Đề tài Nghiên cứu chiết tách thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không ở Bà Rịa – Vũng Tàu

ào bình chưng cất phải đi qua bộ phận tách nước. với hơi nước có áp suất cao thường gây ra sự phân hủy quan trọng, nên tốt nhất là bắt đầu chưng cất với hơi nước ở áp suất thấp và cao dần cho đến khi kết thúc. Không có một quy tắc chung nào cho mọi loại nguyên liệu vì chất nạp đòi hỏi một kinh nghiệm và yêu cầu khác nhau. Hiệu suất và chất lượng tinh dầu phụ thuộc vào đặc tính của tinh dầu và cách chọn phương pháp chưng cất. 1.5. Phương pháp định tính thành phần trong dịch chiết lá Trầu không bằng các phản ứng và thuốc thử Tiến hành định tính một số thành phần hoá học trong dịch chiết lá Trầu không: - Định tính nhóm Anthranoid bằng phản ứng Borntraeger. - Định tính nhóm Steroid – triterpenoid bằng: Thuốc thử Salkowski, Liebermann – Burchard, Rosenthaler,... - Định tính alkaloid bằng: Thuốc thử Mayer, Wagner. - Định tính nhóm flavonoid bằng: Dung dịch FeCl3 bão hoà, H2SO4 đặc. - Định tính nhóm saponin bằng khả năng tạo bọt, định tính chỉ số tạo bọt. - Định tính nhóm tanin bằng: dung dịch FeCl3 1.6. Các phương pháp phân tích sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) dùng để xác định thành phần trong tinh dầu [5] 1.6.1. Phương pháp sắc ký khí (GC) [5] - Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong tinh dầu sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tách nên có thời gian lưu khác nhau. - Trong sắc ký khí, pha động (hay là pha chuyển động) là một khí mang, thường là một khí trơ như Heli hoặc một khí không hoạt động như Nitơ. Pha tĩnh là một vi lớp chất lỏng hoặc polyme được phủ trên một lớp rắn đặt trong một ống thủy tinh hoặc kim loại được gọi là cột (tương tự cột tách phân đoạn được sử dụng trong chưng cất). Thiết bị được dùng để tiến hành sắc ký khí được gọi là máy sắc ký khí (hoặc là máy tách khí hoặc máy ghi khí). Các hợp chất ở dạng khí cần phân tích sẽ tương tác với thành cột – được phủ bởi pha tĩnh, dẫn đến từng hợp chất được tách ra tại những thời điểm khác nhau – gọi là thời gian lưu của hợp chất. Khi các chất hóa học đi ra ở cuối cột, sẽ được phát hiện và xác định bằng điện tử. Ngoài ra, một số thông số khác có thể được sử dụng để thay đổi thứ tự hoặc khoảng thời gian lưu: tốc độ dòng khí mang, chiều dài cột và nhiệt độ. Phân tích bằng sắc ký khí dựa trên việc so sánh thời gian lưu này. Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 18 SVTH: Phạm Minh Tú - Trên sắc ký đồ ta thu được các tính hiệu tương ứng với các cấu tử cần tách gọi là peak. Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trong cho chất cần tách (định tính). Còn diện tích của peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp nghiên cứu.  Điểm khác nhau giữa sắc ký khí và các phương pháp dùng sắc ký khác (sắc ký cột, HPLC, TLC): - Quá trình tách các hợp chất trong một hỗn hợp được tiến hành giữa một pha lỏng tĩnh và một pha khí động, trong khí đó ở sắc ký cột pha tĩnh ở dạng rắn và pha động ở dạng lỏng. - Cột mà pha khí đi qua được đặt trong lò cột có thể điều chỉnh được nhiệt độ khí, trong khí đó ở sắc ký cột (điển hình) không có sự điều chỉnh nhiệt độ đó. - Nồng độ của một hợp chất ở pha khí chỉ phụ thuộc vào áp suất bay hơi của khí.  So sánh Sắc ký khí với chưng cất phân đoạn:  Giống nhau: cả hai quá trình này đều tách các hợp chất từ một hỗn hợp chủ yếu dựa vào sự khác biệt của điểm sôi (hoặc áp suất bay hơi).  Khác nhau: chưng cất phân đoạn thường được dùng để tách các hợp chất từ một hỗn hợp ở qui mô lớn còn sắc ký khí được sử dụng ở qui mô nhỏ hơn nhiều (tức là mức độ vi lượng). Sắc ký khí đôi khi còn được hiểu là sắc ký pha hơi (VPC) hoặc sắc ký phân đoạn khí – lỏng (GLPC). Nói một cách chính xác, GLPC là thuật ngữ chính xác nhất và do vậy được nhiều tác giả sử dụng. Các thành phần của máy sắc ký khí: Hình 1. 2: Hệ thống sắc ký khí GC (Gas Chromatography) Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 19 SVTH: Phạm Minh Tú  Nguyên lý hoạt động: - Nhờ có khí mang trong chứa trong bơm khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng bay hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buông điều nhiệt. quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện. tín hiệu này được khuyến đại rồi chuyển sang bộ ghi, tính phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu được xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả. Trên sắc ký đồ nhận được, sẽ có tín hiệu ứng với các cấu tử được tách gọi là peak. Thời gian lưu của peak là đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích diện tích peak là thước đo định lượng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu. - Sắc ký đồ là tập hợp tất cả các peak, mỗi peak đại diện cho mỗi chất. Dựa vào thời gian lưu ta có thể xác định được tên chất và đo diện tích mỗi peak ta xác định được thành phần mỗi chất trong hỗn hợp.  Ứng dụng: chủ yếu của sắc ký khí bao gồm kiểm tra độ tinh sạch của một chất cụ thể, hay tách các chất khác nhau ra khỏi một hỗn hợp (khối lượng của các chất này cũng có thể được xác đinh một cách tương đối). Trong một số trường hợp, kỹ thuật sắc ký khí có thể dùng để xác định một hợp chất nào đó. Trong sắc ký điều chế, phương pháp ký khí được sử dụng để tinh chế các hợp chất từ một hỗn hợp. 1.6.2. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) [5] Hệ thống sắc ký khí khối phổ là một detector khối phổ được ghép nối với thiết bị sắc ký khí nối với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bỏ khí mang N2, He để giảm áp suất của dòng áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc ký dùng mao quản, phần khối phổ sử dùng buồng ion Hình 1. 3: Sắc ký đồ Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 20 SVTH: Phạm Minh Tú hóa với bộ tách từ cực và detector khối phổ.  GC – MS bao gồm:  Sắc ký khí (GC): sắc ký khí là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích, các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh.  Khối phổ (MS): khối phổ là phương pháp phân tích mà trong đó hợp chất xét nghiệm được ion hóa và phá thành các mảnh trong thể khí dưới chân không cao (10 – 6mmHg). Sau quá trình ion hóa, các hạt có điện tích đó được gia tốc trong một điện trường, được tách trong một từ trường theo tương quan giữa khối lượng và điện tích của chúng và được ghi nhận theo cường độ của các hạt đó. Dùng để xác định định tính và định lượng.  Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động: - Cửa tiêm mẫu (injection port): 1 microliter dung môi chứa hỗn hợp các chất sẽ được tiêm vào hệ thống ở cửa này. Mẫu sau đó được dẫn qua hệ thống bởi khí trơ, thường là helium. Nhiệt độ ở cửa tiêm mẫu được nâng lên 300c để mẫu trở thành dạng khí. - Vỏ ngoài (oven): phần vỏ của hệ thống GC chính là lò nung đặc biệt. Nhiệt độ của lò này dao động từ 40 – 320oC. - Cột (cloumn):  Bên trong hệ thống GC là một cuộn ống nhỏ hình trụ có chiều dài 30m với mặt trong được tráng bằng một loại polymer đặc biệt. Các chất trong hỗn hợp được phân tách bằng cách chạy dọc theo cột này.  Sau đó đi qua cột sắc ký khí, các hóa chất tiếp tục đi vào pha khối phổ. ở đây chúng bị ion hóa. Sau khi khối phổ, chúng sẽ tới bộ phận lọc dựa trên khối lượng, bộ lọc Hình 1. 4: Sơ đồ sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 21 SVTH: Phạm Minh Tú lựa chọn chỉ cho phép các hạt có khối lượng nằm trong một giới hạn nhất định đi qua. Thiết bị cảm biến có nhiệm vụ đếm số lượng các hạt có cùng khối lượng. Thông tin này sau đó được chuyển đến máy tính và xuất ra kết qua gọi là khối phổ. Khối phổ là một biểu đồ phản ánh số lượng các ion với các khối lượng khác nhau đã đi qua bộ lọc. - Máy tính: bộ phận chịu trách nhiệm tính toán các tín hiệu do bộ cảm biến cung cấp và đưa ra kết quả khối phổ.  Ứng dụng của phương pháp sắc ký khí khối phổ: - Xác định công thức phân tử, dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trong phổ đồ. - Xác định công thức cấu tạo: dựa vào giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân tử cũng như ion mảng. - Định lượng thành phần nguyên tố của ion cần xác định. 1.7. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn [17] 1.7.1. Phương pháp khuếch tán đĩa Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từ ống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5ml môi trường TSB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ 370C. Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200μL dịch khuẩn, nồng độ tương đương 4-5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6mm sao cho mỗi giếng cách nhau 2- 3 cm. Chuẩn bị tinh dầu thử bằng cách hòa tan tinh dầu trong Dimethyl Sulfoxide (DMSO 2%), TWEEN 80 0,2% thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50μL dịch chiết thử vào các giếng thạch trên đĩa petri và giữ các đĩa thí nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 2 tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 370C trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng sinh ( Ampicilin 10𝜇g/ml, Tetracyclin 30 𝜇g/ml, Amoxilin 10𝜇g/ml); đối chứng âm là DMSO 2% và TWEEN 80 0,2%. Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức: BK (mm) = D-d; trong đó D = đường kính vòng vô khuẩn và d = đường kính lỗ khoan thạch (giếng). Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị trung bình. Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 22 SVTH: Phạm Minh Tú 1.8. Giới thiệu một số chủng vi khuẩn [2], [6], [16] Bacillus cereus là loài vi khuẩn gram dương, hình que, hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. Từ những năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều. Theo phân loại khoa học, Bacillus cereus thuộc: – Giới (Kingdom): Bacteria – Ngành (Division): Firmicutes – Lớp (Class): Bacilli – Bộ (Order): Bacillales – Họ (Family): Bacillaceae – Giống (Genus): Bacillus – Loài (Species): Bacillus cereus Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5 - 1,5 µm x 2 - 4 µm. Vi khuẩn không tạo giáp mô, không có khả năng di động. Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.  Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kị khí tùy nghi, sống ở nhiệt độ thích hợp 5 – 50 0C, tối ưu 35 – 40 0C, độ pH 4,5 - 9,3, thích hợp 7 - 7,2. + Trên môi trường NA hay TSB sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì. + Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng. + Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng. Hình 1. 5: Vi khuẩn Bacilus cereus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MP Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 23 SVTH: Phạm Minh Tú + Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng. + Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn  Tính chất sinh hóa: + Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên men mannitol. + Khử nitrat thành nitrit. + Phản ứng VP (+) + Phân giải Tyroxin + Catalase (+), Citrate (+) + Mọc trên NB + 0,001% lyzozym  Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố + Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt, rau quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng. + Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày. b) Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus do Robert Koch (1843-1910) phát hiện vào năm 1878, phân lập từ mủ ung nhọt và Loius Pasteur (1880) đều nghiên cứu tụ cầu khuẩn từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học. Phân loại khoa học: – Giới (Kingdom): Eubacteria – Ngành (Division): Firmicutes – Lớp (Class): Bacilli – Bộ (Order): Bacillales – Họ (Family): Staphylococcaceae – Giống (Genus): Staphylococcus – Loài (Species): Staphylococcus aureus Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 24 SVTH: Phạm Minh Tú - Giống Staphylococcus có hơn 20 loài khác nhau, trong đó có 3 loài tụ cầu có vai trò trong y học: + Staphylococcus aureus (S. aureus): Tụ cầu vàng được xem là tụ cầu gây bệnh. + Staphylococcus epidermidis (Tụ cầu da). + Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng ở môi trường thông thường, không thể sinh trưởng ở nhiệt độ thấp. Theo Mc Landsborough L. (2005), nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của S. aureus là 18 – 40 0C, pH = 7,2. Tuy nhiên mọc tốt nhất ở 250C, hiếu khí hay kỵ khí tuỳ ý. Ở canh thang, sau 5 – 6 giờ làm đục môi trường, sau 24 giờ làm đục rõ. Ở môi trường đặc, khuẩn lạc tròn lồi, bóng láng, óng ánh có thể có màu vàng đậm, màu vàng cam hoặc màu trắng, tương đối lớn sau 24 giờ. Ngoài ra S. aureus có thể sinh trưởng được trên môi trường có hoạt độ thấp hơn các loài vi khuẩn khác hoặc môi trường có nồng độ muối cao. Khi phát hiện trong môi trường, tạo sắc tố vàng sau 1 - 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng và đều tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 150C, nhiều nhất là khi tăng trưởng ở 35 – 37 0C. Staphylococcus aureus có trong nhiều môi trường sống, thường sống ký sinh vô hại, nhưng cũng có thể gây bệnh, đặc biệt là khi Staphylococcus aureus (SA) xâm nhập hoặc xuyên qua da, chúng có thể gây ra nhiều loại nhiễm trùng khác nhau, chẳng hạn như các sự nhiễm trùng da, làm loét, phỏng da hoặc các sự nhiễm trùng nặng trong máu, phổi hoặc các mô khác.  Tính chất sinh hoá và đề kháng: + Tụ cầu vàng tương đối chịu nhiệt và thuốc sát khuẩn hơn những vi khuẩn khác, chịu độ khô và có thể sống ở môi trường nồng độ NaCl cao (9%), nhiều chủng tụ cầu vàng đề kháng với penicillin và các kháng sinh khác. Hình 1. 6: Vi khuẩn Staphylococus aureus trên kính hiển vi và trên môi trường thạch MSA Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 25 SVTH: Phạm Minh Tú + S. aureus có phản ứng DNase, Catalase (+) chuyển hoá hydrogen peroxit thành nước và oxygen, phosphase (+), có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose, desoxyribonuclease là enzyme phân giải DNA. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine.  Cấu trúc kháng nguyên: + Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharide, acid teichoic ở vách tế bào. + Vách tế bào chứa kháng nguyên polysaccharide, kháng nguyên protein A ở bề mặt. Người ta có thể căn cứ vào các kháng nguyên trên để chia tụ cầu thành nhóm, tuy nhiên phản ứng huyết thanh không có giá trị trong chẩn đoán vi khuẩn.  Độc tố - Enzym: + Khả năng gây bệnh của tụ cầu vàng là do vi khuẩn phát triển nhanh và lan tràn rộng rãi trong mô cũng như tạo thành nhiều độc tố và enzyme. Một số chủng thuộc loài S. aureus có khả năng sinh tổng hợp enterotoxin khi chúng nhiễm vào thực phẩm + Độc tố: Hầu hết các dòng S. aureus có thể tổng hợp enterotoxin trong môi trường có nhiệt độ trên 150C hơn cả vi khuẩn. Độc tố ruột enterotoxin sản xuất bởi S. aureus là một protein ổn định nhiệt, nhiều nhất khi tăng trưởng ở nhiệt độ 35 – 37 0C và có thể tồn tại nhiệt ở 1000C trong vòng 30 – 700 phút. + Các enzyme ngoại bào: • Protease phân giải protein của tế bào chủ. • Deoxyribonuclease (DNase) phân giải DNA và các enzyme sửa đổi acid béo (FAME). c) Escherichia coli Theodor Escherich là người đầu tiên phát hiện ra loài vi khuẩn này trong quá trình điều trị và nghiên cứu về các trẻ bị bệnh tiêu chảy vào năm 1885. Vì loài này kí sinh trong ruột già (tiếng Latinh là colum), nên ông đặt tên nó là Bacterium coli (vi khuẩn coli). Ông báo cáo phát hiện này vào năm 1885, trong thuyết trình của mình nhan đề “Vi khuẩn đường ruột ở trẻ sơ sinh” cho Hiệp hội Hình thái và Sinh lý học. Đến năm 1886, sau 18 tháng nghiên cứu, ông cho xuất bản cuốn sách với tựa đề "Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung". Phân loại khoa học: Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 26 SVTH: Phạm Minh Tú – Giới (Kingdom): Bacteria – Ngành (Division): Proteobacteria – Lớp (Class): Gammaproteobacteria – Bộ (Order): Enterobacteriales – Họ (Family): Enterobacteriaceae – Giống (Genus): Escherichia – Loài (Species): E.coli Escherichia coli là một loại vi khuẩn gram âm, kỵ khí không bắt buộc, vi khuẩn có hình roi thường tìm thấy bên trong phần dưới của ruột của các động vật máu nóng. Chúng thường không gây bệnh, nhưng một số chủng có thể gây nên tiêu chảy và nhiễm trùng sinh mủ. Khi quan sát dưới kính hiển vi, các nhà nghiên cứu nhận thấy rằng vi khuẩn E coli có hình que, chiều dài của chúng dao động từ 1 μm đến 5 μm. Một số loài có thể di chuyển bằng roi, một số ít thì ở yên một chỗ không có khả năng di động. Chúng không thể tạo bào tử như nhiều loại vi khuẩn khác. Sinh trưởng ở 15 – 40 0C nhưng nhiệt độ thích hợp nhất là 370C, pH từ 6,4 – 7,4. Mọc tốt trên môi trường thạch EMB, sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, hồng tím khoảng 2 – 3 mm.  Tính chất sinh hóa và đề kháng: + Có thể lên men chuyển hóa đường thành acid lactic + Hầu hết các loại vi khuẩn E coli đều có khả năng nitrat thành nitrit, sinh hơi. + Chịu được nhiệt, không bị hủy khi đun ở 1000C trong 2 giờ + Kháng cồn, không bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50% + Bị hủy bởi formol 5% + Rất độc, chỉ cần 0,05mg có thể giết chuột nhắc trong vòng 24 giờ. Hình 1. 7: Vi khuẩn Escherichia coli trên kính hiển vi và trên môi trường thạch EMB Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 27 SVTH: Phạm Minh Tú  Độc tố: + Một số E. coli sản sinh ra độc tố có tên là độc tố Shiga gây tiêu chảy và có thể dẫn đến bệnh nặng. Các E. coli sản sinh ra độc tố Shiga này đôi khi được gọi là STEC (phát âm là "S-TECK"). + Nhiễm STEC có thể gây ra hội chứng huyết tán tăng urê máu (HUS) có thể làm hư thận và các cơ quan khác. Hầu hết những người bị nhiễm STEC đều không tiến triển thành HUS, nhưng trẻ nhỏ và người cao tuổi thì lại có nguy cơ gia tăng. + Các loại E. coli khác có thể gây ra nhiễm khuẩn thận, bàng quang và các bộ phận khác trong cơ thể. d) Salmonella Được phân lập lần đầu vào năm 1880 bới Karl J. Erberth, S. typhi là một mầm bệnh đa cơ quan sinh sống ở các mô tuyến giao cảm của ruột non, gan, lá lách và máu của người nhiễm bệnh. Phân loại khoa học: – Giới (Kingdom): Bacteria – Ngành (Division): Proteobacteria – Lớp (Class): Gammaproteobacteria – Bộ (Order): Enterobacteriales – Họ (Family): Enterobacteriaceae – Giống (Genus): Salmonella enterica typhi Salmonella là một giống vi khuẩn hình que, trực khuẩn gram âm, kị khí tùy nghi, không tạo bào tử, di động bằng tiên mao, sinh sống trong đường ruột, có đường kính khoảng 0,7 µm đến 1,5 µm, dài từ 2 µm đến 5 µm và có vành lông rung hình roi. Phát triển tốt ở 6 – 42 0C, thích hợp nhất là 35 – 37 0C, pH từ 6 - 9, thích hợp nhất là 7,2. Ở nhiệt độ 18 – 40 0C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày. Hình 1. 8: Vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi và trên môi trường XLD Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 28 SVTH: Phạm Minh Tú Trên môi trường phân lập XLD khuẩn lạc có hình tròn, lồi, trong suốt, có tâm đen, môi trường chuyển sang màu vàng.  Tính chất sinh hóa và đề kháng: + Lên men đường manit, sorbitol (+) + Không lên men đường lactose, sucrose, salicin, inositol (-)  Độc tố: vi khuẩn Salmonella có thể tiêt ra 2 loại độc tố: + Nội độc tố: rất mạnh gồm 2 loại: Gây xung huyết và mụn loét; độc tố ở ruột gây độc thần kinh, hôn mê, co giật. + Ngoại độc tố: chỉ phát hiện khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, đem cấy truyền 5 đến 10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có thể gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột. e) Pseudomonas aeruginosa Phân loại khoa học: – Giới (Kingdom): Bacteria – Ngành (Division): Proteobacteria – Lớp (Class): Gammaproteobacteria – Bộ (Order): Pseudomonadales – Họ (Family): Pseudomonadaceae – Giống (Genus): Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa (hay còn gọi là Trực khuẩn mủ xanh) là một vi khuẩn phổ biến gây bệnh ở động vật và con người. Nó được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí ôxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo. Hình 1. 9: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa trên kính hiển vi và trên môi trường MP Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 29 SVTH: Phạm Minh Tú Đây là vi khuẩn Gram âm, hiếu khí, hình que với khả năng di chuyển một cực. Ngoài việc một là mầm bệnh cơ hội cho con người, P. aeruginosa còn được biết đến như là mầm bệnh cơ hội cho thực vật.  Tính chất sinh hóa và đề kháng:  Phản ứng dương tính với catalase, citrate, oxidase,  Phản ứng âm tính với các thử nghiệm MR (Methyl Red), VP (Voges Proskauer) và indole  Khả năng khử nitrate thành nitrite, hóa lỏng dung dịch có chứa gelatin  Khả năng thủy phân casein và tạo enzyme lipase nhưng lại không thủy phân được tinh bột  Không có khả năng lên men glucose và lactose để tạo acid  Độc tố: + Lây nhiễm và phá hủy các mô của người bị suy giảm hệ miễn dịch. Triệu chứng chung của việc lây nhiễm thông thường là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng huyết. Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người. Vi khuẩn cũng được phát hiện trên các dụng cụ y khoa, gây ra nhiễm khuẩn bệnh viện và phòng mạch. Đây cũng là nguyên nhân gây ra viêm chân lông. Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 30 SVTH: Phạm Minh Tú CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Nguyên liệu sử dụng chiết tinh dầu trong nghiên cứu này là: lá Trầu không được trồng tại xã Nghĩa Thành, Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. - Nguyên liệu tươi, không bị nấm mốc, đạt độ trưởng thành và không bị sâu bệnh. 2.1.2. Dụng cụ thiết bị và hóa chất a) Dụng cụ thiết bị Bảng 2. 1: Bảng dụng cụ thiết bị Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng Nồi inox dung tích 5 lít 1 Nhiệt kế 1 Ống sinh hàn ruột thẳng 1 Đũa thủy tinh 1 Bộ Clevenger 1 Phễu chiết (250ml) 1 Cân phân tích (0.001g) 1 Ống đong (500ml) 1 Bình định mức(500ml) 1 Erlen (150ml) 2 Tủ lạnh 1 Cốc thủy tinh (500ml, 250ml,100ml) 5 Bếp điện 1 Bóp cao su 1 Đĩa petri 20 Pipet ( 10ml, 5ml) 2 Giấy tròn kháng khuẩn 50 lỗ Ống nghiệm 20 Ống tiêm 1ml/1cc 3 Màng bọc thực phẩm 1 cuộn Hình 2. 1: Lá Trầu không Trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu Viện Kỹ Thuật – Kinh Tế Biển, Ngành CNKT Hóa Học GVHD: Vũ Thị Hồng Phượng 31 SVTH: Phạm Minh Tú b) Hóa chất: - Nước cất - Na2SO4 khan - Mueller Hinton Agar (MHA) - DMSO 2% - Tryptic Soy Broth (TSB) - Potato Dextrose Agar (PDA) - Mueller Hinton Broth (MHB) - Tween 80 0,2% - I2 - KI - HCl 4N - FeCl3 20% - NaOH 10% - H2SO4đđ 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau: - Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian ngâm và thời gian chưng cất. - Nghiên cứu phương pháp xác định chỉ tiêu hóa – lý của tinh dầu. - Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong tinh dầu trầu không dựa trên kết quả các bài nghiên cứu khoa học khác,