang gen bệnh 17 20,1 Tổng 83 100 Tỷ lệ người bị bệnh và người mang gen bệnh của anh, chị, em ruột của bệnh nhân Wilson lần lượt là 15,7% (13/83) và 65% (53/78). Nghiên cứu đã phát hiện thêm 13 trường hợp là anh, chị, em của bệnh nhân bị bệnh Wilson (Bảng 3.13), trong đó 8/13 trường hợp đã có biểu hiện lâm sàng và 5/13 trường hợp còn lại chưa có triệu chứng của bệnh. Bảng 3.13. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 13 trường hợp bị bệnh Wilson được phát hiện qua sàng lọc gia đình Ca bệnh Mã bệnh nhân Tuổi/ giới* Kiểu hình Cp (g/l) Đồng niệu/24h (mg) Vòng KF Điểm** Kiểu gen Điểm** Chỉ điểm WBW100605 nam/14 suy gan tối cấp không S105X/S105X Sàng lọc WBW160401 nam/11 thể gan S105X/S105X 4 Chỉ điểm WBW100901 nữ/10 thần kinh 0,020 có 6 S105X/S105X 10 Sàng lọc WBW151002B nam/3t - 0,021 ≤0,05 không 2 S105X/S105X 6 Chỉ điểm WBW120501 nam/11 thể gan 0,060 0,516 có 6 V176SfsX28/P1273Q 10 Sàng lọc WBW120501B nam/9 thể gan 0 V176SfsX28/P1273Q 4 Chỉ điểm PWBW160402S nữ/18 thể gan không 0 T850I/IVS14-2A>G 4 Sàng lọc WBW160402 nam/11 thể gan 0,1133 0,200 không 2 T850I/IVS14-2A>G 6 Chỉ điểm WBW160604 nữ/13 thể gan không 0 S105X/S105X 4 Sàng lọc WBW160604B6 nam/9 thể gan 0,0300 0,235 không 4 S105X/S105X 8 Chỉ điểm WBW160608 nam/10t thể gan 0,0220 0,216 không 4 IVS14-2A>G/ IVS14-2A>G 8 Sàng lọc WBW170604S3 nữ/7t thể gan 0,0214 0,283 không 4 IVS14-2A>G/ IVS14-2A>G 8 Chỉ điểm WBW160610S2 nữ/ suy gan tối cấp 0,0011 5,235 có 7 P992L/P992L 11 Sàng lọc WBW160610 nam/13 thể gan 0,0400 0,240 không 4 P992L/P992L 8 Chỉ điểm WBW160802S2 nữ/11 thể gan 0 S105X/S105X 4 Sàng lọc WBW160802 nam/8 thể gan 0,0428 2,930 không 4 S105X/S105X 8 Chỉ điểm WBW120601 Nữ/18 thể gan 0,0087 2 S105X/I1148T 6 Sàng lọc WBW161001B nam/7 - 0,0100 0,072 không 2 S105X/I1148T 6 Chỉ điểm WBW160904 nam/4 - 0,0179 0,293 không 4 L902P/P1273Q 8 Sàng lọc WBW170304B nam/3th - 0,0104 - không 2 L902P/P1273Q 6 Chỉ điểm WBW161202 nữ/13 Thể gan 0,0247 2,230 không 4 K1010T/L1371P 8 Sàng lọc PWBW17050B nam/25 Thần kinh 0,0014 có 4 K1010T/L1371P 8 Chỉ điểm WBW170303 nữ/11 thể gan 0,030 1,950 có 6 R778L/R778L 10 Sàng lọc WBW170305 nữ/6 thể gan 0,012 0,46 không 4 R778L/R778L 8 Chỉ điểm WBW170806 nữ/14 thể gan 0,085 0,406 có 6 T850I/D1027H 10 Sàng lọc WBW170805 nam/12 - 0,107 0,121 không 2 T850I/D1027H 6 Chú thích: Cp (Ceruloplasmin); chữ đậm chữ nghiêng (chưa đủ tiêu chuẩn chẩn đoán khi không có phân tích gen); đổ màu (đã tử vong); B (Brother-anh/em trai); S (Sister-chị/em gái); *tính tại thời điểm được chẩn đoán; ceruloplasmin (bình thường 0,20-0,60 g/L); **: Điểm Leipzig; Đồng niệu/24h (bình thường <0,1 mg/24h); vòng KF (Kayser-Fleicher ring). Điểm chẩn đoán (≥4: chẩn đoán xác định; 3: có thể chẩn đoán nhưng cần làm thêm xét nghiệm khác; 2: chưa thể chẩn đoán bệnh); Điểm Leipzig 1: điểm tại thời điểm chẩn đoán bệnh; Điểm Leipzig 2: điểm đạt được sau khi phân tích gen ATP7B. Một trường hợp mắc Wilson nhưng chưa có biểu hiện lâm sàng trong số 5 trường hợp được phát hiện sớm trong nghiên cứu là thành viên của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901. Gia đình bệnh nhân Wilson mã số WBW100901 có một người con gái (IV.3) mắc bệnh Wilson. Em trai bệnh nhân bị bệnh Wilson nhưng chưa có biểu hiện lâm sàng, được phát hiện sớm lúc 3 tuổi (Hình 3.19-3.20). Hình 3.19. Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901 Nam mang gen bệnh Nữ mang gen bệnh Nam bị bệnh Nữ bị bệnh Nam đã mất Nữ đã mất ? Chưa phân tích gen/chưa biểu hiện bệnh Ca sàng lọc chưa có biểu hiện bệnh Bệnh nhân đã có biểu hiện bệnh Hình 3.20. Hình ảnh giải trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW100901 Bệnh nhân (IV.3) (mã số WBW100901) bị đột biến đồng hợp tử S105X trên gen ATP7B, em trai (IV.5) (mã số WBW151102B) bị đột biến đồng hợp tử S105X và em gái (IV.4) không có đột biến. Bố (III.19), mẹ (III.20) của bệnh nhân bị đột biến dị hợp tử S105X. 3.1.2.3. Kết quả phát hiện người mang gen bệnh họ hàng bệnh nhân Wilson Bảng 3.15. Tỷ lệ người mang gen bệnh ở nhóm họ hàng của bệnh nhân Kết quả Tần suất (n) Tỷ lệ (%) Có mang gen bệnh 12 52,2 Không mang gen bệnh 11 47,8 Tổng 23 100 Một trong những phả hệ có nhiều thành viên được sàng lọc đột biến đích nhất là phả hệ gia đình bệnh nhân Wilson mã số WBW120501 (Hình 3.21 - Hình 3.22). Hình 3.21. Phả hệ của gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 Nam mang gen bệnh Nữ mang gen bệnh Nam bị bệnh Nam đã mất Nam không có đột biến Nữ không có đột biến Bệnh nhân ? Chưa phân tích gen Gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 có 2 người con trai (III.17,18) bị bệnh Wilson đều có 2 đột biến dị hợp tử. Hình 3.22. Trình tự gen của gia đình bệnh nhân mã số WBW120501 3.2. CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH WILSON 3.2.1. Kết quả tách DNA tổng số từ dòng tế bào ối và PCR 3.2.2. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh Wilson Chẩn đoán trước sinh được thực hiện cho những gia đình có tiền sử sinh con bị bệnh Wilson và đã xác định được kiểu gen. Gia đình bệnh nhân được tư vấn di truyền và sàng lọc đột biến đích đã xác định được trên ca chỉ điểm. Phát hiện đột biến gen cho thai nhi được tiến hành trên mẫu DNA tách từ dòng tế bào ối ở tuần thai 16-18 và sau nuôi cấy. Ba thai phụ có tiền sử sinh con mắc bệnh Wilson đã được chẩn đoán trước sinh ở lần mang thai sau (Bảng 3.16). Bảng 3.16. Kết quả chẩn đoán trước sinh Mã bệnh nhân Kiểu gen Exon Thể đột biến Kết luận AFW160501 Con đầu* S105X/S105X 2 Bố S105X/N 2 Mẹ S105X/N 2 Con thứ 2 S105X/S105X 2 Thai S105X/N Dị hợp tử Mang gen bệnh AFW151105 Con đầu* S105X/S105X 2 Bố S105X 2 Mẹ S105X 2 Con thứ 2 S105X/N 2 Thai S105X/S105X Đồng hợp tử Bị bệnh AFW150804 Con đầu P1052L/P1273Q 14/18 Bố P1052L/N 14 Mẹ P1273Q/N 18 Con thứ 2 P1052L/N 14 Thai P1273Q/N 18 Dị hợp tử Mang gen bệnh Chú thích: * bệnh nhân đã tử vong Qua phân tích kết quả giải trình tự gen ATP7B cho thấy, 2/3 thai nhi có kiểu gen dị hợp tử đột biến trong đó có 1 thai nhi dị hợp tử đột biến S105X và 1 thai nhi dị hợp tử đột biến P1273G; 1/3 thai nhi có kiểu gen đồng hợp tử đột biến S105X. Kết quả chẩn đoán trước sinh của thai phụ mã số AFW151105 Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW151105 Hình 3.24. Phả hệ gia đình thai phụ mã số AFW151105 Nam mang gen bệnh Nữ mang gen bệnh Nam bị bệnh Thai nam bị bệnh Bệnh nhân Bệnh nhân đã tử vong Gia đình thai phụ có mã số AFW151105 có hai người con trai (III1) bị bệnh Wilson và bị đột biến đồng hợp tử. Bố, mẹ (II6,9) và em trai bệnh nhân (III2) là người mang gen bệnh, thai nhi (III3) bị bệnh Wilson. Tại thời điểm nghiên cứu, thai phụ tiếp tục có thai lần 4 và đang chờ chọc hút dịch ối để chẩn đoán trước sinh lần thứ hai. Tuy nhiên, hiện thai vẫn chưa đủ tuần thai để chọc ối và do đó chưa có kết quả phân tích gen ATP7B cho lần mang thai thứ 4. Kết quả xác định đột biến gen ATP7B của gia đình thai phụ mã số AFW151105 Hình 3.25. Trình tự gen của gia đình thai phụ mã số AFW151105 Kết quả giải trình tự gen ATP7B trên hình 3.26 của gia đình thai phụ có mã số AFW151105 cho thấy, bệnh nhân (III1) bị đột biến đồng hợp tử S105X, bố và mẹ của bệnh nhân (II6, II9) bị đột biến dị hợp tử S105X, em trai bệnh nhân (III2) bị đột biến dị hợp tử S105X, thai nhi (III3) bị đột biến đồng hợp tử S105X. Như vậy thai nhi của thai phụ mã số AFW151105 mang gen bệnh Wilson. CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Phát hiện đột biến gen ATP7B cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson 4.1.1. Đặc điểm đột biến gen ATP7B của 78 bệnh nhân Wilson Kiểu gen và tỷ lệ đột biến Nghiên cứu có số lượng bệnh nhân Wilson được phát hiện đột biến gen ATP7B lớn nhất tính đến thời điểm hiện tại được thực hiện trên người Việt Nam (Hoàng Lê Phúc, 2013; Phạm Lê Anh Tuấn và cs, 2017). Đột biến xảy ra rải rác trên cả gen ATP7B khiến cho kiểu gen của bệnh nhân Wilson trong nghiên cứu rất phong phú, dự đoán kiểu hình của bệnh nhân Wilson cũng rất đa dạng. Kiểu gen dị hợp tử kép là phổ biến nhất, trong đó đa số là kiểu gen dị hợp tử kép của đột biến S105X với một đột biến dị hợp tử khác. Đột biến gen ATP7B rất đa dạng, xảy ra trên nhiều vị trí khác nhau của gen ATP7B, vừa có điểm tương đồng và khác biệt so với các nghiên cứu khác. Đột biến điểm thường gặp nhất trên gen ATP7B, tiếp đến là đột biến dịch khung, đột biến vô nghĩa và đột biến cắt, nối và đột biến vô nghĩa. Kết quả phân tích loại đột biến gen ATP7B cả nghiên cứu tương tự với các công bố khác về đột biến gen ATP7B được thực hiện trên bệnh nhân Wilson ở Việt Nam (Phạm Lê Anh Tuấn và cs, 2017; Hoàng Lê Phúc, 2013) và trên các y văn quốc tế (Loudianos và cs, 2002; Ferenci, 2006; Shah và cs, 1997; Zhang và cs, 2011). Tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu là 96,8%, cao hơn so với kết quả nghiên cứu của Trung Quốc (83,8-94,7%), Hàn Quốc (75%), Đài Loan (65,5%) (Kuppala và cs, 2009; Gu và cs, 2003; Li và cs, 2011; Wan và cs, 2006). Nguyên nhân có thể do bệnh nhân trong nghiên được phát hiện muộn, có nhiều biểu hiện lâm sàng nên việc chẩn đoán bệnh sẽ chính xác hơn, và do đó tỷ lệ phát hiện đột biến của nghiên cứu cũng cao hơn so với các nghiên cứu khác trên thế giới. Nhưng tỷ lệ phát hiện đột biến khó đạt tối đa vì ATP7B là một gen có kích thước lớn và đột biến thường xảy ra rải rác khắp toàn bộ gen, vùng intron của gen rất dài và hiện vẫn chưa thể nghiên cứu hết nên việc phát hiện đột biến rất khó khăn (Mak và cs, 2008; Wan và cs, 2006; Zhang và cs, 2011). Ngoài ra, bệnh nhân Wilson có thể có đột biến hiếm gặp như mất đoạn toàn bộ exon, đột biến vùng promoter của gen ATP7B, 3 biến thể cùng gây bệnh và rối loạn đơn nhân (Chang và cs, 2017), hoặc các mất đoạn lớn không thể xác định được bằng phương pháp giải trình tự gen (Wu và cs, 1994). Những bất thường trên gen ATP7B chưa phát hiện cũng có thể nằm sâu trong các vùng intron của gen ATP7B (Wang và cs, 2011; Maleki và cs, 2013), và có thể có ở vùng cắt nối để tạo thành mRNA hoàn chỉnh. Sai sót ở đầu 3’ polyadenyl của gen phân tích cũng có thể là một nguyên nhân gây ra bệnh Wilson. Khiếm khuyết trong vùng hỗ trợ cắt nối exon (enhancers-ESE’s) có thể là một khả năng làm đột biến chức năng mà không làm thay đổi chuỗi peptid, hoặc do đột biến ở gen khác, chẳng hạn như MURR1, ATOX1, COMMD1 (Zhang và cs, 2011; Bost và cs, 2012). Cũng có khả năng là đột biến xảy ra trên một số xóa đoạn lớn hoặc sắp xếp lại gen nên không thể phát hiện được (Vrabelova và cs, 2005), hoặc các đa hình trên gen ATP7B và các yếu tố biểu sinh cũng có thể ảnh hưởng đến biểu hiện kiểu hình của bệnh Wilson (Lutsenko, 2014). Đột biến thường gặp và vùng nóng trên gen ATP7B S105X là loại đột biến thường gặp nhất trong nghiên cứu và có thể là đột biến phổ biến ở người Việt Nam mắc Wilson trong khi đột biến phổ biến nhất ở khu vực châu Á là R778L (Ferenci, 2006). Tiếp đến, nghiên cứu cũng đã xác định được một số đột biến có tỷ lệ phát hiện cao, bao gồm: I1148T, IVS14-2A>G, L1371P, T850I và V176SfsX28. Đột biến thường gặp trên gen ATP7B ở châu Á cũng tùy thuộc vào từng quốc gia khác nhau, chẳng hạn như Trung Quốc là P992L, T925M hay Hàn Quốc là A874V, L1083F, N1270S (Zhang và cs, 2011). Đột biến S105X trên gen ATP7B có tỷ lệ phát hiện cao nhất trong nghiên cứu vì đối tượng của nghiên cứu là bệnh nhi, nên có biểu hiện bệnh sớm hơn. Đột biến S105X là một đột biến tạo mã kết thúc sớm trên exon 2 của gen ATP7B và đã ảnh hưởng đến vị trí liên kết đồng 1. Vùng liên kết với kim loại có vai trò then chốt trong việc tiếp nhận đồng từ ATOX1 thông qua tương tác giữa protein và protein nhưng những vị trí này ảnh hưởng không đồng đều đến hoạt động của ATP7B, trong đó vùng liên kết với kim loại 5 và 6 có ảnh hưởng lớn hơn đến việc kích hoạt xúc tác ATP7B so với vùng liên kết với kim loại 1-4 (Chang và cs, 2017, Chen và cs, 2015; Brewer và cs, 2005). Đột biến S105X xảy ra ngay trên exon 2, là vùng liên kết đồng nhưng đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình dịch mã, tạo thành sản phẩm protein bất thường hoặc có thể không có sản phẩm của dịch mã, do đó đột biến S105X đã ảnh hưởng đến biểu hiện bệnh sớm hoặc liên quan đến mức độ nghiêm trọng đến kiểu hình của bệnh. Bởi vậy, bệnh nhân Wilson có đột biến S105X thường được phát hiện sớm. Trong khi đó, đột biến này rất hiếm trong nghiên cứu khác trên người Việt Nam bởi đối tượng trong nghiên cứu của Phan Tôn Hoàng đa dạng hơn và việc phát hiện đột biến gen ATP7B trong nghiên cứu của Hoàng Lê Phúc bỏ qua không sàng lọc đột biến trên exon 2, do vậy 2 nghiên cứu này có tỷ lệ phát hiện đột biến thấp hơn và không phát hiện được đột biến thường gặp trên gen ATP7B (Phan Tôn Hoàng, 2015; Hoàng Lê Phúc, 2013). Vùng thường xảy ra đột biến trong nghiên cứu cũng tương đối khác so với các nghiên cứu trên người Châu Á. Theo đó, exon 2, exon 16, exon 8, exon 4 và intron 14 là những vùng nóng của gen ATP7B trên bệnh nhi mắc Wilson, trong khi vùng nóng của gen ATP7B trong nghiên cứu không giống với các nước khác ở châu Á. Hầu hết đột biến gen ATP7B ở người Đài Loan xảy ra trên các exon 8, 11, 12, 13, 16, 17 và 18. Tỷ lệ phát hiện của các exon này là 61,8% (Wan và cs, 2006); ở Trung Quốc là exon 8, 1,2, 13, 16, chiếm 60,5 - 74% (Wu và cs, 2000; Gu và cs, 2003; Liu và cs, 2004; Li và cs, 2011; Wan và cs, 2006); ở Hàn Quốc, đột biến trên các exons 8, 11, và 18 chiếm 59,8 - 71,4% (Park và cs, 2007); ở Nhật Bản, đột biến trên exon 5, 8, 12,13, và 18 chiếm 60,9-70% (Okada và cs, 2000); exon 13 và 18 là hai exon thường xảy ra đột biến ở bệnh nhân Wilson vùng Đông Bắc Ấn Độ, với tỷ lệ lần lượt là 27% và 14%; exon 14 là vùng nóng trên gen ATP7B ở người Iran (Zali và cs, 2011). Exon 11, 12, 13 là các exon có tỷ lệ phát hiện đột biến thấp nhất trong nghiên cứu nhưng đây là vị trí có tỷ lệ phát hiện đột biến cao trong nghiên cứu trên bệnh nhân Wilson ở Hàn Quốc, Đài Loan (Mak và cs, 2008; Zhang và cs, 2011; Wan và cs, 2006; Wu và cs, 2000; Gu và cs, 2003; Li và cs, 2011. Cỡ mẫu của nghiên cứu còn hạn chế, kiểu hình của bệnh nhân chưa đa dạng, chủ yếu là thể bệnh gan, do vậy kết quả nghiên cứu chưa thể khái quát được chính xác đặc điểm đột biến trên gen ATP7B ở người Việt Nam. Một trong những hạn chế của nghiên cứu là chưa thu thập được mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân Wilson có biểu hiện muộn, bệnh nhân Wilson ở khu vực miền nam và đặc biệt là vùng dân tộc thiểu số. Đó có thể là lý do tại sao nghiên cứu chưa phát hiện đột biến ở một số vùng gen khác của gen ATP7B, bao gồm vùng UTR, exon 3-6, exon 7, 9, 15-17, exon 21 (Phạm Lê Anh Tuấn và cs, 2017), hoặc vùng gen rất hiếm xảy ra đột biến ở người Việt Nam. Vì vậy, việc tiếp tục thu thập mẫu trên qui mô lớn hơn và tiến hành các nghiên cứu sâu hơn có thể được thực hiện trong các nghiên cứu tiếp theo để đưa ra được đặc điểm đột biến gen ATP7B cho người Việt Nam Việc xác định được vùng nóng của gen ATP7B ở bệnh nhi mắc Wilson ở Việt Nam có ý nghĩa quan trọng trong xây dựng qui trình phát hiện đột biến và chẩn đoán bệnh, giúp bệnh nhân được chẩn đoán sớm và điều trị sớm, hạn chế tối đa các biến chứng của bệnh. Dựa trên kết quả phân tích đột biến, nghiên cứu đã xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen ATP7B cho bệnh nhi mắc Wilson tại Bệnh viện Nhi Trung Ương gồm 4 bước. Tại mỗi bước, khi xác định được đột biến trên cả 2 alen, xét nghiệm sẽ dừng lại và đưa ra kết quả để kết luận chẩn đoán bệnh. Ngược lại, bệnh nhân sẽ tiếp tục được làm xét nghiệm các bước tiếp theo. 4.1.3. Ảnh hưởng của các đột biến mới đến chức năng của protein ATP7B Các đột biến mới trên gen ATP7B trong nghiên cứu đều được phát hiện trên bệnh nhân Wilson có kiểu gen dị hợp tử kép, gồm 1 đột biến mới và 1 đột biến dị hợp tử đã khác đã công bố trên thế giới. Trong số đó,4 đột biến mới là đột biến dịch khung, bao gồm H251AfsX19, P868PfsX9, (R723S; H724TfsX34), V1042CfsX79 không cần thực hiện các nghiên cứu chức năng protein do các đột biến trên đã làm thay đổi khung dịch mã, tạo mã kết thúc sớm nên ảnh hưởng đến trình tự chuỗi polypeptid và do đó chắc chắn ảnh hưởng đến chức năng của gen (Chang và cs, 2017; Huster và cs, 2012). Ba đột biến mới trên gen ATP7B còn lại của nghiên cứu bao gồm: F1026Y, IVS6+3A>G và IVS20+3A>G được phân tích và dự đoán ảnh hưởng của những đột biến này đến chức năng của gen bằng các chương trình tin sinh. Theo đó, F1026Y là đột biến thay thế Phenylalanin (acid amin không phân cực, kị nước, trung hòa về điện) tại vị trí 1026 trên chuỗi polypeptide của protein ATP7B thành Tyrosin (acid amin phân cực, kỵ nước, không tích điện). Mặc dù Phenylalanin là tiền chất của Tyrosin nhưng vì tính chất của 2 acid amin khác nhau, trọng lượng phân tử khác nhau nên đã ảnh hưởng đến cấu trúc protein do đột biến có thể đã ra các liên kết hydro mới giữa cấu trúc hóa học của acid amin Tyrosin với các acid amin bên cạnh nó. Bởi vậy F1026Y có thể là một đột biến gây bệnh Wilson (probably damaging) do ảnh hưởng đến vùng liên kết với ATP. Rõ ràng, biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân Wilson có đột biến này rất điển hình: bệnh nhân có kiểu hình thể thần kinh, có vòng KF, đồng niệu/24 giờ và ceruloplasmin và bệnh nhân cũng đã đủ điểm chẩn đoán bệnh Wilson theo thang điểm Leipzig (Ferenci và cs, 2012). Đột biến IVS6+3A>G , IVS20+4A>G đã làm thay đổi vị trí cắt nối mRNA. Cả 2 đột biến này đều được phát hiện trên bệnh nhân Wilson đã đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh và đi kèm với 1 đột biến dị hợp khác đã được chứng minh là đột biến gây bệnh. Tuy nhiên, cả 3 đột biến trên đều cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn ở mức độ protein (Kenney và cs, 2007; Luoma và cs, 2010). 4.1.2. Ý nghĩa của sàng lọc đột biến cho các thành viên gia đình bệnh nhân Wilson Phát hiện sớm người bệnh chưa có biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán xác định bệnh Wilson Nghiên cứu đã phát hiện thêm 13 bệnh nhân mắc Wilson nhờ sàng lọc đột biến đích. Trong đó, 8 bệnh nhân đã có b