Đề tài Thiết kế thang chuẩn ADN

g thang chuẩn 100 bp đa dạng và phong phú, đáp ứng mọi nhu cầu của người sử dụng [41, 42]. Bảng 2. Giá thành ADN ladder 100 bp năm 2010 của một số hãng thương mại chưa bao gồm thuế nhập khẩu, tham khảo trên webside: www.lablife.org. Hãng sản xuất Số đường chạy điện di Giá bán sản phẩm chưa bao gồm thuế Fermentas - Đức 100 62 $ Invitrogen - Mỹ 100 198 $ New England Biolabs - Anh 100 53 $ Promega - Thụy Sỹ 100 148 € Roche - Mỹ 100 218 $ Hình 6. (A): ADN ladder 100 bp của một số hãng sản xuất thương mại [41]; (B): Ảnh ADN ladder 100 bp kết hợp với ADN ladder 500 bp (Fermentas) [33]. 1.2.2. Sản xuất ADN ladder 100 bp ADN ladder 100 bp thương mại hiện bán trên thị trường thường gồm dải băng kích thước rộng, bước nhảy giữa hai băng kế tiếp là 100 bp giúp thang chuẩn ADN loại này được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu khác nhau. ADN ladder 100 bp được đầu tư, sản xuất và cung ứng bởi nhiều hãng sản xuất trên thế giới [37, 47]. Từ những tài liệu mà chúng tôi có được cho thấy hầu hết thang chuẩn loại này được sản xuất nhờ áp dụng kỹ thuật PCR [7], Multiplex PCR [24], kỹ thuật ADN tái tổ hợp [17]. Giá thành ADN ladder 100 bp thương mại tương đối cao [7, 24]. Tại phòng thí nghiệm của chúng tôi thang chuẩn ADN 100 bp có nhu cầu sử dụng hàng ngày. Chúng tôi đặt mua thang chuẩn từ nước ngoài nên không chủ động được nguồn cung cấp, phụ thuộc thời gian vận chuyển, giá thành cao do phải chịu thêm thuế nhập khẩu và chi phí vận chuyển. Xuất phát từ nhu cầu sử dụng và những khó khăn khi đặt hàng chúng tôi tiến hành đề tài “Thiết kế thang chuẩn ADN” bước nhảy 100 bp. CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Hệ Vector 1. Vector pJET1.2 là vector tách dòng sản phẩm PCR, nằm trong bộ kit “CloneJETTM PCR Cloning Kit” của hãng Fermentas - Đức [12] (Phụ lục 01). 2. Vector pGEX-4T-1-Bre là vector pGEX-4T-1 (Phụ lục 02) mang đoạn ADN kích thước 114 bp, được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 3. Vector pJET1.2-8×100 là vector pJET1.2 mang các đoạn ADN kích thước 100 bp tự nối. 2.1.2. Các cặp mồi cho phản ứng PCR Cặp mồi Bre-F1/Bre-R1 được thiết kế để nhân bản đoạn ADN kích thước 108 bp từ đoạn ADN 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre. Cặp mồi pJET1.2-F/pJET1.2-R thiết kế dựa trên trình tự của vector pJET1.2, cung cấp theo “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12]. Cặp mồi pJET-800-F/pJET-800-R được thiết kế để khuếch đại đoạn ADN kích thước 1000 bp từ vector pJET1.2-8×100. Các mồi được cung cấp bởi hãng Bioneer - Hàn Quốc và IDT - Mỹ. Trình tự các cặp mồi được thể hiện trong Bảng 3. Bảng 3. Trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu. Cặp mồi Trình tự (5’-3’) Bre-F1 Bre-R1 ccg gaa ttc atg atc gag ggt agg aag ctt aaa aat ttt g ccg gaa ttc aca ctg gcc act gag ttt gc Trong đó: gaa ttc là vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI pJET1.2-F pJET1.2-R cga ctc act ata ggg aga gcg gc aag aac atc gat ttt cca tgg cag pJET-800-F pJET-800-R aac act tgt gcc tga aca cca tat c gaa aat ctt gag aga ata aaa gaa gaa cat cg 2.1.3. Chủng vi sinh vật Chủng E.coli DH5α Chủng E.coli DH5α được tạo ra từ chủng E.coli DH5 bởi Doug Hanahan vào năm 1985. Chủng vi khuẩn này được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp do nó mang một vài đặc điểm đặc trưng sau [25]: - Đột biến bất hoạt gen mã cho endonuclease nội bào, giúp bảo vệ plasmid. - Đột biến loại bỏ gen mã cho enzyme EcoKI sẽ bảo vệ các vị trí cắt của enzyme này trên phân tử ADN khi chúng không được methyl hóa. - Mang gen Δ(lacZ)M15 mã cho thụ thể nhận alpha (alpha acceptor) cần thiết cho quá trình sàng lọc xanh - trắng trên nhiều hệ vector. Chủng E.coli DH5α được chúng tôi sử dụng trong biến nạp vector pJET1.2-8×100. Chủng E.coli BL21(DE3) Chủng E.coli BL21 (DE3) được cải biến từ chủng E.coli tự nhiên và sử dụng làm vật chủ biểu hiện thông dụng với hầu hết các promoter (như lac, tac,). Chủng vi khuẩn này mang hai đặc điểm cơ bản [31]: - Đột biến gen mã cho protease ngoài màng tế bào, giúp bảo vệ các protein được biểu hiện khỏi sự phân giải protein. - Loại bỏ gen mã cho protease lon một enzyme làm giảm sút protein vi khuẩn và ức chế sự phân chia tế bào cho tới khi quá trình sửa chữa nhiễm sắc thể được hoàn thành. Nghiên cứu của chúng tôi sử dụng nguyên liệu ban đầu là chủng E.coli BL21 (DE3) mang vector pGEX-4T-1-Bre. 2.1.4. Hóa chất và trang thiết bị Hóa chất - Taq ADN polymerase (Fermentas - Đức); - dNTP mix 2 mM (Sigma - Mỹ, Takara - Nhật Bản); - Các enzyme cắt giới hạn (Fermentas - Đức, New England Biolabs - Anh); - Môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lubertini broth (LB) gồm các thành phần: 1% trypton; 0,5% cao nấm men ; 0,5% NaCl; 1,2% agar (môi trường đặc) [23]; - Các kit tách dòng gen của Fermentas - Đức [12, 14], tinh sạch sản phẩm PCR và tinh sạch ADN của Bioneer - Hàn Quốc [9, 10], tinh sạch plasmid và ADN của Qiagen - Đức [19, 20]; - Thang chuẩn 100 bp và 1 kb của Takara - Nhật Bản, Fermentas - Đức, New England Biolabs - Anh; - Các hóa chất khác đều đạt độ tinh sạch cao dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử. Trang thiết bị Các thiết bị và máy móc phục vụ cho nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Sinh Y - Khoa Sinh học; Phòng Genomic thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzyme - Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.2. SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM Toàn bộ quá trình nghiên cứu được tóm tắt trong Hình 7. Hình 7. Sơ đồ nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN SY - 100. 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp tách chiết plasmid từ vi khuẩn Plasmid tách chiết từ tế bào vi khuẩn theo hai phương pháp: Tách chiết plasmid sử dụng môi trường kiềm có SDS [21] + 1,5 ml dịch vi khuẩn bão hòa được đem ly tâm 8000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút, thu cặn, để khô + Thêm 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl, pH 8, glucose 50 mM, 10 mM EDTA pH 8), vortex tan cặn, ủ nhiệt độ phòng 10 phút + Thêm 200 µl dung dịch II (0,2 N NaOH, 1% SDS), đảo đều, ủ đá 3 phút + Thêm 150 µl dung dịch III (3 M potassium acetate, pH 5), đảo đều, ủ đá 5 phút + Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu dịch trong + Bổ sung 1 thể tích Phenol : Chloroform : Isoamyl (25 : 24 : 1), vortex đều + Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, thu dịch pha trên + Bổ sung thêm 0,6 lần thể tích Isopropanol, ủ nhiệt độ phòng 20 phút + Ly tâm 13000 vòng/phút ở 40C trong 20 phút, thu tủa + Để khô tủa hoàn toàn, hòa với nước khử trùng hoặc TE 1X, pH 8 Mẫu plasmid được bảo quản ở -200C. Tinh sạch plasmid sử dụng Kit của Qiagen [19] Plasmid sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR được tinh sạch bằng QIAprep Spin Miniprep Kit với quy trình được hướng dẫn cụ thể trong “QIAprep® Miniprep Handbook” [19]. 2.3.2. Kỹ thuật nối các đoạn ADN Một phản ứng nối các đoạn ADN thường diễn ra trong tổng thể tích từ 10 - 20 µl ở 40C đến 370C, sử dụng enzyme T4 ADN ligase, dung dịch đệm chứa Mg2+ và ATP [11, 14]. T4 ADN ligase tham gia xúc tác hình thành liên kết phosphodiester giữa các đầu tận cùng (có thể là đầu bằng hoặc đầu so le) của các đoạn ADN [11]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đoạn ADN kích thước 108 bp khuếch đại từ phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 sẽ được cắt hoàn toàn với EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu so le. Sản phẩm phản ứng cắt là các đoạn 100 bp sẽ tham gia phản ứng tự nối diễn ra ở 140C qua đêm. Các bước làm được chúng tôi tuân thủ theo quy trình phản ứng nối tham khảo trong “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12], “Gene JETTM PCR Cloning Kit procedure” [14] và “FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes” [13]. 2.3.3. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt Vector pJET1.2 mang đoạn chèn được biến nạp vào tế bào E.coli DH5α theo phương pháp sốc nhiệt. Tế bào khả biến DH5α đã được xử lý với CaCl2 giúp màng tế bào trở nên xốp hơn làm tăng khả năng tiếp nhận ADN. Biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt gồm các bước sau: Tạo tế bào khả biến [21] Tất cả các bước ly tâm trong quy trình làm tế bào khả biến được thực hiện ở 6000 vòng/phút, 40C trong 20 phút. Nuôi 50 ml dung dịch tế bào E.coli DH5α trong môi trường LB lỏng tại 370C, lắc 200 vòng/phút, tới khi dung dịch tế bào có giá trị mật độ quang (Optical Density - OD) ở bước sóng 600 nm nằm trong khoảng từ 0,4 - 0,6 Ủ mẫu trên đá khoảng 30 phút Ly tâm thu cặn tế bào Hòa cặn trong 15 ml dịch chứa MgCl2 80 mM và CaCl2 20 mM cho đến khi tạo dịch đồng nhất. Ly tâm thu cặn tế bào Hòa tan cặn trong CaCl2 100 mM tạo dịch đồng nhất, sao cho mật độ tế bào có giá trị OD 600 bằng 1 Ủ mẫu ở 40C qua đêm Bổ sung glycerol 100% đến nồng độ 15% Chia hỗn hợp tế bào khả biến vào các ống eppendorf 1,5 ml, bảo quản ở -800C. Biến nạp [15, 21]: Lấy tế bào khả biến từ -800C để cùng hỗn hợp nối ADN trên đá 5 phút Bổ sung 5 µl sản phẩm nối vào ống tế bào khả biến, búng nhẹ, ủ trên đá 20 phút Sốc nhiệt tại 420C trong 90 giây, để ngay lại trên đá 2 phút Bổ sung 1 ml LB lỏng, ủ 370C trong 20 phút, sau đó lắc 200 vòng/phút ở 370C trong 30 phút Ly tâm hỗn hợp 6000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, giữ lại 100 µl dịch và cặn Hòa cặn tạo dịch đồng nhất trong 100 µl còn lại, đem trải trên đĩa thạch LB có kháng sinh Nuôi cấy vi khuẩn ở điều kiện vô trùng, 370C qua đêm. 2.3.4. Phản ứng PCR Trong nghiên cứu của chúng tôi, có ba cặp mồi được sử dụng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau: Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2-F/R và khuôn là vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100. Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET-800-F/R với khuôn là vector pJET1.2-8×100 khuếch đại đoạn 1000 bp được cắt không hoàn toàn bằng HpaII tạo thang chuẩn 100 bp. Thành phần và điều kiện thực hiện các phản ứng PCR thay đổi theo từng cặp mồi (Bảng 4). Bảng 4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR. Thành phần phản ứng Điều kiện H2O - Biến tính 940C, 5 phút ở giai đoạn đầu - Chu kỳ lặp lại Biến tính: 940C, 30 giây Gắn mồi: 680C, 75 giây (với cặp mồi Bre-F1/R1); 600C, 30 giây (với cặp mồi pJET1.2-F/R); 660C, 30 giây (với cặp mồi pJET-800-F/R) Tổng hợp: 720C, 45 - 60 giây - Tổng hợp 720C, 5 - 7 phút ở giai đoạn sau cùng Đệm Taq ADN polymerase 10X dNTP mix (2 mM mỗi loại) Taq ADN polymerase (1 u/µl ) Mồi xuôi: Bre-F1 pJET1.2-F pJET-800-F Mồi ngược: Bre-R1 pJET1.2-R pJET-800-R ADN 2.3.5. Xác định nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nồng độ và độ tinh sạch của ADN trong các thí nghiệm được xác định bằng quang phổ kế, với độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (là độ hấp thụ của ADN) và 280 nm (là độ hấp thụ của protein). Nồng độ ADN được tính theo công thức: [ADN ] = A260 × n × 50 (µg/ml) Trong đó: A260 : độ hấp thụ của ADN ở bước sóng 260 nm n : số lần pha loãng mẫu 50 µg/ml : nồng độ ADN sợi đôi ứng với A260 = 1 ADN đạt độ tinh sạch khi tỷ lệ A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0. 2.3.6. Phản ứng cắt ADN sử dụng enzyme cắt giới hạn Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai enzyme cắt giới hạn là EcoRI (GˇAA TTC) và HpaII (CˇCGG) (Fermentas). - Sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 có kích thước 108 bp sẽ được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) tạo đầu dính. - Vector pJET1.2-8×100 mang đoạn ADN kích thước mong muốn sẽ được cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI (GˇAA TTC) kiểm tra vị trí cắt. - Sản phẩm PCR kích thước 1000 bp được cắt không hoàn toàn bằng enzyme HpaII (CˇCGG) tạo thang chuẩn ADN SY - 100. 2.3.7. Tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR Tùy mục đích trong từng thí nghiệm mà sản phẩm PCR của chúng tôi được tinh sạch theo hai cách khác nhau. - Sản phẩm PCR sử dụng khuôn là sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp sẽ được điện di lượng lớn trên gel agarose. Sử dụng bộ kit của Bioneer với các bước tiến hành được hướng dẫn cụ thể trong “AccuPrep® Gel Purification Kit” [9] để tinh sạch ADN. - Sản phẩm phản ứng PCR kích thước 1000 bp và các đoạn ADN của thang chuẩn tạo ra trong phản ứng cắt không hoàn toàn sẽ được loại muối, dimer nhờ bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen. Các bước tiến hành và những lưu ý quan trọng được hướng dẫn chi tiết trong “QIAquick® PCR Purification Kit (50)” [20]. 2.3.8. Kỹ thuật điện di Điện di (electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử là kỹ thuật để phân tách các phân tử ADN, ARN hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng điện (isoelectric point) [29]. Kỹ thuật điện di sử dụng: - Một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều. - Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử. Có hai loại gel được sử dụng phổ biến trong kỹ thuật điện di ADN là gel agarose và polyacrylamide. Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắt lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo [29]. - Các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, bạc, đồng vị phóng xạ,) để phát hiện vị trí các phân tử ADN trên gel sau khi điện di [3, 28]. Do điện tích âm của khung phosphate (phosphate backbone), các đoạn ADN dịch chuyển từ điện cực âm sang cực dương (qua các lỗ gel trong phương pháp điện di trên gel). Các đoạn ADN kích thước nhỏ có thể dễ dàng di chuyển qua các lỗ gel vì vậy dịch chuyển tới cực dương nhanh hơn các đoạn ADN kích thước lớn [16]. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KHUẾCH ĐẠI VÀ TẠO ĐOẠN ADN CÓ KÍCH THƯỚC 100 bp 3.1.1. Khuếch đại đoạn ADN bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 Phân tích trình tự đoạn ADN kích thước 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre (Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội), chúng tôi nhận thấy đoạn 114 bp mang một vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI (GˇAA TTC) tại nucleotide thứ ba tính từ đầu 5’ của đoạn chèn. Sử dụng phần mềm thiết kế mồi FastPCR và trình tự đoạn ADN kích thước 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre, chúng tôi thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 mang vị trí nhận biết của EcoRI ở đầu 5’ (Hình 8). Sản phẩm phản ứng PCR sử dụng plasmid pGEX-4T-1-Bre làm khuôn với mồi Bre-F1/R1 là đoạn ADN kích thước 108 bp với hai đầu có vị trí của enzyme EcoRI. Do đó, đoạn 108 bp sau khi được cắt hoàn toàn bằng EcoRI sẽ thu được một đoạn ADN kích thước 100 bp. Hình 8. Sơ đồ minh họa thiết kế cặp mồi Bre-F1/R1 dựa trên trình tự đoạn 114 bp trong vector pGEX-4T-1-Bre. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn ADN kích thước 108 bp Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1 khuếch đại đoạn 108 bp trong plasmid pGEX-4T-1-Bre được thực hiện ở một số nhiệt độ gắn mồi khác nhau, qua đó chúng tôi đã xác định điều kiện và thành phần phản ứng tối ưu như sau: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Điều kiện H2O 10,0 - Biến tính 940C trong 5 phút ở giai đoạn đầu - Chu trình được lặp lại 30 lần Biến tính 940C trong 30 giây Gắn mồi 680C trong 75 giây - Tổng hợp 720C trong 7 phút ở giai đoạn sau cùng Đệm Taq ADN polymerase 10X 1,5 dNTP mix (2 mM mỗi loại) 1,0 Taq ADN polymerase (1 u/µl ) 0,5 Bre-F1 (10 µM) 0,5 Bre-R1 (10 µM) 0,5 ADN 1,0 Tổng thể tích 15,0 Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 2%. Kết quả điện di cho thấy chúng tôi đã khuếch đại thành công đoạn 108 bp (Hình 9). Hình 9. Điện di sản phẩm PCR đoạn 108 bp trên agarose 2%. 1: ADN Ladder 100 bp; 2: Sản phẩm PCR kích thước 108 bp. Băng điện di sản phẩm PCR sáng rõ chứng tỏ: - Cặp mồi Bre-F1/R1 được thiết kế có tính đặc hiệu cao. - Đã khuếch đại thành công lượng lớn đoạn ADN kích thước 108 bp. 3.1.2. Tạo đoạn 100 bp bằng phản ứng cắt với EcoRI Để thu được lượng lớn đoạn ADN kích thước 100 bp, đoạn ADN kích thước 108 bp được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Phản ứng gồm thành phần như sau: Đệm 10X 2,0 µl ADN 7,0 µl EcoRI 10 u/µl 1,0 µl Thêm nước để có tổng thể tích 20,0 µl Phản ứng cắt diễn ra ở 370C trong 2 giờ. Kết thúc phản ứng cắt, chúng tôi thu được lượng lớn các đoạn ADN kích thước 100 bp với hai đầu là vị trí cắt của EcoRI. 3.2. TẠO VECTOR TÁI TỔ HỢP 3.2.1. Phản ứng tự nối các đoạn 100 bp Lượng lớn đoạn ADN kích thước 100 bp được sử dụng cho phản ứng tự nối nhằm thu được đoạn ADN kích thước lớn, mang các vị trí cắt của enzyme EcoRI cách đều 100 bp. Phản ứng tự nối các đoạn 100 bp diễn ra ở 140C qua đêm với thành phần phản ứng gồm: Đệm 10X 1,5 µl ADN 3,0 µl T4 ADN ligase 5 u/µl 1,0 µl Thêm nước để có tổng thể tích 15,0 µl 3.2.2. Khuếch đại sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp Sản phẩm phản ứng tự nối các đoạn ADN kích thước 100 bp được làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1. Bước thí nghiệm này giúp chúng tôi thu được đoạn ADN kích thước phù hợp để chuyển vào vector pJET1.2 (Fermentas) theo bộ kit “CloneJETTM PCR Cloning Kit” [12]. Thành phần phản ứng PCR sử dụng khuôn là sản phẩm của phản ứng tự nối sử dụng cặp mồi Bre-F1/R1: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Điều kiện H2O 10,0 - Biến tính 940C trong 5 phút ở giai đoạn đầu - Chu trình được lặp lại 30 lần Biến tính 940C trong 30 giây Gắn mồi 680C trong 75 giây - Tổng hợp 720C trong 7 phút ở giai đoạn sau cùng Đệm Taq ADN polymerase 10X 1,5 dNTP mix (2 mM mỗi loại) 1,0 Taq ADN polymerase (1 u/µl ) 0,5 Bre-F1 (10 µM) 0,5 Bre-R1 (10 µM) 0,5 Sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp 1,0 Tổng thể tích 15,0 3.2.3. Tách dòng vector tái tổ hợp Sản phẩm PCR được tinh sạch theo kít Bioneer [9] và được chuyển vào vector pJET1.2; vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các khuẩn lạc sàng lọc từ môi trường LB bổ sung ampicilin (50 µg/ml) được nuôi cấy riêng biệt để tách chiết plasmid. Các plasmid được kiểm tra kích thước đoạn chèn thông qua phản ứng PCR sử dụng cặp mồi pJET1.2-F/R với thành phần phản ứng như sau: Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Điều kiện H2O 10,1 Biến tính 950C trong 5 phút ở giai đoạn đầu Biến tính 950C trong 30 giây Gắn mồi 600C trong 30 giây Tổng hợp 720C trong 45 giây Chu trình được lặp lại 25 lần Tổng hợp 720C trong 5 phút ở giai đoạn sau cùng Đệm Taq ADN polymerase 10X 1,5 MgCl2 (25 mM) 0,3 dNTP mix (2 mM mỗi loại) 1,0 Taq ADN polymerase (1 u/µl ) 0,5 pJET1.2-F (10 µM) 0,3 pJET1.2-R (10 µM) 0,3 ADN 1,0 Tổng thể tích 15,0 Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% (Hình 10). Hình 10. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra kích thước đoạn chèn trong plasmid của 13 khuẩn lạc. L: ADN ladder 100 bp; (-): Đối chứng âm; Số 1 đến số 13: Sản phẩm PCR kiểm tra plasmid khuẩn lạc 1 đến 13. Trong 13 khuẩn lạc được kiểm tra, có 6 khuẩn lạc (3; 4; 5; 8; 10; 11) chứa vector mang đoạn chèn 100 bp, 1 khuẩn lạc (6) chứa vector mang đoạn chèn 200 bp, 1 khuẩn lạc (1) chứa vector mang đoạn 500 bp, 5 khuẩn lạc (2; 7; 9; 12; 13) chứa vector mang đoạn chèn kích thước khoảng hơn 800 bp. Để kiểm tra số lượng các đoạn 100 bp và các vị trí cắt của EcoRI trong đoạn chèn kích thước hơn 800 bp của 5 khuẩn lạc (2; 7; 9; 12; 13), plasmid tách từ 5 khuẩn lạc này được tham gia phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI. Các plasmid này được kí hiệu lần lượt như sau: pJET1.2-8×100-2; pJET1.2-8×100-7; pJET1.2-8×100-9; pJET1.2-8×100-12 và pJET1.2-8×100-13. Đồng thời các khuẩn lạc này được giữ giống trong -800C. 3.2.4. Phản ứng cắt vector pJET1.2-8×100 bằng EcoRI 3.2.4.1. Phản ứng cắt hoàn toàn Để kiểm tra các vị trí cắt EcoRI trên đoạn ADN chèn trong các plasmid pJET1.2-8×100 của khuẩn lạc 2; 7; 9; 12; 13, plasmid của 5 khuẩn lạc này được cắt hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Thành phần phản ứng gồm: Đệm 10X 1,5 µl Plasmid pJET1.2-8×100 0,5 µl EcoRI 10 u/µl 0,4 µl Thêm nước để có tổng thể tích 15,0 µl Phản ứng cắt diễn ra ở 370C trong 2 giờ. Kết quả được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12% (Hình 11). Hình 11. Điện di sản phẩm cắt hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100 của 5 khuẩn lạc bằng enzyme EcoRI trên gel polyacrylamide 12%. L: ADN ladder 100 bp; Số thứ tự trên hình tương ứng với số thứ tự khuẩn lạc. Từ ảnh điện di cho thấy: sản phẩm cắt hoàn toàn vector cho hai băng kích thước 100 bp và 200 bp. Theo lý thuyết thì sản phẩm cắt hoàn toàn chỉ cho một băng duy nhất kích thước 100 bp. Vì đoạn ADN chèn vào vector pJET1.2 là sản phẩm tự nối các đoạn 100 bp, ban đầu chúng tôi nghi ngờ do mẫu cắt chưa hết, thí nghiệm đã được lặp lại 3 lần với lượng enzyme tăng gấp đôi, tuy nhiên kết quả đều không thay đổi. Nguyên nhân của việc xuất hiện băng 200 bp trong sản phẩm cắt hoàn toàn chỉ có thể là do có sự sai hỏng của một trong hai vị trí cắt EcoRI liền nhau. 3.2.4.2. Phản ứng cắt không hoàn toàn Cả 5 khuẩn lạc 2; 7; 9; 12; 13 mà chúng tôi thu được đều mang cùng một kiểu vector pJET1.2-8×100, vì vậy chúng tôi đã sử dụng khuẩn lạc số 2 làm đại diện cho các thí nghiệm tiếp theo. Plasmid pJET1.2-8×100-2 của khuẩn lạc 2 được cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI. Phản ứng được thực hiện ở các lượng ADN khác nhau và thời gian ủ khác nhau. Chuẩn hóa điều kiện thời gian phản ứng cắt với EcoRI Phản ứng cắt không hoàn toàn vector pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI sẽ tạo ra các băng mong muốn có kích thước từ 100 bp đến 800 bp (khá nhỏ so với kích thước vector). Để có thể quan sát được các băng này, lượng ADN ban đầu sử dụng là 10,0 µl (23 µg). Phản ứng được diễn ra ở 370C tại các thời gian: 20 phút, 30 phút và 40 phút, bất hoạt enzyme ở 700C trong 10 phút. Thành phần cho một phản ứng gồm: Đệm 10X 2,0 µl Plasmid pJET1.2-8×100-2 10,0 µl (23 µg) EcoRI 10 u/µl 0,4 µl Thêm nước để có tổng thể tích 20,0 µl Sản phẩm cắt được điện di kiểm tra trên agarose 2% (Hình 12). Hình 12. Ảnh điện di mẫu cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI tại ba thời gian khác nhau trên agarose 2%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Mẫu cắt 20 phút; 2: Mẫu cắt 30 phút; 3: Mẫu cắt 40 phút. Từ ảnh điện di cho thấy: mẫu cắt 20 phút (1) cho các băng mờ, lượng plasmid chưa cắt còn nhiều; mẫu cắt 30 phút (2) và 40 phút (3) lại làm lượng lớn băng ADN kích thước 800 bp bị cắt tạo băng kích thước nhỏ. Thời gian cắt 40 phút có các băng độ sáng khá đồng đều. Tuy nhiên, nhìn chung lượng ADN vẫn khá thấp, do đó dẫn đến độ sáng các băng chưa cao, chúng tôi quyết định chọn thời gian cắt 40 phút, nhưng thay đổi lượng ADN. Chuẩn hóa lượng ADN cho phản ứng cắt không hoàn toàn bằng EcoRI Sau khi đã chọn được thời điểm cắt thích hợp, chúng tôi quyết định tăng lượng ADN lên 15,0 µl (35 µg). Thành phần phản ứng gồm: Đệm 10X 2,0 µl Plasmid pJET1.2-8×100-2 15,0 µl (35 µg) EcoRI 10 u/µl 0,4 µl Thêm nước để có tổng thể tích 20,0 µl Phản ứng diễn ra ở 370C, 40 phút, bất hoạt enzyme ở 700C, 10 phút. Sản phẩm cắt được điện di trên agarose 2,5% (Hình 13). Hình 13. Ảnh điện di mẫu cắt plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI trên agarose 2,5%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Mẫu cắt không hoàn toàn 15 µl ADN. Kết quả Hình 13 cho thấy sản phẩm cắt gồm 8 băng ADN kích thước từ 100 bp đến 800 bp sáng rõ. Sử dụng 15,0 µl (35 µg) ADN cho phản ứng cắt là tối ưu để sản phẩm cho các băng ADN rõ nét. Điều kiện và thành phần phản ứng cắt tối ưu Thông qua hai bước kiểm tra thời gian và lượng ADN cho phản ứng cắt không hoàn toàn plasmid pJET1.2-8×100-2 bằng EcoRI, chúng tôi thiết lập thành phần phản ứng và điều kiện cắt tối ưu như sau: Đệm 10X 2,0 µl Plasmid pJET1.2-8×100-2 15,0 µl (35 µg) EcoRI 10 u/µl 0,4 µl Thêm nước để có tổng thể tích 20,0 µl Phản ứng diễn ra ở 370C, 40 phút và enzyme sau đó được bất hoạt ở 700C, 10 phút, sản phẩm được điện di kiểm tra trên agarose 2%. Như vậy, chúng tôi đã nhân dòng thành công vector pJET1.2-8×100-2 mang đoạn ADN chèn kích thước khoảng 800 bp là sản phẩm tự nối của các đoạn ADN 100 bp. Sử dụng plasmid pJET1.2-8×100-2 trong phản ứng cắt không hoàn toàn bằng enzyme EcoRI, chúng tôi thu được thang chuẩn ADN 100 bp gồm 8 băng từ 100 bp đến 800 bp. 3.3. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ 3.3.1. Kết quả giải trình tự vector tái tổ hợp pJET1.2-8×100 Plasmid pJET1.2-8×100-2 sau khi tách chiết và kiểm tra độ tinh sạch được giải trình tự hai chiều (Hình 14). Hình 14. Ảnh minh họa kết quả giải trình tự vector pJET1.2-8×100-2. (A): Giải trình tự theo chiều xuôi; (B): Giải trình tự theo chiều ngược. Khi phân tích trình tự, chúng tôi nhận thấy tính từ đầu 5’ của đoạn ADN chèn trong vector pJET1.2-8×100-2 có hiện tượng: thay thế hai nucleotide A bằng bộ ba TTC tại vị trí 24; thay thế nucleotide C bằng T ở vị trí 409 làm mất một vị trí cắt của enzyme EcoRI; thêm một nucleotide A tại vị trí 712; 15 nucleotide đứng sau vị trí cắt cuối cùng của EcoRI tại đầu 3’ là một phần của đoạn 100 bp tham gia phản ứng tự nối. Phân tích vị trí cắt của enzyme EcoRI Kết quả giải trình tự hai chiều đoạn ADN chèn trong vector pJET1.2-8×100-2 cho thấy kích thước chính xác của đoạn ADN chèn là 827 bp (thay vì 800 bp như dự đoán): - Gồm 12 vị trí cắt của EcoRI, trong đó có 4 điểm mà tại đó 2 vị trí cắt của EcoRI liền kề nhau, chỉ cách nhau 2 nucleotide. - Mất một trình tự cắt của EcoRI tại vị trí 404 tính từ đầu 5’. Chính vì sự xuất hiện các vị trí cắt của enzyme liền kề nhau và mất một vị trí cắt đã tạo nên sự chênh lệch các băng ADN so với dự tính trong thiết kế. Vì vậy, thực tế chúng tôi lại thu được 31 băng với kích thước của các băng được thống kê cụ thể trong Bảng 5. Bảng 5. Tổ