Báo cáo Đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao lá ổi non trồng tại xã suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

t, formol 1 % tiêu diệt vi khuẩn trong 1 giờ, cồn nguyên chất không có tác dụng đối với Staphylococcus aureus nhưng cồn 70 % diệt vi khuẩn trong vài phút (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). - Tính sinh độc tố: Staphylococcus aureus có thể sản sinh ra các loại độc tố sau: độc tố dung huyết, độc tố diệt bạch cầu, độc tố gây hoại tử da, độc tố gây chết, độc tố đường ruột, các yếu tố độc lực ngoại bào. Ngoài ra Staphylococcus aureus còn hình thành những nhân tố gây bệnh sau: chất làm tan tơ huyết, men làm đông huyết tương, nhân tố khuếch tán (Trần Thị Phận, 2004). - Tính kháng thuốc:  Staphylococcus aureus là vi khuẩn gây nhiễm trùng bệnh viện rất phổ biến và người ta đã nghiên cứu được nó có khả năng đề kháng với một số kháng sinh. Tuy nhiên loại kháng sinh và mức độ kháng tùy thuộc vào điều kiện địa lý. Sự kháng thuốc ở Staphylococcus aureus là một đặc điểm rất đáng lưu ý. Đa số 10 Staphylococcus aureus kháng lại các nhóm kháng sinh nhóm  - lactams nhờ men  - lactams (Nguyễn Thanh Bảo, 2003).  Một số còn kháng được methicillin gọi là methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA), do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác động của kháng sinh. Hiện nay một số rất ít các tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin các thế hệ. Trong trường hợp này, vancomycin được dùng thay thế (Lê Huy Chính, 2007). - Tính gây bệnh: Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 20 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái  Trong tự nhiên:  Nhiễm khuẩn ngoài da: Staphylococcus aureus làm mưng mủ các vết thương, nơi sây sát trên da, làm các tổ chức bị sưng, tạo thành áp se (Trần Thị Phận, 2004).  Nhiễm khuẩn huyết: từ các ổ nhiễm trùng ngoài da, tụ cầu khuẩn xâm nhập vào máu gây chứng huyết nhiễm mủ và theo máu đi tới các cơ quan gây nên các ổ áp se. Tụ cầu khuẩn là nguyên nhân gây viêm xoang, viêm amygdale, viêm vú cho người (Trần Thị Phận, 2004). Ngoài ra tụ cầu khuẩn gây viêm vú ở bò sữa, viêm da có mủ ở chó (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997; Lưu Hữu Mãnh, 2009).  Trong các loài vật, ngựa dễ cảm nhiễm nhất rồi đến chó, bò, lợn, cừu. Gà vịt có sức đề kháng cao nhất đối với Staphylococcus aureus (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).  Trong phòng thí nghiệm: Theo Trần Thị Phận (2004), thỏ cảm nhiễm nhất. Nếu tiêm canh trùng Staphylococcus aureus vào tĩnh mạch thỏ thì thỏ sẽ chết trong vòng 1 – 2 ngày vì chứng huyết nhiễm mủ. mổ khám thấy có nhiều ổ áp se ở tim, thận, xương và bắp thịt Nếu tiêm canh trùng Staphylococcus aureus vào dưới da cho thỏ sẽ gây áp se dưới da. Hình 1.7. Staphylococcus aureus dưới kính hiện vi điện tử 20,000x b) Bacillus cereus - Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm 1972 – 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 21 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2 % số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều. - Đặc điểm: Bacillius cereus là vi khuẩn Gram dương khi chưa trưởng thành nhưng có thể thành Gram âm khi chúng già, kích thước 0,5 – 1,5 x 2 – 4 µ có hình que, sinh bào tử, kị khí, có khắp nơi trong tự nhiên. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động. - Vi khuẩn Bacillus cereus là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng ngộ độc thực phẩm, trong khi một số chủng lại có lợi cho hệ vi sinh vật đường ruột của động vật. Hình 1.8. Khuẩn lạc B. cereus trên đĩa thạch máu cừu. 1.3.2. Nhóm vi khuẩn Gram âm (Gr-) a) Pseudomonas aeruginosa - Trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa còn có tên là Pseudomonas pyocyaneus, Bacterium pyocyaneum, thuộc họ Pseudomonadaceae, giống Pseudomonas. Là một vi khuẩn có độc lực thấp, gây bệnh có tính cơ hội, thường tìm thấy trong quá trình mưng mủ ở bò, heo và trong vết thương nhiễm trùng ở người (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). - Đặc điểm:  P. aeruginosa thuộc họ vi khuẩn hiếu khí, một trực khuẩn hình gậy, kích thước 1,5 – 3 µm, thỉnh thoảng có dạng hình sợi hay hình dấu phẩy, di động, có 1 – 3 lông ở đầu. Đứng riêng từng đơn vị hay từng đôi, từng chuỗi ngắn. Vi khuẩn không hình thành nha bào, giáp mô, khi nhuộm bắt màu Gram âm.  P. aeruginosa cho kết quả kiểm tra O-F (Oxidation Fermentation) là dương/âm, phản ứng oxidase dương tính, có khả năng oxi hóa các nguồn carbohydrate, làm Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 22 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái tan chảy gelatin, khử nitrateKhông lên men đường glucose, không sinh indol, phản ứng VP (Voges Proskauer) âm tính, không hoàn nguyên methyl red, không có lysindecarbboxylase, kiềm hóa sữa. - Sức đề kháng:  Pseudomonas aeruginosa ở một số chủng có khả năng tiết ra alginate bao bọc bên ngoài tế bào của vi khuẩn giúp vi khuẩn chống lại sự thực bào, tác dụng của các bạch cầu trung tính, kháng thể và các yếu tố ngưng kết bổ thể.  Các protease được Pseudomonas aeruginosa tiết ra có khả năng tách rời các thành phần của IgG, bất hoạt bổ thể (Ryan và Ray, 2004). - Tính kháng thuốc:  Pseudomonas aeruginosa có được tính kháng thuốc cao là do cấu tạo của màng tế bào có lipopolysaccharide làm giảm khả năng thấm của kháng sinh vào bên trong tế bào vi khuẩn, một yếu tố khác là Pseudomonas aeruginosa có mang plasmid-R có khả năng truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid.  Theo G. Bonfiglo et al. (1998) Pseudomonas aeruginosa kháng một số kháng sinh theo tỉ lệ như sau: meropenem 9,1 %, ceftazidime 13,4 %, carbenicillin 27,3 %, ticarcillin/ clavulanic acid 22,8 %, amikacin 10,6 % và ciprofloxacin 31,9 %.  Theo Hoàng Kim Tuyến và ctv (2005), Pseudomonas aeruginosa kháng mạnh cefoperazone và nhóm aminoglycoside (65 – 70 %). Kháng sinh thông dụng như cefazidime cũng chỉ còn nhạy cảm khoảng 50 %. - Tính gây bệnh:  Trong phòng thí nghiệm: vi khuẩn không có độc lực cao với động vật thí nghiệm. Thỏ và chuột bạch có thể chết do bại huyết, chuột lang có thể hoại tử hoặc hoại thư sau khi tiêm vi khuẩn dưới da (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)  Trên động vật: Vi khuẩn gây bệnh cho nhiều loài vật như bệnh viêm teo mũi, viêm tử cung ở bò, chứng chảy nước ở tai chó mèo, nhiễm trùng máu ở gà (Carter, 1978).  Ngoài ra Pseudomonas aeruginosa còn gây bệnh viêm loét dạ dày trên rắn, viêm phổi và viêm dạ dày ở 2 loài trăn Nam Mỹ và 1 loài trăn ở Ấn Độ.  Pseudomonas aeruginosa gây bệnh khi sức đề kháng cơ thể yếu như: viêm phế quản, viêm màng não, viêm đường tiết niệu, viêm tai giữa, viêm loét trên da, viêm mắt, nhiễm trùng máu, giảm bạch cầu trung tính, tiểu đường (Trần Linh Thước, 2006). Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 23 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái Hình 1.9. Nuôi cấy vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên đĩa thạch Xylo Lysine Sodium Deoxycholate (XLD) b) Salmonella spp - Salmonella spp là vi khuẩn đường ruột, Gram âm, thuộc họ Enterobacteriaceae. Những chủng vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong môi trường, có thể tìm thấy trong đất, nước, thực phẩm và đường ruột của người và súc vật (Marcel Dekker, 2001). - Năm 1934, theo đề nghị của hội sinh vật học quốc tế để kỉ niệm người đầu tiên tìm ra vi khuẩn, tên chính thức của vi khuẩn này được đặt là: Salmonella (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997). - Đặc điểm:  Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 – 0,6 x 1 – 3 µm, không hình thàn nha bào và giáp mô. Phần lớn các loài thuộc giống Salmonella có thể di động mạnh do thân trên có lông (7 –12 lông xung quanh thân), trừ Salmonella gallinarum, Salmonella pullorum. (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977).  Salmonella là vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy nghi, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp là 37oC nhưng vẫn có thể phát triển ở nhiệt độ 6 – 42oC, pH thích hợp 7,2 – 7,6 (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng hơi lồi lên ở giữa, nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của Escherichia coli (đường kính 1 –1,5 mm) (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).  Theo Trần Linh Thước (2006), phần lớn các loài Salmonella có đặc điểm:lên men sinh hơi glucose và manitol nhưng không lên men đường lactose và succharose, không sinh hơi indol, không phân giải urê, không có khả năng tách nhóm amin từ tryptophan, sinh H2S, khử nitrate thành nitrite (NO3- thành NO2-). - Sức đề kháng: Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 24 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái  Salmonella khó sinh sản trong nước thường nhưng có thể tồn tại 1 tuần, trong nước đá có thể sống 2 – 3 tháng. Trong xác động vật chết chôn ở bùn hoặc cát khô có thể sống từ 2 – 3 tháng (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).  Salmonella đề kháng yếu với nhiệt độ, ở nhiệt độ 60oC bị diệt trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 75oC trong 5 phút. Có thể sinh trưởng trong môi trường thạch ở nhiệt độ 10oC trong 115 ngày. Ánh sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong 5 giờ, nước đục trong 9 giờ. - Tính sinh độc tố:  Nội độc tố: rất mạnh, với liều thích hợp tiêm tĩnh mạch vi khuẩn có thể giết chết chuột bạch, chuột lang trong vòng 48 giờ với các triệu chứng: ruột non sung huyết phù nề, đôi khi hoại tử. độc tố gây độc thần kinh, gây hôn mê, co giật. Nội độc tố có 2 loại: loại sung huyết và mụn loét.  Ngoại độc tố: tác động vào thần kinh và ruột, và chỉ hình thành trong điều kiện invivo và trong môi trường nuôi cấy yếm khí (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997). - Tính kháng thuốc:  Theo Bùi Thị Tho (2003), Salmonella có khả năng đề kháng với các kháng sinh sau: chloramphenicol (37,4 – 68,1%), tetracycline (33,4 – 59,6%), streptomycin (74,6-89,24%). Những kháng sinh dùng nhiều và rộng rãi thì tỷ lệ kháng thuốc cao như: streptomycin, sulfonamid, chlortetracycline  Năm 2001, tại Đồng Bằng Sông Cửu Long, Trần Thị Phận và ctv đã nghiên cứu về sự nhạy cảm đối với kháng sinh của 30 chủng Salmonella phổ biến và phát hiện được các chủng kháng kháng sinh với tỷ lệ: ampicillin (54,5 %), chloramphenicol (36 %), tetracycline (36 %) và cephalexin (9 %).  Theo Natsue Ogasawara et al. (2001), giá trị MIC50 MIC90 của các chủng Salmonella spp. được phân lập tại đồng bằng sông cửu long đối với oxytetracycline (MIC50 =2µg/ml và MIC90 = 128 µg/ml), streptomycin (MIC50 và MIC90 = 8 µg/ml), kanamaycin (MIC50 và MIC90 = 2 µg/ml), ampicillin (MIC50 =1 µg/ml và MIC90 = 2 µg/ml), cefazolin (MIC50 và MIC90 = 1 µg/ml). - Tính gây bệnh:  Trên động vật vi khuẩn Salmonella gây bệnh thương hàn và phó thương hàn cho gia súc, gia cầm. Bình thường có thể phát hiện Salmonella trong ruột của bò, heo, gà và một số động vật khỏe mạnh khác. Khi sức đề kháng của động vật giảm Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 25 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái sút, vi khuẩn sẽ xâm nhập vào nội tạng và gây bệnh. Trâu bò đang cho sữa bị nhiễm Salmonella thì lượng sữa sẽ giảm hoặc mất.  Trong phòng thí nghiệm, chuột bạch cảm nhiễm nhất. Ngoài ra, có thể dùng chuột lang hay thỏ. Sau khi tiêm vi khuẩn Salmonella vào dưới da hoặc phúc mạc thì ở chỗ tiêm phát sinh thuỷ thủng, sưng, mưng mủ loét. Sau 4 – 5 ngày hoặc 8 – 10 ngày con vật gầy ốm dần rồi chết (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997).  Ngoài ra, Salmonella còn gây bệnh nhiễm trùng huyết ở bò cái đẻ và gây còi cọc ở bò trưởng thành đang cho sữa (Sojka et al., 1974). Hình 1.10. Hình ảnh của Salmonella spp kính hiển vi điện tử quét SEM c) Escherichia coli - Vi khuẩn Escherichia coli được phát hiện đầu tiên vào những năm 1885 với tên gọi Bacterium coli commune từ các chủng vi khuẩn đường ruột. Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, loài Escherichia (Đào Trọng Đạt và ctv, 1999). - Đặc điểm: Theo Nguyễn Như Thanh và ctv (1997), Escherichia coli là một trực khuẩn hình gậy, ngắn, kích thước 2 – 3 µ x 6 µ. Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Phần lớn Escherichia coli di động do có lông ở xung quanh thân, nhưng một số không thấy di động, không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Escherichia coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản. - Sức đề kháng: Escherichia coli bị diệt ở nhiệt độ 55oC trong 1 giờ. Ở 60oC bị diệt trong vòng 15 – 30 phút, chết ngay ở 100oC. Các chất sát trùng acid phenic, clorua thủy ngân (II), formon có thể diệt Escherichia coli trong 5 phút. Escherichia coli đề kháng với sự sấy khô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). - Tính sinh độc tố: Escherichia coli tiết 2 loại độc tố: ngoại độc tố và nội độc tố Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 26 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái  Ngoại độc tố: Phá hủy thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh.  Nội độc tố: Phá hủy thành mạch máu, làm tăng huyết áp, gây ngộ độc thần kinh và biểu hiện nhiều triệu chứng khác - Tính kháng thuốc:  Escherichia coli nhạy cảm tuyệt đối với ciprofloxacin, gentamycin, neomycin, ofloxacin và kanamycin (100 %). Riêng đối với ampicillin là 86,67 % và bactrim là 80 % (Nguyễn Ngọc Thanh Hà, 2004).  Tuy nhiên, theo Phan Trọng Hổ và ctv (2001) thì Escherichia coli đề kháng cao với chloraphenicol (86,79 %), penicillin (83,02 %). Kháng thấp với neomycin (11,32 %), polymycin B (13,21 %), furazolidon (15,09 %). - Tính gây bệnh:  Hầu hết các loài gia súc, gia cầm, chim muông, bò sát đều có thể cảm nhiễm Escherichia coli (Đào Trọng Đạt và ctv, 2001).  Theo Nguyễn Như Thanh và ctv (1997), Escherichia coli có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ có tác động gây bệnh khi sức đề kháng trong cơ thể con vật giảm (do chăm sóc, nuôi dưỡng, do cảm lạnh hoặc cảm nắng).  Người ta thường gọi Colibacillosis là một bệnh đường ruột của ngựa, bê, cừu, heo và gia cầm non do Escherichia coli gây ra. Hình 1.11. Ảnh vi điện tử ở nhiệt độ thấp của một nhóm vi khuẩn E.coli, được phóng đại 10.000 lần. 1.4. Một số bài báo nghiên cứu khoa học về cây ổi 1.4.1. Bài báo nghiên cứu khoa học trong nước [1], [9], [12] Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 27 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái 1. Nguyễn Vân Anh. “So sánh hoạt tính kháng khuẩn của lá 4 nhóm ổi ruột đỏ (Psidium Guajava L.)”. Cần Thơ – năm 2012. - Bốn nhóm Ổi Ruột Đỏ (Psidium gaujava) được trồng cùng điều kiện (nhiệt độ, ánh sáng, dinh dưỡng,) được tiến hành chiết xuất với methanol bằng phương pháp ngâm để thu được cao ổi. - Kết quả:  Cao lá 4 nhóm ORD có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên tất cả chủng vi khuẩn thử nghiệm và mạnh nhất trên vi khuẩn Staphylococcus aureus (32 µg/ml ≤ MIC ≤ 128 µg/ml), đây là vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên gia súc gia cầm và con người, có khả năng đề kháng cao với các kháng sinh nhóm -lactams và là nguyên nhân gây viêm vú ở bò sữa, viêm da có mủ ở chó (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997; Lưu Hữu Mãnh, 2009).  Cao lá ORD cũng có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên P. aeruginosa (MIC = 512 µg/ml), đây là vi khuẩn có khả năng mạnh với cefoperazone và nhóm aminoglycoside (Hoàng Kim Tuyến và ctv, 2005), và là nguyên nhân gây bệnh cho nhiều loài vật như: viêm teo mũi, viêm tử cung ở bò, chứng chảy nước mũi ở tai chó mèo, nhiễm trùng máu ở gà (Carter, 1978). 2. Nguyễn Thành Lộc. “Báo cáo nghiên cứu dược liệu cây ổi (Psidium Guajava L.)”. Cần Thơ – năm 2018. - Kết quả: Về định tính: đã chỉ ra được nhiều thành phần có trong có trong dược liệu ổi như: tinh dầu, flavonoid, tannin, chất béo, Ngoài ra sau khi khảo sát hệ dung môi khác nhau với nhiều tỉ lệ khác nhau thì nhận thấy rằng hệ dung môi: chloroform – ethyl acetat – acid formic (5:5:1) cho được vết tách rõ và đẹp nhất khi chấm sắc ký. 3. Nguyễn Thị Ngọc Lan. “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học các hợp chất trong lá ổi non (Psidium Guajava L)”. - Tiến hành ngâm lá ổi non trong các dung môi khác nhau n-hexan, chloroform, etylaxetat, cồn tuyệt đối trong 3 ngày. Sau đó pha loãng đem đo UV – VIS để xác định dung môi tối ưu. - Kết quả: Bằng cảm quan thì thấy dịch chiết trong dung môi cồn tuyệt đối cho màu xanh đậm và theo kết quả đo UV-VIS ở bảng 1.2 thì mật độ quang của dịch chiết trong dung môi cồn tuyệt đối là lớn nhất. Do đó cồn tuyệt đối là dung môi tối ưu để chiết thành phần hóa học các hợp chất trong lá ổi non. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 28 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái Bảng 1.2. Màu sắc và mật độ quang của các dịch chiết ngâm trong các dung môi khác nhau STT Tên dung môi Màu sắc Mật độ quang 1 n-hexan Vàng nhạt 0.1814 2 Chloroform Vàng xanh 0.3046 3 Etyl acetat Xanh nhạt 2.5914 4 Cồn tuyệt đối Xanh đậm 2.6128 1.4.2. Bài báo nghiên cứu khoa học ngoài nước [13],[14] 1. “Antimicrobial Activities of Leaf Extracts of Guava (Psidium guajava L) on Two Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria”, International Journal of Microbiology Volume 2013. - Kết quả:  Chứng minh tiềm năng kháng khuẩn của chiết xuất lá Psidium guajava bằng cách sử dụng các dung môi khác nhau. Kết quả chỉ ra rằng ethanol và metanol tốt hơn n-hexane và nước để chiết xuất các đặc tính kháng khuẩn của lá ổi.  Cũng chỉ ra rằng chất chiết xuất từ lá ổi không có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram âm, cho thấy chúng không chứa các hoạt chất chống lại các sinh vật. Sự ức chế quan sát được của vi khuẩn gram dương, Bacillus cereus và Staphylococcus aureus, cho thấy rằng ổi có các hợp chất chứa các đặc tính kháng khuẩn có thể ngăn chặn sự tăng trưởng khi chiết xuất bằng cách sử dụng metanol hoặc ethanol làm dung môi. 2. “Chemical Components and Bioactivities of Psidium guajava”, International Journal of Food Nutrition and Safety, 2014. - Cây Psidium guajava đã thu hút sự chú ý cho chất chống oxy hóa của nó tiềm năng. Khả năng chống oxy hóa của chiết xuất quả ổi đã được đánh giá bằng các xét nghiệm chống oxy hóa in vitro khác nhau (ABTS, DPPH và FRAP) (Martinez và cộng sự, 2012) - Kết quả:  Psidium guajava chiết xuất từ vỏ trái cây có khả năng làm giảm căng thẳng oxy hóa của tuyến tụy ở chuột bị tiểu đường streptozotocin gây ra (45 mg/kg). Kết quả Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 29 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái cho thấy dịch chiết nước Bổ sung vỏ trái cây Psidium guajava có thể làm giảm malondialdehyd (MDA) và protein carbonyl mức độ và hoạt động của mức độ superoxide effutase (SOD) và glutathione (GSH) cao hơn (Budin et al., 2013).  Tác dụng hạ đường huyết của ổi cũng liên quan đến khả năng chống oxy hóa của nó hoạt động (Huang và cộng sự, 2011). Bổ sung ổi hồng có thể làm giảm peroxid hóa lipid và tăng hoạt động của enzyme chống oxy hóa như catalase, superoxide effutase, glutathione peroxidase và glutathione reductase trong máu chuột tăng huyết áp tự phát (Nor và Yatim, 2011). 1.5. Các phương pháp kỹ thuật [3],[4] 1.5.1. Phương pháp phân tích khối lượng - Phương pháp phân tích khối lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hay ở dạng đơn chất có trong mẫu cần phân tích. - Nguyên tắc:  Chất cần phân tích được tách ra khỏi mẫu ở dạng hợp chất kết tủa  Kết tủa được lọc, rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi để chuyển thành dạng có công thức hóa học xác định (gọi là dạng cân)  Cân chính xác khối lượng dạng cân, dùng khối lượng và công thức hóa của dạng cân để tính hàm lượng chất cần phân tích Hình 1.12. Cân phân tích - Ưu điểm: Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 30 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái  Có độ chính xác cao (0.01%)  Đơn giản về nguyên tắc, dụng cụ phân tích thông thường  Độ đúng và độ lặp lại tốt (nếu làm cẩn thận) - Nhược điểm: Tốn kém thời gian do phải trải qua nhiều giai đoạn 1.5.2. Một số phương pháp chiết - Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Thường gặp chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ. - Mục đích: định tính, định lượng và xác định cấu trúc - Phân loại:  Chiết lỏng – lỏng  Chiết lỏng – rắn a) Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm - Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phân tử trong không gian, có tần số lớn hơn giới hạn ngưỡng nghe của con người (16 – 20KHz). - Siêu âm làm dung môi bị sủi bọt, đẩy tạp chất ra khỏi bề mặt mẫu. Bản chất sóng siêu âm khác với sóng điện từ. - Nguyên tắc: dưới tác dụng của siêu âm làm cho dung môi tại các hốc nhỏ (ví dụ: dược liệu) bị sủi bọt, đấỷ chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào dung môi (chiết xuất). - Ưu điểm:  Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành dễ dàng, không quá đắt tiền.  Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi khá đa dạng.  Lượng mẫu: có thể lên đến hàng trăm gam.  Giảm được nhiệt độ và áp suất  áp dụng để chiết cho các hoạt động chất không bền với nhiệt.  Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết làm tiết kiệm năng lượng đầu vào. - Nhược điểm:  Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 31 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái  Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một lượng dịch chiết hoặc chiết chiết có thể bị nhiễm bẩn.  Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. b) Phương pháp ngâm - Là phương pháp cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu lấy dịch chiết. Tùy theo nhiệt độ chiết xuất, chia thành:  Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với những dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt.  Hãm: cho dung môi vào dược liệu đã chia nhỏ trong một thời gian xác định, có thể khuấy trộn, thường dung cho hợp chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao.  Hầm: ngâm dược liệu đã chia nhỏ với dung môi trong một bình kín, giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định, thỉnh thoảng có khuấy trộn, thường áp dụng với những chất ít tan ở nhiệt độ thường, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao.  Sắc: đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong một thời gian nhất định - Tùy theo số lần ngâm chia thành:  Ngâm một lần với toàn bộ dung môi  Ngâm nhiều lần với từng phân đoạn dung môi - Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền. - Nhược điểm:  Năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu).  Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu.  Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết. c) Phương pháp chiết soxhlet - Tiến hành: dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu. Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông bình cầu cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu. Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt. Trường Đại Học Bà Rịa – Vũng Tàu Báo cáo đề tài khoa học và công nghệ cấp trường Chủ nhiệm: Nguyễn Thị Song Anh 32 Hướng dẫn khoa học: Th.S.Nguyễn Quang Thái - Ưu điểm:  Quá trình chiết xuất liên tục  Tốn ít dung môi hơn các phương pháp trên - Nhược điểm:  Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy.  Không thực hiện liên tục được sự khuấy trộn Hình 1.13. Mô hình soxhlet 1.5.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch - Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al. (2000). Chủng v