Luận văn Cải biến phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (rp – hplc) xác định lutein, ứng dụng khảo sát quá trình xà phòng hoá lutein ester

thiện độ phân giải và làm tăng độ tan của carotenoid. Ví dụ: thêm dịch loromethane tăng tính chọn lọc của quá trình tách và tăng độ tan của carotenoid. Một số nhà phân tích có khuynh hướng sử dụng pha động chứa 3 - 4 dung môi 1 bằng cách bơm dung dịch H3PO4 1% (1g dung dịch H3PO4 85% hòa tan trong 100 ml metanol) qua cột với tốc độ 1 ml/min trong 1 h 36 nhưng theo Craft (1992) [19], điều này có thể làm phức tạp hóa phương pháp phân tích do tăng tính không trộn lẫn của chúng và tốc độ bay hơi khác nhau của các dung môi sẽ làm thay đổi thành phần pha động trong quá trình phân tích, do đó làm thay đổi thời gian lưu của carotenoid trong ngày. Neils và Leenheer (1983) [47] cho rằng việc dùng pha động không chứa nước khi tách hỗn hợp carotenoid phức tạp sẽ giúp làm tăng độ tan của carotenoid và giảm khả năng kết tủa carotenoid trên cột. Tuy nhiên, một số nhà phân tích vẫn thường thêm một lượng nước rất nhỏ vào pha động để hạn chế sự rửa giải quá sớm của các xanthophyll tự do. Đôi khi acetat amoni (0,05 M trong methanol) hay triethylamine (0,05 hay 0,1% v/v) có thể được thêm vào pha động để hạn chế ảnh hưởng của tính acid gây ra bởi các nhóm silanol tự do trên pha tĩnh silicagel, do vậy giảm hiện tượng kéo đuôi, cải thiện độ thu hồi các carotenoid. Nếu có thể, nên dùng chế độ rửa giải isocratic (thành phần pha động không đổi) do nó có những ưu điểm sau: 1) đơn giản (chỉ cần dùng một bơm cao áp); 2) nhanh; 3) cho đường nền ổn định; 4) thời gian lưu lặp lại tốt. Chế độ rửa giải này nói chung có khả năng tách được các tiền vitamin A và carotenoid chính trong các mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, khi tách hỗn hợp gồm nhiều carotenoid có độ phân cực rất khác nhau thì nên dùng chế độ rửa giải gradient để cải thiện độ chọn lọc và tăng khả năng rửa giải các hợp chất lưu giữ mạnh trên pha tĩnh. Dung môi hòa tan mẫu phải tương thích với pha động HPLC. Nếu độ tan của các carotenoid trong dung môi hòa tan mẫu tốt hơn nhiều so với trong pha động và nhất là khi tiêm dung dịch mẫu gần như bão hòa vào cột thì sẽ xảy ra hiện tượng kết tủa carotenoid trong buồng tiêm mẫu, dẫn đến hiện tượng kéo đuôi, giãn peak, chẽ peak hay tạo thành các peak ma (ghost peak) Để tránh sự không tương thích này, nên dùng pha động làm dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu bằng pha động trước khi tiêm vào cột sắc ký. Theo Kimura et al. (1995) [47], acetone là dung môi hòa tan mẫu rất tốt khi pha động chứa hỗn hợp acetonitrile – methanol – dichlorometane – hexane do nó có độ phân cực và tính tan gần giống như pha động. 37 Khi phân tích carotenoid, nếu nồng độ carotenoid trong dung dịch khá lớn sẽ dẫn đến hiện tượng biến dạng peak. Theo Khachik et al. (1988) [47], có thể loại trừ hiện tượng này nếu thể tích tiêm mẫu giảm xuống còn 5 hay 10 µl. Nhiệt độ cột cũng cần được ổn định để duy trì độ lặp lại về thời gian lưu của các carotenoid cũng như độ chọn lọc và độ thu hồi của phương pháp phân tích. Chẳng hạn, ở 300C khi dùng cột C18 và pha động gồm acetonitrile- dichloromethane-methanol 70:20:10 thì không thể tách lutein với zeaxanthin, tách trans-β-carotene với đồng phân 9-cis nhưng ở 130C thì có thể tách tốt chúng (Sander và Craft, 1990) [47]. Như đã biết, các carotenoid hấp thụ mạnh bức xạ tử ngoại - khả kiến nên để định lượng carotenoid thường dùng detector UV-Vis. Hơn nữa, loại detector này khá rẻ tiền và dễ vận hành nhưng có độ nhạy cao, khoảng tuyến tính khá rộng, ít chịu ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ. Nhược điểm của chúng là không cho phép nhận biết được các carotenoid có thời gian lưu gần giống nhau. Để khắc phục hạn chế này có thể dùng detector DAD: loại detector đắt tiền hơn nhưng cho phép ghi phổ hấp thụ UV-Vis của các carotenoid ứng với các peak tách ra trên sắc ký đồ, do đó cho phép khẳng định phần nào cấu trúc của carotenoid, đồng thời kiểm tra độ tinh khiết của peak. Tuy nhiên, các carotenoid chứa các đồng phân hình học hay đồng phân quang học có phổ hấp thụ UV-Vis rất gần giống nhau. Trong trường hợp này, không thể sử dụng detector DAD để nhận biết chúng mà phải dùng detector MS hay NMR để khẳng định chính xác hơn cấu trúc phân tử carotenoid. Nói chung, độ nhạy của detector MS cao hơn so với detector UV-Vis. Để định lượng một carotenoid X nào đó bằng phương pháp HPLC thường dùng phương pháp đường chuẩn. Lưu ý rằng các carotenoid đa số kém bền nên hàm lượng carotenoid trong “mẫu chuẩn” thường bị suy giảm trong quá trình bảo quản. Do vậy, cần kiểm tra lại hàm lượng carotenoid tổng số có trong mẫu chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-Vis (xem 1.3.1), sau đó chạy HPLC để xác định % carotenoid X có trong tổng số carotenoid còn lại. 38 Hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn được tính theo công thức: % CARX = % CAR TS* (SX/STS)*100% trong đó: %CARX: hàm lượng carotenoid X trong mẫu chuẩn. %CARTS: hàm lượng carotenoid tổng số trong mẫu chuẩn xác định bằng phương pháp đo quang UV-Vis. SX: diện tích peak ứng với carotenoid X trên sắc ký đồ. STS: tổng diện tích các peak xuất hiện trên sắc ký đồ. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 1.4.1. Nghiên cứu quá trình xà phòng hóa lutein ester Hiện nay, hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) được xem là nguồn nguyên liệu tự nhiên tốt nhất dùng cho sản xuất lutein thương mại do nó có khả năng tích lũy lutein với hàm lượng khá cao và gần như nguyên chất. Thật vậy, kết quả phân tích cho thấy hàm lượng xanthophyll tổng số trong cánh hoa cúc vạn thọ Tagetes erecta L. vào khoảng 1,0 – 1,6% (tính theo trọng lượng khô), trong đó khoảng 90% lượng carotenoid này là lutein ester (dưới dạng monoester và diester của các acid béo C12 - C18 như acid lauric, myristic, oleic, linoleic, palmitic, stearic) và chỉ có khoảng 5% là zeaxanthin ester (Kumar, 2004). Lutein dưới dạng ester rất bền nhưng khi vào cơ thể con người chỉ bị thủy phân một phần thành dạng tự do rồi mới được hấp thụ vào huyết thanh. Vì vậy, để tạo ra những chế phẩm lutein bổ sung cho con người, sau khi thu được oleoresin cần thủy phân lutein ester về dạng tự do [9]. Quá trình thủy phân lutein ester từ hoa cúc vạn thọ có thể thực hiện bằng phương pháp hóa học hay sinh học. Phương pháp hóa học (còn gọi là phương pháp xà phòng hóa) sử dụng tác nhân kiềm mạnh (thường là KOH) trong alcohol hữu cơ (propylen glycol, ethanol) để cắt đứt liên kết ester giữa các nhóm –OH trong phân tử lutein với các acid béo. Phương pháp xà phòng hóa tuy ít tốn kém nhưng thường phải tiến hành ở nhiệt độ cao nên có thể gây ra sự phân hủy lutein tự do. Do đó, một số tác giả khác nghiên cứu sử dụng 39 phương pháp sinh học trong đó sử dụng enzyme lipase để thủy phân lutein ester ở nhiệt độ phòng nhằm hạn chế sự phân hủy hoạt chất. Tuy nhiên, phương pháp này hiện nay ít được áp dụng rộng rãi do enzyme đắt tiền, hiệu quả kinh tế không cao khi ứng dụng trong công nghiệp [48]. Trên thế giới đã có khá nhiều sáng chế về quá trình tách chiết và tinh chế lutein từ hoa cúc vạn thọ, trong đó có đề cập đến phương pháp xà phòng hóa lutein ester. Sau đây là một số phương pháp xà phòng hóa lutein ester tiêu biểu: Ausich và cs. (1997) [43] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách hòa tan oleoresin trong propylen glycol theo tỷ lệ 41:41 (w/w) rồi đun ở 50 - 600C cho tan ra, sau đó thêm từ từ 18 phần khối lượng dung dịch nước của KOH 45% w/w rồi đun nóng đến 65-800C (tốt nhất là ở 700C) trong 10 giờ. Như vậy, tỷ lệ oleoresin: propylen glycol: KOH: H2O trong hỗn hợp xà phòng hóa ban đầu xấp xỉ 4:4:1:1 (w/w/w/w). Nhược điểm của quy trình này là oleoresin khó tan trong propylen glycol (có độ nhớt cao) nên quá trình xà phòng hóa cần tiến hành ở nhiệt độ khá cao trong thời gian dài, dẫn đến khả năng phân hủy lutein, zeaxanthin thành các sản phẩm không mong muốn Khachik, F. (2001) [49] đề nghị quá trình chiết lutein ester từ bột hoa cúc vạn thọ khô (thu được bằng cách ủ xi-lô rồi sấy khô) bằng tetrahydrofuran (THF) và đồng thời xà phòng hóa bằng cách phối trộn với dung dịch KOH 10% trong ethanol (EtOH) để đưa hỗn hợp về pH 12. Tỷ lệ các thành phần trong hỗn hợp phản ứng như sau: 100 g bột hoa cúc: 1000 ml THF: 250 ml KOH 10% w/v trong EtOH. Tiến hành chiết và xà phòng hóa lutein ester bằng cách khuấy trộn hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 2 h Tiến trình thủy phân được giám sát bằng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC). Quy trình này mặc dù cho hiệu suất và độ tinh khiết của sản phẩm lutein cao nhưng có nhược điềm là không có giai đoạn cô đặc lutein ester trước khi xà phòng hóa nên tiêu tốn nhiều dung môi và KOH. Ngoài ra, THF dễ tạo thành các peroxid do đó có thể phân hủy xanthophyll. Madhavi (2002) [50] đưa ra quy trình xà phòng hóa oleoresin trong dung dịch isopropanol-nước như sau: Hòa tan 1 kg oleoresin trong 3 L 40 isopropanol rồi khuấy và đun nóng đến 600C đến khi chảy lỏng thành dung dịch. Sau đó, thêm 0,44 L dung dịch nước chứa 50% KOH (tức nồng độ oleoresin và KOH trong hỗn hợp xà phòng hóa là 0,3 g/ml và nồng độ KOH là 6,4% w/v). Xà phòng hóa bằng cách khuấy và duy trì hỗn hợp ở 60-650C trong 90 phút. Sản phẩm thu được chứa 95% carotenoid tổng số (với 90% all- trans lutein, 4% all-trans zeaxanthin, còn lại là các vết carotenoid khác). Nhược điểm của quy trình này sinh ra nhiều nước thải do sử dụng lượng nước lớn gấp 30 lần lượng oleoresin. Kumar, S.T.K và cs. (2004) [7] đã xà phòng hóa lutein ester bằng cách thêm dung dịch KOH 8 – 13% w/v trong isopropanol vào oleoresin sao cho oleoresin với nồng độ oleoresin trong hỗn hợp là 0,33 g/ml. Hỗn hợp được đun nóng 65-800C trong 3 giờ. Tiến trình xà phòng hóa được giám sát bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Nhược điểm của quy trình này phản ứng phải thực hiện ở nhiệt độ khá cao (70 - 800C) nên có khả năng dẫn đến sự chuyển hóa trans-lutein thành đồng phân cis- làm giảm hoạt tính sinh học của sản phẩm. Swaminathan (2009) [8] xà phòng hóa oleoresin bằng cách đun oleoresin đến dưới 450C, khuấy đều cho chảy lỏng ra, thêm 1,2 - 2,0 phần thể tích dung dịch KOH 13 - 15% trong EtOH tuyệt đối rồi đun ở 70 - 800C trong 40 phút. Hiệu suất xà phòng hóa thay đổi từ 55% - 80% tùy điều kiện phản ứng cụ thể. Ưu điểm của quy trình này là ít sử dụng dung môi độc hại, rút ngắn thời gian xà phòng hóa. Gần đây, Joseph và cs. (2013) [51] đã cải tiến quy trình xà phòng hóa lutein oleoresin bằng dung dịch KOH trong nước với sự có mặt của hỗn hợp alcohol béo (lauryl alcohol) và acid béo (caprylic capric acid) để bảo vệ lutein khỏi bị oxy hóa ở nhiệt độ cao như sau: 10 kg oleoresin được đun nóng và khuấy ở 450C trong 5-10 phút cho đồng nhất. Thêm từ từ 1,95 kg KOH 95% trong 3 kg nước rồi 0,86 kg caprylic capric acid và 4,3 kg of lauryl alcohol, khuấy đều và gia nhiệt ở 800C trong 3h (theo dõi quá trình xà phòng hóa bằng sắc ký bản mỏng). Hiệu suất phản ứng khoảng 80,15%. Phương pháp này tuy không dùng dung môi EtOH và sản phẩm carotenoid thu được có độ tinh 41 khiết cao (khoảng 91,75% carotenoid tổng số) nhưng phải dùng hỗn hợp caprylic capric acid-lauryl alcohol và lượng nước khá lớn khó có khả năng thu hồi, yêu cầu thiết bị phức tạp (ly tâm tốc độ cao). Từ việc tổng quan tài liệu có thể thấy rằng đa số phương pháp xà phòng hóa đều sử dụng dung dịch KOH trong alcohol (methanol, ethanol, isopropanol, propylen glycol). Tuy nhiên, không có sự tương đồng về điều kiện xà phòng hóa lutein ester. Nguyên nhân có lẽ là do các tác giả đã sử dụng các dung môi khác nhau (hexane, ether dầu mỏ, ethyl acetate) để chiết lutein tự do từ hỗn hợp xà phòng hóa cũng như dùng các phương pháp và kỹ thuật khác nhau (TLC, đo quang UV-Vis, HPLC) để đánh giá hiệu suất xà phòng hóa. Thực tế trên dẫn đến sự băn khoăn trong việc lựa chọn phương pháp xà phòng hóa để ứng dụng trong nghiên cứu và sản xuất. Nhằm góp phần hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất, tinh chế các hoạt chất lutein, zeaxanthin từ cây cúc vạn thọ, việc đánh giá lại ảnh hưởng của điều kiện xà phòng hóa đến hiệu suất chuyển hóa lutein ester thành lutein tự do, từ đó chọn lựa phương pháp thích hợp cho việc xà phòng hóa lutein ester là vấn đề cần quan tâm. 1.4.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng lutein bằng phương pháp HPLC 1.4.2.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Lutein là carotenoid có trong nhiều loài động - thực vật, có vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa bệnh mù lòa ở người cao tuổi (thoái hóa hoàng điểm, đục thủy tinh thể,...). Do đó, có nhiều công trình nghiên cứu định lượng lutein và các carotenoid đi kèm trong các nguồn nguyên liệu tự nhiên, các mẫu sinh học, thực phẩm, dược phẩm. Một trong những công trình nghiên cứu lâu đời nhất định lượng carotenoid trong thực vật bằng phương pháp HPLC sử dụng cột pha ngược được thực hiện bởi Tee E. Siong và Lim Chin Lam (1992) [47]. Dịch chiết carotenoid thu nhận từ 8 loài thực vật trước hết được tách sơ bộ bằng sắc ký cột hở chứa hỗn hợp MgO2-diatomite (phương pháp AOAC, Deutsch, M.J, 42 1984 [28]), rửa giải bằng hỗn hợp acetone: hexane với tỷ lệ acetone tăng dần. Các phân đoạn carotenoid tách ra được đo quang UV-Vis ở 450 nm để xác định carotenoid tổng số, sau đó tiêm vào thiết bị HPLC sử dụng cột C18 (300 x 3,9 mm; 10 µm) với thể tích tiêm mẫu 50 - 100 µL; pha động là hỗn acetonitrile-methanol-ethyl acetate, 88:10:2, v/v, tốc độ dòng 2,0 mL/min. Sử dụng phương pháp này cho phép phân tách được a- và b- carotene, lutein, lycopene trong một số rau quả, nhưng không phân giải được một số carotenoid khác (lutein và zeaxanthin). Kết quả cũng cho thấy việc xà phòng hóa giúp loại bỏ chlorophyll, do đó cho phép định lượng carotenoid dễ dàng hơn. Phương pháp này khá phức tạp, cần lượng mẫu nhiều, độ phân giải không cao (do dùng pha tĩnh có kích thước hạt lớn), độ chính xác không cao, mất nhiều thời gian nên hiện nay ít được sử dụng. Sau đó, những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực chế tạo thiết bị HPLC đã cho phép các nhà phân tích sử dụng pha tĩnh C18 với kích thước hạt nhỏ hơn và cột ngắn hơn, nhờ đó giảm lượng mẫu và thời gian phân tích nhưng hiệu quả tách tốt hơn. Chẳng hạn, Maria V. Chandra-Hioe và cs. (2017) [47] đã xây dựng quy trình định lượng lutein và β-carotene trong một số loài rau có lá ở châu Á (rau muống, rau dền, su lơ trắng, su lơ xanh, mù tạc, rau mùi). Các carotenoid được chiết từ các mẫu rau bằng acetone chứa 5% (w/v) CaCO3. Dịch chiết được cô đặc ở 4°C, sau đó lọc và bơm vào thiết bị HPLC với cột C18 (150 x 3,9 mm; 5 μm). Pha động gồm 2 hệ dung môi: A = acetonitrile: methanol: đệm Tris 0,1 M pH 8 (84: 2:14) và B = methanol: ethyl acetate (68:32). Rửa giải gradient trong 25 phút với tốc độ dòng 1,2 mL/phút (100% A đến 100% B trong 12 phút, giữ trong 6 phút; về 100% A trong 1 phút và cân bằng cột trong 6 phút). Ghi nhận tín hiệu bằng detector DAD ở 450 nm. Các dung dịch chuẩn gốc β-carotene, lycopene and lutein được bảo quản ở - 800C dưới khí quyển N2 và pha loãng thành dung dịch chuẩn làm việc bằng pha động ngay trước khi dùng. Các đường chuẩn có R2 > 0,99. Phương pháp có độ thu hồi tốt đối với β-carotene và lutein (lần lượt là 132% và 100%); độ chính xác khá cao (độ lặp lại trong ngày < 3,8%; độ lặp lại giữa các ngày < 11%). 43 Tuy vậy, đối với những hỗn hợp carotenoid phức tạp, cột C18 thường không cho phép tách tốt, không thể định lượng chính xác. Vì vậy, những năm gần đây các nhà sản xuất đã cho ra đời cột pha đảo C30. Kết quả nghiên cứu trên nhiều đối tượng phân tích khác nhau cho thấy loại cột này có khả năng phân giải rất tốt hỗn hợp carotenoid, đặc biệt cho phép tách rất hiệu quả các đồng phân vị trí hay đồng phân quang học. Do đó, loại cột này hiện được sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới để phân tích carotenoid. Sau đây là một số ví dụ: - Rebecca Yuhas và cs. (2011) [47] đã sử dụng cột C30 (250 x 4,6 mm; 5μm) để định lượng lutein trong sữa bột trẻ em: rửa giải gradient kiểu bậc thang (85% A đến 70% A từ 0 – 18 phút; giảm xuống 10% A trong 1 phút và giữ trong 4 phút; sau đó tăng lên đến 85% A trong 1 phút; cân bằng cột ở 85% A trong 6 phút; trong đó A = MeOH; B = MTBE (Methyl – tert – butyl ether); tốc độ dòng 1 mL/phút; ghi nhận tín hiệu bằng detector UV-Vis ở 445 nm. Đường chuẩn có độ tuyến tính tốt (R2 = 0,997). Phương pháp có độ lặp lại tốt (% RSD < 4%), độ chính xác trung gian cao (% RSD < 20% và < 12% khi nồng độ lutein lần lượt dưới 25 µg/L và 200 µg/L). Độ thu hồi chung của toàn bộ quá trình từ 88% đến 106%. - Domenico Montesano và cs. (2012) [47] đã nghiên cứu chiết và định lượng lutein từ phế liệu cà chua (vỏ và hạt) bằng phương pháp HPLC-DAD. Mẫu được đun sôi trong nước, lọc lấy bã đem chiết bằng acetone/ethanol 2:1 (v/v). Dịch chiết được cô quay rồi hòa tan trong hexane/ethyl acetate 96:4 (v/v) để làm sạch (loại các carotenoid kém phân cực như β-carotene, lycopene) trên cột SPE Florisil. Dịch ra khỏi cột SPE được cô quay, rồi hòa tan trong pha động sắc ký và bơm vào thiết bị HPLC trên cột C30 (250 × 4,6 mm; 5 µm), detector PDA ở bước sóng 450 nm, rửa giải isocratic bằng pha động gồm MBTE:MeOH 30:70 v/v, tốc độ dòng 1,0 mL/phút. Đường chuẩn có độ tuyến tính và độ lặp lại tốt (R2 = 0,9999; %RSD = 1,7%), khoảng tuyến tính rộng (0,01 – 100 μg/mL), LOD và LOQ rất thấp (lần lượt là 0,02 và 0,07 μg/mL). 44 - Jing Tan và cs. (2017) [52] đã xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng all-trans lutein, zeaxanthin, b-cryptoxanthin, a-carotene, và b- carotene trong các mẫu sinh học như huyết thanh và sữa người sử dụng cột C30 (150 x 2,1 mm, 3 µm) ở 300C. Buồng tiêm mẫu được giữ ở 80C trong 48 giờ. Pha động gồm 2 hệ dung môi: A = MeOH : dung dịch ammonium acetate 1,5% (98:2, v/v) và B = MTBE : MeOH : dung dịch ammonium acetate 1,5% (90:8:2, v/v/v). Rửa giải gradient như sau: 100% A giữ trong 1,5 phút; giảm xuống 55% A ở 9,4 phút rồi xuống 5% A sau 2,0 phút và giữ trong 2,0 phút; cuối cùng về 100% A sau 0,1 phút và giữ trong 3,0 phút. Tốc độ dòng cố định 0,5 mL/phút. Các carotenoid được phát hiện ở 445 nm, quét phổ UV-Vis 380 – 640 nm. Echinenone được sử dụng làm chất nội chuẩn. Các dung dịch chuẩn gốc carotenoid được chuẩn hóa trước mỗi lần phân tích. Kết quả cho thấy các peak lutein (ở 5,649 min) và peak của zeaxanthin (6,397 min) phân giải rất tốt và quá trình sắc ký hoàn tất chỉ trong 18 phút, tức ngắn hơn 30 – 40 phút so với các phương pháp khác. Nguyên nhân là do sử dụng cột có kích thước hạt và đường kính nhỏ. Độ tuyến tính tốt đạt được đối với các carotenoid (R2 > 0,9999). Giới hạn định lượng của phương pháp (MLOQ) đối với mẫu huyết thanh và sữa mẹ lần lượt là 10 ng/mL và 5 ng/mL. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ đúng tốt (độ thu hồi từ 85 –105%), độ lặp lại khá cao (%RSD trên mẫu chuẩn lutein khoảng từ 3,3 – 4,2%; %RSD đối với độ thu hồi lutein trên mẫu thực từ 2,2- 7,5%). Bên cạnh đó, cũng có những phương pháp định lượng carotenoid sử dụng cột pha thuận. Chẳng hạn: - JECFA (2004) [12] đã phê chuẩn phương pháp kiểm tra chất lượng sản phẩm lutein tinh chế thu nhận từ hoa cúc vạn thọ như sau: Mẫu lutein (cân chính xác) được hòa tan trong EtOH tuyệt đối và độ hấp thụ ở 446 nm để xác định hàm lượng carotenoid tổng số. Sau đó, xác định % lutein và % zeaxanthin trong tổng số carotenoid bằng phương pháp HPLC sử dụng cột silica (250 x 4,6 mm; 3 μm); rửa giải isocratic trong 40 phút (pha động là hỗn hợp hexane/ethyl acetate 70:30 v/v; tốc độ 1,5 ml/phút); thể tích bơm mẫu 10 μl; detector UV-Vis ghi nhận tín hiệu ở 446 nm. 45 - Miroslav ŠIVEL và cs. (2014) [1] đã định lượng lutein trong các dịch chiết cô đặc thu nhận từ hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagetes erecta L.) Mẫu được hòa tan trong dung môi acetone-methanol (1:1 v/v) và bơm vào thiết bị HPLC-DAD ở 300C dùng cột pha thuận ZORBAX SB CN (75 mm × 4,6 mm; 3,5 μm), rửa giải gradient tuyến tính (0 phút 30% A; 10 phút 0% A và 15 phút 30% A; trong đó A = dung dịch nước chứa 3,153 g/L ammonium formate và B = MeOH) với tốc độ dòng 0,7 mL/phút. Tín hiệu được ghi ở 446 nm. Phương pháp có LOD = 0,22 μg/g; LOQ = 0,7 μg/g. Đường chuẩn tuyến tính tốt (R2 = 0,9982); độ lặp lại và độ thu hồi cao (đối với các dung dịch chuẩn RSD = 1,4% và độ thu hồi từ 99,0 – 101%). Khó khăn lớn nhất trong việc định lượng các mẫu sinh học là việc xử lý mẫu khá phức tạp, độ chính xác và độ lặp lại thường không cao do carotenoid dễ phân hủy trong quá trình phân tích, độ phân giải của một số peak chưa tốt, thời gian phân tích khá dài. 1.4.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam với điều kiện khí hậu có độ ẩm cao, cột silica dễ hút ẩm và do đó rất nhạy cảm với sự thay đổi thành phần nước trong pha động, kết quả là thời gian lưu khó lặp lại. Đối với các cột pha đảo thì cột C30 tuy có ưu điểm là cho phép phân tách rất hiệu quả nhiều hỗn hợp carotenoid khác nhau (đặc biệt là hỗn hợp carotenoid ở các dạng đồng phân khác nhau) nhưng lại khá đắt tiền. Do đó, cột pha đảo C18 thường được ưu tiên lựa chọn trong phân tích các hỗn hợp carotenoid không quá phức tạp. Cho tới nay số công trình nghiên cứu xây dựng và thẩm định phương pháp HPLC định lượng các hợp chất nhóm carotenoid rất ít. Hoàng Thị Huệ An (2009) [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định lượng astaxanthin và các carotenoid đi kèm có trong một số loài giáp xác thủy sản. Mẫu được xay nhỏ, trộn đều với Na2SO4 khan rồi đồng hóa trong dung môi acetone. Dịch chiết acetone được chiết sang hỗn hợp ether ethylic - ether dầu mỏ (1:1, v/v), làm khan, cô quay, hòa tan trong methanol- dichloromethane (3:1, v/v) và xà phòng hóa ở 50C trong 18 giờ (phương pháp Yuan & Chen (2000) [47]). Hỗn hợp sau khi xà phòng hóa được chiết sang 46 ethyl axetat, cô quay. Hòa tan cặn thu được acetone, giữ qua đêm ở -200C để kết tủa tạp chất lipid, rồi lọc dung dịch qua màng lọc PTFE 0,22 µm rồi bơm vào thiết bị HPLC (Agilent 1100 Series, USA). Điều kiện sắc ký như sau: cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm); nhiệt độ cột 300C; thể tích bơm mẫu: 5 µl; tốc độ dòng: 1 ml/min; detector PDA ghi tín hiệu ở 480 nm và quét phổ từ 350 – 600 nm. Rửa giải gradient (100% A: 8 phút; 100% A đến 100% B: 5 phút; 100% B 15 phút; cân bằng cột: 15 phút; trong đó A = acetonitrile-methanol- dichloromethane-H2O 85:5:5:5 v/v/v/v và B= acetonitrile-methanol- dichloromethane-H2O 60:8:30:2 v/v/v/v). Phương pháp cho phép tách tốt hỗn hợp astaxanthin, lutein/zeaxanthin, lycopene, b-carotene nhưng không phân tách được cặp đồng phân lutein/zeaxanthin. Kết quả cho thấy các đường chuẩn tuyến tính tốt trong khoảng nồng độ carotenoid từ 1,5 - 10 µg/ml (R2 > 0,99); độ lặp lại cao (%RSD = 0,30 – 1,50% đối với mẫu chuẩn (n = 6) đo trong ngày có n = 6 và từ 1,13 - 2,93% đối với mẫu chuẩn (n = 3) trong 2 tháng. Tuy nhiên, hiệu suất thu hồi thấp (astaxanthin: 83%; lutein: 65,4%; lycopene: 52,4%; b-carotene: 66,4%) do carotenoid bị mất mát trong quá trình xà phòng hóa và kết tủa tạp chất lipid bằng acetone. Trương Ngọc Bảo Hiếu và Ngô Văn Tứ (2017) [14] đã xây dựng phương pháp phân tích β – carotene trong một số loại ngũ cốc có màu bằng phương pháp HPLC với detector PDA sử dụng cột C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm) ở nhiệt độ phòng. Pha động là MeOH:H2O 50:50 v/v, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μL. Kết quả nghiên cứu cho thấy : phương pháp có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt (RSD% < 3,5%, n = 6); LOD thấp (0,2 ppm); đường chuẩn β – carotene tuyến tính tốt trong khoảng 0,5 ÷ 10 ppm (R2 = 0,9999); độ đúng tốt (độ thu hồi trên mẫu thực tế từ 91 ÷ 101%). Tuy đã có nhiều phương pháp định lượng lutein và hỗn hợp các carotenoid khác nhau bằng phương pháp HPLC sử dụng cột C18 nhưng các phương pháp này không phù hợp với điều kiện sẵn có ở phòng thí nghiệm của chúng tôi (hoặc về các thông số của cột sắc ký, hoặc về thành phần pha động, hoặc về phạm vi ứng dụng). Do đó, việc cải biến phương pháp HPLC sẵn 47 có để phù hợp hơn với điều kiện phòng thí nghiệm và mục đích phân tích cụ thể là điều cần thiết. Trong đề tài này sẽ sử dụng thiết bị HPLC-DAD và cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm) - là cột pha đảo C18 duy nhất có tại phòng thí nghiệm của chúng tôi - để nghiên cứu định lượng lutein trong sự có mặt của một số carotenoid khác (astaxanthin, zeaxanthin; b-caroten; các lutein ester) từ đó ứng dụng xác định điều kiện thích hợp cho phản ứng xà phòng hóa lutein ester tách chiết từ hoa cúc vạn thọ Mỹ (Tagteges erecta L.). 48 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Nguyên liệu Hoa cúc vạn thọ Mỹ Tagetes erecta L. từ đề tài cấp tỉnh của TS. Hoàng Thị Huệ An. Hoa sau khi thu hoạch được cắt lấy cánh, loại bỏ tạp chất, sấy ở 600C đến độ ẩm <10% rồi nghiền thành bột mịn, cân thành những lượng chính xác, đóng gói chân không, bảo quản ở -200C đến khi sử dụng. 2.1.2. Hóa chất - Các