Tóm tắt Luận án Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển miền trung, Việt Nam

đánh giá và kết quả thu được cho thấy protein PI- QT tái tổ hợp từ E. coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế ɑ- chymotrypsin và protein từ P. pastoris thể hiện hoạt tính ức chế trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Hải miên và vi sinh vật liên kết hải miên 1.1.1. Giới thiệu về hải miên 1.1.2. Vi sinh vật liên kết hải miên 1.2. Sơ lược về metagenomics 1.3. Chất ức chế protease (PIs) 1.3.1. Sơ lược về protease 1.3.2. Chất ức chế protease và phân loại 1.3.3. Cơ chế hoạt động của PIs 1.3.4. Ứng dụng của chất ức chế protease 1.3.5. Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sinh vật liên kết hải miên trong và ngoài nước 1.4. Hệ biểu hiện gen ngoại lai Escherichia coli và Pichia pastoris CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu Các mẫu hải miên được thu thập tại biển Quảng Trị, Việt Nam và một số vật liệu khác sử dụng trong nghiên cứu. 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu Vi sinh vật liên kết với hải miên 2.1.3. Hóa chất 4 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu được mua chủ yếu từ các hãng uy tín như Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ). 2.1.4. Máy móc thiết bị Sử dụng máy móc thiết bị của Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện NCKH Miền Trung, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và một số máy móc của Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam. 2.1.5. Dung dịch và môi trường sử dụng Môi trường sử dụng trong nuôi cấy và biểu hiện gen trong E. coli: Luria-Bertani (LB). Môi trường sử dụng trong biến nạp và biểu hiện gen ngoại lai ở nấm men P. pastoris (theohướng dẫn của Pichia Expression Kit). Dung dịch được sử dụng trong điện di DNA: TAE 1X, loading dye 6X, ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS-PAGE: Bis-acrylamide 30%; Đệm Tris HCl 1,5M pH 8,8; Đệm Tris HCl 1M pH 6,8; Đệm Tris HCl 0.5M pH 6,8; SDS 10%; APS 10%; TEMED 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp tách DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Tách chiết DNA tổng số của VSV liên kết với hải miên theo phương pháp của Abe và cộng sự (2014) với một số cải tiến nhỏ cho phù hợp với điều kiện của Việt Nam. 2.2.2. Định danh hải miên bằng sinh học phân tử (Medlin et al., 1988) 2.2.3. Phân tích dữ liệu metagenomics Giải trình tự DNA metagenome bằng hệ thống Illumina HiSeq2500(BaseClear - Hà Lan). Dữ liệu thu được sẽ được phân tích bằng các phần mềm tin sinh học. 5 2.2.4. Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên và thiết kế plasmid mang gen PIs Gen PI-QT tổng hợp dựa trên trình tự gen contig 000046 từ CSDL metagenomics QT2, và tách dòng vào vectơ pUC57, có thiêt kế trình tự của enzyme giới hạn EcoRI và NotI ở 2 đầu gen (GenScipt, Mỹ). Tiếp theo, vectơ pUC57 (Thermo, Mỹ) có chứa gen PI-QT và vectơ biểu hiện pET-32a (+) (Invitrogen, Mỹ) đã được cắt bằng enzyme giới hạnEcoRI và NotI (Fermentas, Lithuania). Sau đó, gen PI-QT đã được tinh sạch và đưa vào vectơ biểu hiện pET-32a(+) (biểu hiện trong E. coli) và pPIC9 (biểu hiện trong P. pastoris) bằng cách sử dụng enzyme T4 ligase (Thermo, Mỹ). 2.2.5. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E. coli BL21(DE3) Phương pháp biến nạp, biểu hiện và tối ưu hóa quá trình biểu hiện gen trong tế bào E. coli (Đỗ Thị Huyền et al., 2008; Nguyễn Thị Quý et al., 2013). Phản ứng lai kháng thể (Western blot) (theo hướng dẫn của hãng Invitrogen). Tinh sạch protein PIs tái tổ hợp: Protein tái tổ hợp PIs được tinh sạch theo hướng dẫn của Ni-NTA Purification System (Novex by life technologies) với một số cải biến nhỏ. Loại bỏ đuôi peptide TRx-His-tag ra khỏi protein tái tổ hợp (Theo hướng dẫn của Novagen). Nhận diện và phân tích protein bằng phương pháp proteomics/ tin sinh học. 2.2.6. Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp trong hệ biểu hiện nấm men Pichia pastoris Theo hướng dẫn của Pichia expression kit – Invitrogen với một số thay đổi nhỏ phù hợp cho quá trình biểu hiện. 6 2.2.7. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease(Sapna., 2013; Jiang et al., 2011) 2.2.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của một số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp(Sapna., 2013). 2.2.9. Phân tích thống kê Các thí nghiệm được thực hiện ba lần và được biểu thị bằng trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (SEM). Phân tích thống kê và phân tích phương sai một chiều được thực hiện bằng phần mềm ANOVA, sau đó là các thử nghiệm so sánh nhiều lần bằng phần mềm SPSS v.22 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Kết quả được coi là có ý nghĩa tại P <0,05. CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thu thập mẫu hải miên Bằng phương pháp SCUBA, đã thu thập được 8 mẫu hải miên tại biển Quảng Trị. Hải miên được thu thập tại tọa độ là 107°07'06.0"E; 17°04'50.2"N. Các mẫu được lưu trữ trong 30 % glycerol, bảo quản trong đá, vận chuyển về phòng thí nghiệm và tiến hành tách chiết DNA của vi sinh vật liên kết hải miên. 3.2.Kết quả tách chiết DNA metagenome 3.2.1.Tách chiết DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị DNA tổng số của VSV liên kết hải miên đã được tách chiết từ 8 mẫu hải miên thu thập tại biển Quảng Trị, Việt Nam. Kết quả cho thấy lượng DNA tách được ở mỗi mẫu khác nhau.Mẫu tách được nhiều DNA nhất là QT2 và độ tinh sạch cao nhất (Hình 3.1, Bảng 3.1). 7 Bảng 3.1.Chất lượng của DNA tổng số tách từ các mẫu hải miên biển Quảng Trị TT Mẫu DNA (ng/µL) A260/A230 A260/A280 1 QT2 202,5 2,0 1,80 2 QT3 165,1 1,8 1,71 3 QT4 160,9 1,83 1,54 4 QT5 178,7 1,82 1,32 5 QT6 39,8 1,9 1,62 6 QT7 73,5 1,8 1,72 7 QT8 125,8 1,77 1,41 8 QT9 36,5 1,78 1,70 Đã lựa chọn DNA tổng số của VSV liên kết hải miên QT2 biển Quảng Trị (nồng độ DNA: 202,5 ng/µl, độ tinh sạch A260/A280=1,80) để giải trình tự metagenomics. QT9 QT8 QT7 QT6 QT5 QT4 QT2 QT3 M Hình 3.1. Điện di đồ sản phẩm tách DNA của vi sinh vật liên kết hải miên biển Quảng Trị (M: Marker 100 bp của hãng Thermo) 8 3.1.2. Định danh hải miên QT2 bằng sinh học phân tử Đoạn gen 18S rRNA dài khoảng 1,9 kb của mẫu hải miên QT2 đã được khuếch đại thành công từ DNA tách chiết. Kết quả giải trình tự gen bằng máy ABI PRISM 3100 và so sánh trình tự nhận được bằng chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) với các trình tự gen 18S rRNA khác trên NCBI (National Center for Biotechnology Information) cho thấy đoạn gen 18S rRNA của hải miên QT2 tương đồng 99,9 % với trình tự gen tương ứng của hải miên Spheciospongia vesparium có mã số AY734440. Vì vậy, chúng tôi đặt tên cho mẫu QT2 là Spheciospongia vesparium QT2. 3.3. Xây dựng cơ sở dữ liệu DNA metagenome của vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 bằng tin sinh học 3.3.1. Lắp ráp reads của DNA metagenome Sau khi giải trình tự shortgun metagenome toàn bộ của mẫu QT2 (Base Clear, Hà Lan) và tinh sạch dữ liệu bằng phần mềm Trimmomatic, thu được hơn 44 triệu đoạn trình tự paired reads. Dữ liệu tinh sạch được sử dụng lắp ráp de novo metagenome sử dụng phần mềm SPAdes. Tổng kích thước hệ lắp ráp thu được là khoảng 418 Mb bao gồm 102.236 contigs. Contig có kích thước dài nhất là hơn 855 kb, contigs nhỏ nhất là 1.000 bp, độ dài trung bình là 4.089 bp. Gần 90 % số đoạn trình tự có thể ánh xạ ngược lại với hệ gen lắp ráp. Kết quả nhận được cho thấy các contigs chủ yếu phân bố trong khoảng từ 1.000 đến 100.000 bp. Tỷ lệ GC % trong hệ gen của mẫu QT2 là 61,82 %. 3.3.2. Kết quả dự đoán gen Kết quả dự đoán gen bằng phần mềm Prodigal và MetageneMark nhận được lần lượt là khoảng 366 Mb (386.416 ORFs) và 361 Mb (380.886 ORFs). Kết quả dự đoán gen của hai phần mềm khá tương đồng nhau, với gen lớn nhất có kích thước là 66.639 bp, độ dài trung bình là 864 bp và tỷ lệ GC là khoảng hơn 62 %. Sau khi loại bỏ tất cả 9 những gen có kích nhỏ hơn 250 bp, sử dụng phần mềm CD-HIT với mức độ tương đồng 90 %, thu được tập gen cuối cùng có tổng kích thước gần 360 Mb bao gồm 372.732 gen đồng nhất (unified genes), trong đó có 262.159 gen hoàn chỉnh (chiếm 70,33 %) (gen có đủ mã mở đầu và mã kết thúc); 53.162 (14,26 %) gen thiếu mã kết thúc 3’; 49.569 (13,3 %) gen thiếu mã mở đầu 5’ và số lượng gen thiếu cả mã mở đầu và mã kết thúc chỉ có 7.842 gen, chiếm 2,1 %. Phân bố độ dài cho thấy gen dự đoán chủ yếu có kích thước từ khoảng 250 bp đến khoảng 2.000 bp. 3.3.3. Kết quả chú giải và phân loại chức năng gen Kết quả chú giải bằng các cơ sở dữ liệu cho thấy, với tổng số 372.732 trình tự gen (axit amin), có 360.564 (96,74 %) gen được chú giải trên cở sở dữ liệu NR; 266.553 gen được chú giải trên Swiss-Prot chiếm 71,51 %; 274.632 gen chiếm 73,68 % được chú giải trên cơ sở dữ liệu COG; chỉ có 11.974 (3,21 %) gen được chú giải trên cơ sở dữ liệu CAZy; số gen được chú giải trên cơ sơ dữ liệu GO là 165.552 gen chiếm 44,42 %, 244.436 gen được chú giải trên cơ sơ dữ liệu KEGG chiếm 65,58 %; đối với cơ sở dự liệu Pfam, có 273.826 (73,46 %) gen được chú giải. 3.3.4. Đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium QT2 Đã nhận dạng 10 ngành, 21 lớp, 36 bộ, 22 họ và 16 chi vi khuẩn liên kết với hải miên Spheciospongia vesparium QT2. 3.3.5. Khai thác gen có hoạt tính ức chế protease (PIs) dựa trên cơ sở dữ liệu (CSDL) metagenomics Bằng các công cụ tin sinh học, đã khai thác được 50 gen hoàn chỉnh liên quan đến chất ức chế protease từ CSDL metagenomics QT2 (Quảng Trị) (Bảng 3.8). Trong đó có 28 gen, chiếm 56 % được chú giải 10 thuộc họ Serpin (Serine protease inhibitor); còn lại 22 gen (44 %) thuộc nhóm Inter-alpha-trypsin inhibitor. Gen ngắn nhất là 198 bp, mã hóa cho 66 axit amin; gen dài nhất là 2406 bp, mã hóa cho 802 axit amin. Một số gen cũng đã được xác định là gen mới ở Việt Nam Bảng 3.8. Kết quả sàng lọc các gen có hoạt tính protease inhibitor từ CSDL metagenomics QT2 TT Contig Prokka A.a Uni_1 UniProtKB_ product Uni_ score Uni_ evalue 1 00016 5808 442 Q5RB37 ITIH chain H3 89.4 1.00E-17 2 000019 06418 323 O02668 ITIH chain H2 61.2 5.00E-09 3 000019 0645 398 Q61703 ITIH chain H2 71.6 4.00E-12 4 000046 10704 429 Q9D154 Serpin 184 6.00E-52 5 000046 10705 405 Q5BIR5 Serpin 214 1.00E-63 6 000127 20087 328 Q3T052 ITIH chain H4 62 3.00E-09 7 000172 24210 400 Q8BJD1 ITIH chain H5 71.6 4.00E-12 8 000213 27784 418 Q5BIR5 Serpin B8 216 5.00E-64 9 000213 27785 405 Q99574 Neuroserpin 209 2.00E-61 10 000314 34813 736 A6X935 ITIH 171 6.00E-43 11 000433 41698 419 Q5BIR5 Serpin B8 231 6.00E-70 12 000631 52340 325 Q3T052 ITIH chain H4 58.9 3.00E-08 13 000726 56621 398 Q61703 ITIH chain H2 57 2.00E-07 14 000981 67673 428 Q90935 Neuroserpin 214 1.00E-62 15 001114 72799 419 Q5BIR5 Serpin B8 219 4.00E-65 16 001390 82416 386 A6X935 ITIH 114 4.00E-26 17 001690 91580 454 Q5BIR5 Serpin B8 152 5.00E-40 18 001737 93032 412 Q5BIR5 Serpin B8 214 1.00E-63 19 001737 93033 223 Q99574 Neuroserpin 87.8 6.00E-19 20 001813 95168 412 Q99574 Neuroserpin 207 3.00E-60 21 002069 102253 280 Q8PTN8 Serpin 175 7.00E-50 22 002236 106102 324 A2VE29 ITIH chain H5 64.7 4.00E-10 23 002339 108516 478 Q14624 ITIH chain H4 63.5 2.00E-09 24 002592 114432 355 Q90935 Neuroserpin 197 3.00E-57 25 002838 119867 334 Q14624 ITIH chain H4 55.5 3.00E-07 26 003102 125566 401 Q8BJD1 ITIH chain H5 58.5 5.00E-08 27 003892 140659 323 Q3T052 ITIH chain H4 67 7.00E-11 28 004584 152589 631 Q61703 ITIH chain H2 66.2 6.00E-10 29 005997 173538 430 Q8PTN8 Serpin 206 2.00E-59 30 006820 184178 417 Q5BIR5 Serpin B8 237 5.00E-72 11 31 007047 186946 497 Q61703 ITIH chain H2 122 2.00E-28 32 007181 188591 146 Q96P15 Serpin B11 105 5.00E-26 33 007964 197295 66 Q90935 Neuroserpin 51.6 7.00E-08 34 008443 202257 443 P50453 Serpin B9 213 2.00E-62 35 010618 222724 382 Q8BJD1 ITIH chain H5 64.3 8.00E-10 36 012483 237228 378 Q9JK88 Serpin I2 57 1.00E-07 37 015758 258680 430 Q9S7T8 Serpin-ZX 143 1.00E-36 38 020504 283125 394 Q90935 Neuroserpin 73.2 8.00E-13 39 020772 284248 402 Q90935 Neuroserpin 213 1.00E-62 40 020806 284376 802 Q61703 ITIH chain H2 142 2.00E-33 41 020909 284844 362 A6X935 ITIH 104 6.00E-23 42 021896 288956 722 P56652 ITIH chain H3 170 8.00E-43 43 024785 300295 303 Q29052 ITIH chain H1 55.5 3.00E-07 44 030105 318139 717 Q9GLY5 ITIH chain H3 116 2.00E-25 45 033816 328453 391 B4USX2 Serpin B10 220 1.00E-65 46 038363 339464 376 Q9CQV3 Serpin B11 82 7.00E-16 47 040171 346561 423 Q99574 Neuroserpin 211 1.00E-61 48 044964 352966 457 Q5JJ64 Serpin 249 7.00E-76 49 060339 377096 149 Q9UIV8 Serpin B13 66.6 4.00E-12 50 067320 385523 98 Q5NBM Putative serpin 66.2 1.00E-12 Chú thích: ITIH: Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy; Serpin: serine protease inhibitor; I: Inhibitor; 3.4. Nghiên cứu biểu hiện gen ức chế protease (PIs) trong hệ Escherichia coli Dựa vào kết quả khai thác gen PIs từ CSDL metagenomics QT2, một số cặp mồi để tách dòng các gen ức chế protease thuộc họ serpin mong muốn đã được thiết kế, sử dụng template là DNA metagenome mẫu QT2 bằng phương pháp PCR. Tuy nhiên, mặc dù đã thay đổi rất nhiều thông số trong chu trình PCR nhưng vẫn không tách được dòng gentheo phương pháp PCR thông thường. Vì vậy, dựa vào kết quả sàng lọc gen (Bảng 3.8), trình tự gen contig 000046, contig000433 và contig020504 đã được tổng hợp (GenScript) và đưa vào vector tách dòng pUC57. Các gen lựa chọn ngoài là gen được chú giải thuộc họ serpin (ức chế serine protease) còn có một số ưu điểm hơn các contig khác như: gen mới, trình tự gen hoàn chỉnh (có độ tương 12 đồng dưới 85 % với các gen liên quan đến chất ức chế protease đã được công bố trên ngân hàng gen NCBI), trọng lượng protein dự đoán khoảng 30-55 kDa (thuận tiện cho quá trình biểu hiện, tinh sạch và thu hồi protein tái tổ hợp). Ngoài ra, các contig này đều có giá trị Uni- evalue cao và tin cậy. Các contig 000046, contig000433 và contig020504 và được đặt tên là PI-QT, PI-QT1 và PI-QT2, tương ứng. Trong quá trình nghiên cứu, đã thiết kế thành công các vectơ biểu hiện pET-32a(+) trong hệ E. coli và vectơ pPIC9 biểu hiện trong P. pastoris mang 3 gen PI-QT, PI-QT1 và PI-QT2. Tuy nhiên, các gen PI-QT1 và PI-QT2 biểu hiện protein tái tổ hợp nằm trong cặn tế bào ở dạng không tan trong hệ E.coli BL21 (DE3) và không biểu hiện được trong hệ P. pastoris SDM1168 dưới các điều kiện nghiên cứu. Chỉ có gen PI-QT biểu hiện trong cả hệ E. coli và P. pastoris và protein tái tổ hợp nhận được ở trạng thái tan. Vì vậy, trong luận án này, chúng tôi chỉ báo cáo về quá trình biểu hiện gen PI-QT trong 2 hệ biểu hiện trên. Gen PI-QT đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số MK359987.1. 3.4.1. Phân tích trình tự a xít amin và cây phân loại của protein PI- QT Gen PI-QT có kích thước 1287 bp, mã hóa cho 429 axít amin, trọng lượng protein dự đoán khoảng 50 kDa, điểm đẳng điện theo lý thuyết là 4.56. So sánh trình tự axít amin của PI-QT với các trình tự trong cơ sở dữ liệu NCBI cho thấy protein PI-QT tương đồng với các serpin khoảng 50 – 55 % và peptide PI-QT có các vùng bảo thủ giống với các trình tự của protein này trong vi sinh vật. Cây phân loại protein dựa trên phương pháp neighbor-joining giữa protein PI-QT với 1 số loại serpin vi khuẩn khác đã được xây dựng. Dựa trên dữ liệu so sánh cho thấy protein PI-QT là một loại serpin vi khuẩn mới. Cấu trúc protein của PI-QT được dự đoán theo mô hình SWISS- MODEL và (PS) 2-v2. 13 PI-QT Gen PI-QT cũng đã được đăng ký trên ngân hàng gen NCBI với mã số MK359987.1 3.4.2. Thiết kế vectơ biểu hiện pET-32a(+) mang gen PIs Đã gắn thành công gen PI-QT vào vectơ biểu hiện pET-32a(+). 3.4.3. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli chủng BL21(DE3) Vectơ tái tổ hợp pET-32a (+)/PI-QT đã được biến nạp thành công vào tế bào khả biến E.coli BL21 (DE3) bằng sốc nhiệt và được ủ trong môi trường LB/amp qua đêm. Sau đó, lựa chọn một vài khuẩn lạc màu trắng ủ trong môi trường LB/amp cho đến khi OD600 khoảng 0,8 - 1,0. Tiếp theo, IPTG được thêm vào môi trường nuôi cấy và ủ ở 37 oC trong 4 h. Phân tích gel SDS-PAGE của protein biểu hiện cho thấy sự hiện diện của băng protein được biểu hiện quá mức có kích thước khoảng 64 kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết của protein PI-QT dung hợp với đuôi peptide TRx-his-tag (Hình 3.15, giếng 3, 5, 7). Trong khi đối chứng âm là dòng chỉ mang vectơ pET-32a(+) (Hình 3.15, giếng 1) và dòng mang vectơ tái tổ hợp nhưng không được cảm ứng IPTG đều không có băng protein này (Hình 3.15, giếng 2, 4 và 6). Hình 3.15: Protein tái tổ hợp điện di trên gel SDS-PAGE Giếng M: Marker protein của hãng Novagen; giếng 1: E. coli BL21 (DE3)/pET-32a(+); giếng 2, 4, 6: E. coli BL21(DE3)/[pET-32a(+) /PI- 14 QT] không cảm ứng IPTG dòng 1, 2, 3, tương ứng; giếng 3, 5, 7: E. coli BL21(DE3)/[pET-32a(+) /PI-QT] cảm ứng IPTG dòng 1, 2, 3, tương ứng. Tuy nhiên protein tái tổ hợp thu được tồn tại chủ yếu ở trạng thái không tan. 3.4.4. Nghiên cứu điều kiện thích hợp nhất để thu protein tái tổ hợp PI-QT ở trạng thái tan cao nhất Xác định nồng độ IPTG phù hợp cho quá trình tạo protein tái tổ hợp: Khảo sát khả năng biểu hiện của protein PI-QT ở các nồng độ IPTG cảm ứng 0; 0,5; 1,0; 1,5 mM, mật độ tế bào trước khi cảm ứng OD600 khoảng 0,8-1; cảm ứng ở 37 o C, thời gian cảm ứng 4 h. Phân tích gel SDS-PAGE 12,6 % cho thấy protein PI-QT biểu hiện được khi cảm ứng IPTG 1,0 mM. Ở các nồng độ IPTG khác (0; 0,5 và 1,5 mM) không thấy sự xuất hiện của băng biểu hiện vượt mức. Nhưng protein tái tổ hợp thu được vẫn tồn tại chủ yếu ở trạng thái không tan. Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự tạo thành protein tái tổ hợp ở trạng thái tan Biểu hiện của protein tái tổ hợp cũng đã được nghiên cứu ở các nhiệt độ khác nhau (20, 25, 28 và 30 oC), OD600 trước khi cảm ứng khoảng 0,8-1; nồng độ IPTG cảm ứng 1 mM. Kết quả thu được cho thấy, lượng protein tái tổ hợp ở trạng thái tan nhiều nhất (khoảng 45 %) khi protein tái tổ hợp được biểu hiện ở 25 oC, trong khi ở 20 oC không thấy sự hiện diện của băng protein vượt mức. Ở 28 oC và 30 oC, lượng protein tái tổ hợp được sản xuất cao hơn so với khi biểu hiện ở 20 và 25 o C; tuy nhiên, chỉ một lượng nhỏ protein tái tổ hợp được phát hiện ở phần hòa tan (khoảng 20 % tổng protein). Ảnh hưởng của mật độ tế bào trước khi cảm ứng đến sự biểu hiện protein PI-QT dạng tan 15 Sự biểu hiện của protein tái tổ hợp ở các mật độ tế bào cảm ứng khác nhau (OD600 = 0,4, 0,5, 0,6 và 0,7) đã được nghiên cứu. Kết quả cho thấy ở OD600 = 0,4 không quan sát thấy băng protein biểu hiện quá mức. Hàm lượng protein PI-QT tạo ra nhiều nhất và ở trạng thái tan cao nhât khi OD600 trước cảm ứng khoảng 0,6-0,7 (409 mg/L và tan khoảng ≥ 90 %) (Hình 3.19). Hình 3.19: Ảnh hưởng của mật độ tế bào cảm ứng lên biểu hiện của protein tái tổ hợp. (A) Điện di protein trên gel SDS - PAGE, giếng M: thang protein (Thermo, Mỹ); Giếng 1: protein tổng số của E. coli BL21 (DE3) [pET- 32a (+)/PI-QT]; giếng 2: protein của E. coli BL21 (DE3) [pET-32a (+)/PI-QT] ở dạng không hòa tan; giếng 3: protein của E. coli BL21 (DE3) [pET-32a (+)/PI-QT] ở dạng hòa tan. (B) Tổng số protein và tỷ lệ phần trăm của protein trong phần hòa tan ở mật độ tế bào trước cảm ứng. 3.4.5.Tinh sạch protein tái tổ hợp PI-QT trong E. coli và nhận diện bằng khối phổ Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực Ni-NTA agarose và thu hồi protein ở các nồng độ imidazol 100, 200, 250, 300 và 500 mM. Kết quả điện di SDS-PAGE 12,6 % cho thấy protein quan mg/L % 16 tâm thu hồi được nhiều nhất ở nồng độ muối 100 và 300 mM imidazole, tuy nhiên các phân đoạn này còn lẫn nhiều loại protein khác. Ở phân đoạn protein được thu hồi với đệm đẩy cột chưa imidazole 500 mM thì lượng protein quan tâm ít hơn nhưng lại có độ tinh sạch cao hơn (Hình 3.20). Hình 3.20: Các phân đoạn protein sau khi sắc ký trên cột sắc ký ái lực Ni-NTA (A): Giếng L: Marker protein của hãng Thermo; Giếng 10, 11, 12 lần lượt là protein được thôi ra khỏi cột khi sử dụng đệm đẩy cột imidazole 100 mM, 300 mM, 500 mM, tương ứng. (B): Đồ thị biểu thị độ tinh sạch và hàm lượng protein nhận được Để khẳng định protein tinh sạch là protein PI-QT, chúng tôi đã thực hiện phản ứng lai western blot, sử dụng kháng thể anti-TRx. Kết quả cho thấy, trên màng lai xuất hiện 1 băng protein có kích thước khoảng 64 kDa, tương ứng với kích thước lý thuyết của PI-QT dung hợp (Hình 3.21a). Ngoài ra, thrombin được sử dụng để loại bỏ đuôi dung hợp (TRx-His-tag) ra khỏi protein tái tổ hợp. Điện di đồ SDS- PAGE 12,6 % nhận được 2 băng có kích thước khoảng 50 kDa và 14 kDa, tương ứng với kích thước của protein PI-QT và của đuôi peptide TRx-His-tag (Hình 3.21b). Như vậy, protein PI-QT ở trạng thái sạch (không liên kết) đã nhận được. 17 Hình 3.21. Kết quả Western blot và loại peptide TRx-His-tag ra khỏi protein PI-QT bằng thrombin trên gel SDS-PAGE 12,6 %. (A) M: Marker protein của hãng Bio-Basic; 1: Protein dung hợp PI- QT/TRx-His-tag lai với kháng thể anti-TRx; (B) Marker protein của hãng Bio-Basic; 1: Protein dung hợp PI-QT/TRx-His-tagtrước khi cắt bằng thrombin; 2: Protein dung hợp PI-QT/TRx-His-tag cắt bằng thrombin. Nhận diện protein quan tâm bằng khối phổ MS, cho thấy đây chính là protein tái tổ hợp đã thiết kế có các trình tự đúng như lý thuyết dịch mã từ gen. Trình tự axít amin PI-QT sau khi nhận diện: MTKQLINATIIACVGLIYLLGCSGEEDVLHEDELLEMSLEEGAPTAPDGCAILAKPAGFTD NALSEANAKFGFKLLAELYNQKPNKNVFISPLSISIALTMTYNGARGATKQAMAKTLEIE GMDLGAVNQANAELREILKSADPQIELAIANSIWLRNTFDEVNPDFLDRNDRFFGAEIAS LDFDDPQTVETINQWVNTNTQGKIKEILGEIEEHEVMFLINAIYFKGGWKGKFDASKTQD GVFHLLDGGEKQVPMMSHTCNYSYLESGDFRAVGLPYGEGRVSMYIFLPEHSSNLDE FLADLNAENWENWLSRFWNERDLRFIMPRFRLEYGMLLNDALKA 3.4.6. Hoạt tính của chất ức chế protease tái tổ hợp Hoạt tính ức chế các protease: trypsin, ɑ-chymotrypsin, thermolysin (Sigma) của protein PI-QT ở trạng thái không liên kết đã được xác định bằng phép thử trên đĩa thạch với cơ chất là sữa gầy (Skimmed milked 1 %), xác định tỷ lệ ức chế bằng cơ chất BAPNA theo phương pháp mô tả và định lượng hoạt tính ức chế theo phương pháp của Jiang et al. (2011). Kết quả, protein PI-QT ức chế mạnh 20 kDa 50 kDa 64 kDa 85 kDa 85 kDa M 1 50 kDa (a) (b) 1 2 M PI-QT 18 trypsin (87 % khi sử dụng 468 µg protein PI-QT; Ki = 1,33 × 10-8 M), ức chế yếu ɑ-chymotrypsin (51 % khi sử dụng 468 µg protein PI-QT; Ki = 2,87 × 10 -8 M) và không ức chế thermolysin. Phân tích khả năng ức chế protease cho thấy protein tái tổ hợp thu được ức chế chống lại trypsin và ɑ-chymotrypsin với các hoạt độđặc hiệu lần lượt là 975 ± 26 U/mg và 417 ± 14 U/mg. Chất ức chế BBI (đối chứng dương) nhận được ức chế trypsin và a-chymotrypsin tốt hơn so với protein PI-QT, với các hoạt độ đặc hiệu lần lượt là 3303 ± 66 U/mg và 1340 ± 58 U/mg. 3.5. Nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp trong Pichia pastoris SMD1168 3.5.1. Thiết kế vectơ biểu hiện pPIC9/PI-QT Gen PI-QT đã được chèn thành công vào vectơ biểu hiện pPC9 để tạo thành vectơ tái tổ hợp pPIC9/PI-QT. 3.5.2. Tạo dòng tế bào Pichia pastoris SMD1168 mang gen PI-QT Đã tạo thành công dòng tế bào P. pastoris SMD 1168 mang vectơ tái tổ hợp [pPIC9/PI-QT]. Kết quả kiểm tra trên môi trường MD, MM và PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi AOX1 (Pichia expression Kit, Invitrogen) cho thấy các dòng P. pastoris tái tổ hợp mang kiểu hình Mut s . 3.5.3. Biểu hiện gen PI-QT trong nấm men P. pastoris SMD1168 Biểu hiện các dòng P. pastoris SMD 1168 [pPIC9-PI-QT] theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Pichia expression kit, Invitrogen) đối với chủng có kiểu hình Muts, cảm ứng methanol 0,5 %, lắc 200 vòng/phút ở 28 oC. Kết quả điện di trên gel SDS-PAGE 12,6 % và nhuộm coomassie cho thấy protein PI-QT đã được biểu hiện có kích thước khoảng 50 kDa tương ứng với kích thước lý thuyết protein PI-QT ở các thời điểm 24, 48, 72, 96 và 120 h nuôi cấy. Hàm lượng protein biểu 19 hiện thu được nhiều nhất ở 72 h sau cảm ứng và giảm đi sau 96h cảm ứng (Hình 3.28). Hình 3.28. Điện di đồ protein PI-QT biểu hiện trong P. pastoris SMD1168. M: Marker protein (Affymetric) 1: Mẫu không cảm ứng. 2: 0 h sau cảm ứng. 3-8: Có cảm ứng (3: 24 h; 4: 48 h; 5:120 h; 6:72 h;7, 8: 96 h sau cảm ứng) 3.5.4. Kết quả thử hoạt tính ức chế protease của protein PI-QT biểu hiện trong nấm men Protein ngoại bào của nấm men P. pastoris SMD1168 mang gen PI-QT và không mang gen PI-QT sau cảm ứng methanol 72 giờ đã được thử hoạt tính ức chế proteases (trypsin, ɑ-chymotrypsin và thermolysin). Protein PI-QT 20 Hình 3.30. Định tính khả năng ức chế proteases của protein biểu hiện a, b, c tương ứng với thử nghiệm ức chế với trypsin (Try), ɑ-chymotrypsin (ɑ-chy) và thermolysin (Ther). Nồng độ protease ở mỗi giếng là 0,01 mg); PI: prote