Bài giảng Ứng dụng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) và lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen

HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen” BÁO CÁO HỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊN HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương NỘI DUNG CHÍNH Đặt vấn đề Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Kết quả và thảo luận Kết luận và đề nghị HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 1.Đặt vấn đề Hiện nay bệnh bạc lá là một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đối với cây lúa. Chúng không những gây hại trong vụ mùa mà gây hại ngay cả trong vụ xuân làm thiệt hại rất lớn đến năng suất và chất lượng lúa. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 1.Đặt vấn đề Để chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá thành công thì cần phải biết gen nào kháng được các chủng bệnh bạc lá Việt Nam, kháng được bao nhiêu chủng và thành phần chủng bệnh bạc lá đang tồn ở những vùng trồng lúa. Muốn xác định được thành phần chủng bệnh bạc lá thì chúng ta phải đi thu thập mẫu bệnh, phân lập và sau đó lây nhiễm trên dòng đẳng gen để phân thành các chủng. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Dòng đẳng gen là dòng có nền gen cơ bản giống nhau nhưng chỉ khác nhau gen kháng. Dòng đẳng gen đóng vai trò rất quan trọng trong việc xác định thành phần chủng bệnh bạc lá. Việc kết luận chính xác thành phần chủng bệnh bạc lá và gen nào kháng được các chủng đó giúp các nhà chọn tạo giống có định hướng hiện tại, tương lai trong chương trình chọn tạo giống lúa kháng bệnh của mình. 1.Đặt vấn đề HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 1.Đặt vấn đề Các gen kháng bệnh bạc lá đã được các nhà khoa học định vị trên từng nhiễm sắc thể và các primer đi kèm. Như vậy chỉ cần dùng kỹ thuật PCR chúng ta có thể phát hiện được các gen có mặt trong các dòng đẳng gen. Mặt khác theo kết quả nghiên cứu của PGS.TS. Phan Hữu Tôn và cộng sự, đã xác định được phổ kháng nhiễm của từng gen đối với các chủng vi khuẩn Miền Bắc Việt Nam, dựa vào đó chúng ta cũng có thể phát hiện sự có mặt của các gen trong các dòng đẳng gen bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 1.Đặt vấn đề Trong chương trình hợp tác với Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI), Bộ môn Công nghệ sinh học đã tiếp nhận 11 dòng đẳng gen từ những năm 2000. Trải qua quá trình bảo quản, lưu giữ trên đồng ruộng và trồng cạnh nhau dẫn đến sự lẫn tạp hoặc phân ly các gen kháng với nhau. Sự lẫn tạp đó dẫn đến những kết quả sai lệch trong nghiên cứu cơ bản và hậu quả sẽ rất nguy hiểm khi có những kết luận không chính xác. Chính vì vậy chúng em tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen” HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Mục đích: Kiểm chứng lại các gen kháng bệnh bạc lá trong các dòng đẳng gen. Yêu cầu: Trồng và chiết tách DNA của các dòng đẳng gen, dùng chỉ thị phân tử DNA để xác định sự hiện diện của các gen kháng. Lây nhiễm nhân tạo các chủng bệnh bạc lá đặc trưng trên dòng đẳng gen. 1.Đặt vấn đề HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1. Vât liệu nghiên cứu 11 dòng đẳng gen có nguồn gốc từ IRRI chứa các gen kháng bệnh khác nhau HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 12 chủng vi khuẩn bạc lá dùng trong lây nhiễm nhân tạo đã được xác định HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Primer nhân đoạn DNA liên kết với các gen HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 2.2. Phương pháp nghiên cứu Ngoài đồng ruộng Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện vụ xuân 2009. Các dòng đẳng gen được trồng cạnh nhau, mỗi giống 5 m2, tuần tự không nhắc lại. Mật độ cấy 35 khóm/m2, chăm sóc tương tự đại trà. Mỗi dòng chọn ngẫu nhiên 10 cây cắm thẻ ghi số thứ tự, sử dụng các cây đó chiết tách DNA phục vụ cho PCR và lây nhiễm nhân tạo. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Chỉ thị phân tử xác định gen kháng bạc lá Chiết tách DNA theo phương pháp của Zheng và cộng sự (1995) có cải tiến. + Thành phần dung dịch dùng tách chiết DNA gồm có: Tris-HCl 50mM (pH=8), EDTA 25mM (pH=8), NaCl 300mM, SDS 1%, nước cất vô trùng. + Cách tiến hành: Phản ứng PCR: thành phần 20 μl dung dịch phản ứng PCR gồm có: 12.24 μl nước cất, 0.1 μl Taq DNA Polymerase, 2.0 μl 10X buffer, 1.5 μl MgCl2 50 mM, 0.16 μl dNTPs 25 mM, 1 μl mỗi mồi, 1 μl DNA nguyên bản . HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương + PCR của gen Xa4 và Xa 7 và Xa21 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 30 chu kỳ, 94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72º trong 2 phút, và 72 º C trong 8 phút. + PCR của gen xa5 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72º trong 1 phút 50 giây, và 72 º C trong 7 phút. Sau đó, sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme DraI. Trong 15μl phản ứng gồm có 10μl sản phẩm PCR, 0,3μl enzyme DraI 10unit/ μl, 1,5μl buffer B, 3,2μl nước. Hỗn hợp được ủ ở 37ºC trong ít nhất 6 tiếng. + Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%. Bản gel được nhuộm bằng Ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Lây nhiễm nhân tạo xác định gen kháng bạc lá HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Toàn bộ đầu lá xanh trên của 1 cây được cắt sâu 3-5cm bằng kéo nhúng dung dịch vi khuẩn. Mỗi một cây tương ứng với 1 hoặc 2 chủng đặc thù. Đánh giá khả năng kháng bệnh của từng giống bằng cách đo chiều dài vết bệnh sau 18 ngày lây nhiễm. - Chiều dài vết bệnh 12 cm: nhiễm nặng (S) HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 3. Kết quả và thảo luận Hình 1: Kiểm tra DNA sau chiết tách 1. IR24; 2. IRBB1; 3. IRBB2; 4. IRBB3; 5. IRBB4, 6. IRBB5; 7. IRBB7 8. IRBB10; 9. IRBB11; 10. IRBB14; 11. IRBB21 3.1. Kiểm tra kết quả chiết tách DNA HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 3.2. Xác định gen kháng Xa4 trong dòng IRBB4 Hình 2. Điện di sản phẩm PCR xác định gen Xa4 trong dòng IRBB4 1. Marker; 2. IR 24 nhiễm chuẩn không chứa gen; 3-12: các cây xác định gen HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Bảng 1: Kết quả lây nhiễm các cá thể dòng IRBB4 với chủng vi khuẩn 2A và 3A R: Resistance (Kháng); S: Succeptable (Nhiễm) HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 3.3. Xác định gen kháng xa5 trong dòng IRBB5 Hình 3: Điện di sản phẩm PCR gen xa5 sử dụng cặp mồi RG556 1: Marker; 2: IRBB5 chuẩn, 3: IR24 không chứa gen; 4-13 các cây NC HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Bảng 2: Kết quả lây nhiễm các cá thể dòng IRBB5 với chủng vi khuẩn 3A, 4 và 5A HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 Phản ứng của các cá thể trong dòng IRBB5 với chủng 4 HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 3.4. Xác định gen kháng Xa7 trong dòng IRBB7 Hình 3: Điện di sản phẩm PCR gen Xa7 sử dụng cặp mồi P3 Marker; 2: DNA chuẩn của gen xa7, 3: IR24 không chứa gen; 4-13: các cây nghiên cứu HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Bảng 2: Kết quả lây nhiễm các cá thể dòng IRBB7 với chủng vi khuẩn 3A, 4 và 5A R: Resistance (Kháng); S: Succeptable (Nhiễm) HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Phản ứng của các cá thể trong dòng IRBB7 với chủng 5A Phản ứng của các cá thể trong dòng IRBB7 với chủng 5A HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 3.5. Xác định gen kháng Xa21 trong dòng IRBB21 Hình 5: Điện di sản phẩm PCR gen Xa21 sử dụng cặp mồi pTA818 1. Marker; 2: DNA gen Xa21 chuẩn, 3-12 các cá thể nghiên cứu HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Bảng 4: Kết quả lây nhiễm các cá thể dòng IRBB21 với chủng vi khuẩn 2A, 3A và 8 HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Phản ứng của các cá thể trong dòng IRBB21 với chủng 2A Phản ứng của các cá thể trong dòng IRBB21 với chủng 8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 3.6. Thảo luận Từ các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi nhận thấy rằng đã có sự lẫn tạp. Có 2 nguyên nhân gây lẫn tạp: - lẫn cơ giới và lẫn sinh học. Trong nghiên cứu này 4 dòng được tiến hành xác định gen bằng chỉ thị phân tử thì có 2 dòng bị lẫn. Các vệt băng của cây lẫn đều là các vệt băng đồng hợp. Mặt khác theo kết quả lây nhiễm thì những cây bị lẫn lại có phổ kháng nhiễm tương tự như các dòng trong tập đoàn dòng đẳng gen. Điều này có thể kết luận rằng hiện tượng lẫn giống là do lẫn cơ giới. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương IV. Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận Xác định gen kháng bằng chỉ thị phân tử và lây nhiễm nhân tạo đã xác định được 2/4 dòng nghiên cứu bị lẫn, đó là dòng IRBB5 và IRBB21. Nguyên nhân gây lẫn giống là do cơ giới chứ không phải lẫn sinh học do giao phấn 4.2. Đề nghị Thu hoạch những các thể đã được xác định chính xác là chứa gen kháng làm giống để phục vụ các nghiên cứu cơ bản về bệnh bạc lá sau này. Những cây bị lẫn loại bỏ, hoặc xác định bị lẫn chính xác gen gì. Tiếp tục nghiên cứu các dòng còn lại trong tập đoàn dòng đẳng gen.