Khóa luận Nghiên cứu quy trình xác định đồng thời auramine O và rhodamine B trong một số mẫu gia vị bằng phương pháp sắc ký lỏng kết nối detector tử ngoại khả kiến

n bằng động trong quá trình sắc ký. Trong sắc ký, các chất ion thì yếu tố này thể hiện rõ nét. Giá trị thời gian lưu ' Rit có ý nghĩa rất lớn trong thực tế của kỹ thuật sắc ký. Vì nó cho biết các CPT trong hỗn hợp mẫu được rửa giải ra như thế nào trong các điều kiện thí nghiệm và một hệ pha đã chọn. Đồng thời, đó cũng là đại lượng để chúng ta phát hiện định tính một chất. Trong một phép phân tích, nếu ' Rt nhỏ quá thì sự tách kém, ngược lại nếu ' Rt quá lớn thì peak bị doãng và độ lặp lại thấp, thời gian phân tích dài. Điều này kéo theo nhiều vấn đề khác như hao tốn dung môi, hoá chất, độ chính xác của phép phân tích kém. Để thay đổi thời gian lưu chúng ta dựa vào các yếu tố đã trình bày ở trên. Mặt khác, trong một hệ sắc ký còn có: Ri i L t = u (1.2) o o L t = u (1.3) t Ri = t o ( 1 + ' ik ) (1.4) Trong đó u i và u o là tốc độ tuyến tính của CPT i và của pha động (cm/s); ' ik là hệ số dung lượng của CPT i; L là chiều dài của cột sắc ký [6]. 1.4.4.2. Hệ số phân bố Ki và hệ số dung lượng ' ik Quá trình tách sắc ký của các chất dựa trên cơ sở sự phân bố của CPT giữa pha động và pha tĩnh xảy ra liên tục trong hệ sắc ký. Sự phân bố này được đặc trưng bởi một đại lượng gọi là hệ số phân bố K i của chất i. Hệ số này được định nghĩa là tỷ số nồng độ của CPT i ở trong pha tĩnh và pha động: i(SP) i i(MP) C K = C (1.5) Trong đó, C i(SP) và C i(MP) là nồng độ của chất tan i trong pha tĩnh và pha động. Hệ số K i cho biết khả năng phân bố của chất i như thế nào trong mỗi pha (pha động và pha tĩnh). 12 Hệ số phân bố Ki chưa nói lên được sức chứa của cột tách vì thế, người ta phải đưa thêm vào hệ số dung lượng ' ik . Hệ số dung lượng ' ik cho ta biết tỷ số khối lượng của CPT i phân bố vào trong mỗi pha là bao nhiêu, ta có: i(SP)' i i(MP) m k = m (1.6) Trong đó, mi(SP) và mi(MP) là khối lượng CPT i trong pha tĩnh và trong pha động. Mối quan hệ giữa hệ số dung lượng ' ik và hệ số phân bố Ki thể hiện qua phương trình sau: i(SP)' i i i(MP) V k = K V (1.7) Với Vi(SP) và Vi(MP) là thể tích của CPT i trong pha tĩnh và trong pha động. 1.4.4.3. Hệ số tách Hệ số tách α (hay còn gọi là thời gian lưu tương đối của hai chất A và B) là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố và là tỷ số của hệ số phân bố của hai chất [6]. '' R(A)A A ' ' B B R(B) tK k α K k t    (1.8) Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α ≠ 1. 1.4.4.4. Số đĩa lý thuyết Theo lý thuyết đĩa, để đặc trưng cho một cột tách sắc ký, người ta dùng khái niệm số đĩa lý thuyết N. Đây là một đại lượng hình thức, có thể coi mỗi đĩa trong cột sắc ký như là một lớp chất nhồi có chiều cao (bề dày) đĩa lý thuyết là H. Tất nhiên đây là lớp có tính chất động, và bề dày H của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, như: - Đường kính của hạt pha tĩnh, hình dạng và kiểu hạt tròn hay mảnh; - Độ xốp, kích thước lỗ xốp của hạt pha tĩnh; - Bản chất, cấu trúc phân tử của chất tan (CPT); - Tốc độ và thành phần của pha động trong quá trình sắc ký; - Độ nhớt của pha động. Vì thế với một hệ nhất định và trong những điều kiện sắc ký đã chọn, thì chiều cao đĩa lý thuyết H có những giá trị xác định ứng với các CPT khác nhau. Chiều cao đĩa lý thuyết H và số đĩa lý thuyết N được xác định theo công thức: 13 2 i Ri WL H = 16 t       (1.9) 2 Ri i tL N = = 16 H W       (1.10) Trong đó, W i là chiều rộng đáy peak sắc ký của CPT i. Trong thực tế, số đĩa lý thuyết hiệu dụng N ef và chiều cao đĩa lý thuyết hiệu dụng H ef của một cột sắc ký mới là đại lượng giúp ta đánh giá đúng khả năng của một cột tách và hiệu quả của nó là như thế nào, tốt hay không tốt trong mỗi trường hợp cụ thể. 2 i ef Ri o WL H = 16 t - t        (1.11) 2 Ri o ef i t - t N = 16 W       (1.12) Nếu giá trị N ef quá nhỏ thì không có sự tách tốt của các chất, hoặc sự tách không hoàn toàn. Nếu N ef quá lớn thì cũng không cần thiết, vì khi đó peak sắc ký của các chất tách xa nhau quá và việc rửa giải là tốn nhiều pha động. Trong thực tế, Nef nằm trong khoảng 5000 đến 8000 là vừa đủ [6]. 1.4.4.5. Độ phân giải R Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký. Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải của hai peak cạnh nhau được tính theo công thức sau: ' ' RB RA B A 2(t - t ) R = W + W (1.13) Trong đó, WA và WB là bề rộng đáy của peak sắc ký của hai chất A và B. Nếu R càng lớn, hai chất A và B càng tách ra xa nhau, khi này giữa hai peak sẽ có một đoạn đường nền nằm ngang theo trục hoành của biểu đồ sắc ký. Song nếu đoạn đường nền này dài quá thì cũng không cần thiết, vì như thế ta tốn nhiều dung môi (pha động) để rửa giải các chất hơn. Do đó, giá trị R chỉ vừa đủ để hai chất tách khỏi nhau là được. 14 a) b ) c) Hình 1.4. Giản đồ về sự tách hai peak sắc ký A và B [6] a) Tối thiểu để có sự tách. b) Đủ để hai chất tách khỏi nhau. c) Hai chất tách xa hẳn nhau. Trong thực tế nếu các peak cân đối thì độ phân giải tối thiểu để hai peak tách nhau là R = 1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp. 1.4.4.6. Hệ số không đối xứng Hệ số không đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của peak trên sắc ký đồ thu được. T được tính theo công thức sau đây: b T = a (1.13) Trong đó, a và b là bề rộng ở bên phải và bên trái peak sắc ký ở chiều cao 10% so với chiều cao cực đại của peak sắc ký. Nếu tỷ số này nằm trong vùng từ khoảng 0,90 đến 1,10 thì cột đã nạp dùng được [6]. 15 1.4.5. Hệ thống HPLC Hình 1.5. Các thiết bị trong hệ thống HPLC Trong đó: 1 – Bình chứa dung môi pha động 2 – Bộ phận khử khí 3 – Bơm cao áp 4 – Bộ phận tiêm mẫu 5 – Cột sắc ký (pha tĩnh) để ngoài môi trường hay có thiết bị điều nhiệt 6 – Đầu dò (nhận tín hiệu) 7 – Hệ thống máy tính điện tử cài đặt phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống 8 – Thiết bị in dữ liệu 1.4.5.1. Bình đựng dung môi Hiện nay, máy HPLC thường có bốn kênh dung môi nối vào đầu bơm cao áp, cho phép chúng ta sử dụng bốn bình chứa dung môi cùng lúc để rửa giải theo tỷ lệ mong muốn và tổng tỷ lệ dung môi của bốn đường là 100%. Tuy nhiên theo kinh nghiệm, chúng ta ít khi sử dụng bốn đường dung môi cùng một lúc mà chúng ta chỉ sử dụng tối đa cùng một lúc là hai hoặc ba đường. Khi đó, hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất để quá trình rửa giải được ổn định. (5) (6) 16 1.4.5.2. Bộ phận khử khí Mục đích sử dụng bộ khử khí là loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà pha động còn sót các bọt khí thì kết quả phân tích sẽ bị ảnh hưởng, cụ thể như sau: - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi đưa vào hệ không đúng với lý thuyết sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi; - Trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. 1.4.5.3. Bơm cao áp Đây là bộ phận có nhiệm vụ bơm pha động vào cột tách thực hiện quá trình sắc ký theo một chương trình phù hợp. Bơm phải tạo được áp suất khoảng 150 – 250 bar và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 mL/phút. Hiện nay đã có nhiều loại bơm có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Hiện tại bơm có hai pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục. 1.4.5.4. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với thể tích của vòng mẫu là 5 – 100 μL . Có hai cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler). 1.4.5.5. Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Các kết quả thực nghiệm về HPLC đều chỉ ra rằng, các hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ và đồng đều luôn cho hiệu quả tách sắc ký cao và ổn định. Chính vì thế mà hiện nay, hầu hết người ta chỉ dùng hạt pha tĩnh có đường kính nhỏ hơn 10 µm, phổ biến là đường kính hạt từ 5 – 7 µm cho mục đích phân tích và từ 15 – 25 µm cho mục đích sản xuất (sắc ký điều chế) [6]. Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt. 1.4.5.6. Đầu dò Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của CPT. 17 A = k.C (1.14) Trong đó: A là cường độ tín hiệu đo được C là nồng độ CPT k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn Hiện nay, người ta chế tạo các loại detector khác nhau cho kỹ thuật HPLC, cụ thể đã có các loại: - Detector phổ hấp thụ phân tử (UV, UV/Vis hay PDA); - Detector phổ huỳnh quang; - Detector phổ phát xạ nguyên tử; - Detector phổ hấp thụ nguyên tử; - Detector khối phổ; - Detector điện hóa đo dòng và cực phổ; - Detector đo chiết suất; - Detector đo độ dẫn điện; - Detector đo hiệu ứng nhiệt [6] 1.4.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu Bộ phận này được dùng để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao, Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, độ phân giải, ... đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD%. 1.4.5.8. Thiết bị in dữ liệu Sau khi đã phân tích xong các mẫu, người phân tích có thể in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ. 18 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ 2.1.1. Hóa chất 2.1.1.1. Chất chuẩn - Auramine O: dạng rắn, độ tinh khiết 85% , Sigma-Aldrich USA. - Rhodamine B: dạng rắn, độ tinh khiết 95% , Sigma-Aldrich India. Dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm được chuẩn bị từ việc cân chính xác lượng chất chuẩn và hòa tan trong MeOH tinh khiết, được bảo quản trong tủ lạnh. Các dung dịch chuẩn làm việc được pha loãng bằng MeOH từ dung dịch chuẩn gốc. 2.1.1.2. Dung môi – hóa chất Bảng 2.1. Danh mục dung môi STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Methanol Merk KGaA - Đức Lapscan Dùng cho HPLC 99,8% 99,9% 2 Acetonitrile Merk KGaA - Đức Dùng cho HPLC 99,8% Bảng 2.2. Danh mục hóa chất STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Acid acetic (băng) Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC 100% 2 Acid formic Scharlau, Scharlab S.L – Spain Dùng cho HPLC 98-100% 3 Acid phosphoric Scharlau, Scharlab S.L – Spain Dùng cho HPLC 85% 4 Acetone Merck KGaA - Đức Dùng cho HPLC - 5 Ammonia Guangdong Guanghua Sci-Tech Co., Ltd Dùng cho phân tích 25-28% 19 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị Bảng 2.3. Danh mục thiết bị và máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất 1 Hệ HPLC / PDA 2996 Separations Module 2695 Waters 2 Cột sắc ký ZORBAX Eclipse XDB- C18 Agilent – USA 5 μm x 4,6 mm x 250 mm 3 Cột bảo vệ Eclipse XDB- C18 4-Pack Agilent – USA 4 Cột chiết pha rắn 600 mg Oasis HLB C18 Waters Agilent 5 Máy deion Water Pro PS LABCONCO 6 Máy siêu âm S100H Elmasonic Elma – Germany 7 Máy ly tâm DNA concentrator miVac, Genevac Ltd. Ipswich England 8 Máy đo quang Lambda 25 UV/Vis Spectrometor Perkin Elmer 9 Tủ sấy - WTB binder 10 Bộ chiết pha rắn 12 – Port Vacuum Manifold Agilent 2.1.2.2. Một số dụng cụ khác - Bình định mức, pipet, cốc thủy tinh các loại - Micropipet: 10-100μL , 100-1000μL , 1000-5000μL - Vial (1,5 mL, 10 mL); ống ly tâm (50 mL); phễu chiết (250 mL). - Ống nhỏ giọt, bình tia, giấy parafin, giấy nhôm, màng bọc thực phẩm, đầu lọc 0,2 µm PTFE, rây tiêu chuẩn Ø = 200 mm đường kính lỗ 0,5 mm. 20 2.2. Nội dung nghiên cứu Trong khóa luận này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các nội dung sau: - Tối ưu hoá các thông số trong chương trình sắc ký để phân tách chất chuẩn AO và RB trên hệ thống HPLC; - Khảo sát quy trình xử lý mẫu gia vị nhằm đem lại hiệu quả chiết tách, làm sạch và làm giàu mẫu tốt nhất; - Sử dụng quy trình phân tích AO và RB trong một số mẫu gia vị. 2.3. Các bước tiến hành sắc ký 2.3.1. Chuẩn bị dung môi Các dung môi là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng cũng phải là loại tinh khiết phân tích. - Kiểm tra các chai đựng dung môi và các chai đựng dung môi để rửa: kênh A (MeOH), kênh B (H2O), kênh C (ACN), kênh D (dung dịch acid hay đệm, hoặc là hỗn hợp dung môi), chai rửa kim (MeOH) và chai rửa seal (MeOH 10 - 20%). - Lọc tất cả dung môi sử dụng màng lọc cellulose acetate hoặc cellulose nitrate 0,45 μm (tốt nhất là 0,2 μm ). Nếu là hỗn hợp dung môi hữu cơ và nước (hoặc dung dịch đệm) thì lọc qua màng lọc polyamide hay nilon. Dung môi hữu cơ thì lọc qua màng lọc teflon, riêng ACN và MeOH nguyên chai không cần lọc. - Siêu âm tất cả các bình dung môi ở các kênh A, B, C, D để đuổi khí trong khoảng 10 - 15 phút cho mỗi bình, khi siêu âm phải mở nắp bình. Sau đó, đặt các bình đúng vị trí quy định và để các đầu lọc luôn cắm ngập trong dung môi. 2.3.2. Chuẩn bị mẫu đo Mẫu chuẩn: pha dung dịch chuẩn có thành phần CPT giống như mẫu thử trong cùng dung môi. Nồng độ các thành phần CPT trong dung dịch chuẩn tương đương như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng quy trình đã khảo sát và tối ưu hóa. Đảm bảo các yêu cầu sau: - Dung môi hòa tan CPT phải tương thích với pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu; - Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết ; 21 - Phải lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm; - Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Nồng độ CPT cao quá có thể gây ra nghẽn cột. 2.3.3. Cách vận hành thiết bị Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất và phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo trình tự sau: 1) Kiểm tra hệ thống: nguồn điện, hệ thống bơm, hệ thống đầu dò, kết nối LC – PDA, buồng chứa cột tách. 2) Chuẩn bị: dung môi, mẫu phân tích. 3) Khởi động thiết bị - Khởi động hệ thống bơm: bật chế độ đuổi khí, thực hiện chế độ đuổi khí, rửa kim, cân bằng cột. - Khởi động máy tính. - Khởi động đầu dò, để kéo dài thời gian sử dụng đầu dò, nên bật công tắc sử dụng đầu dò sau khi hoàn tất việc khử khí và cân bằng cột. 4) Khởi động chương trình - Tạo một “Method” để sử dụng. - Thiết lập thông số sắc ký: tỷ lệ dung môi pha động, bước sóng khảo sát, thành phần mẫu, các thông số khác của quá trình phân tích yêu cầu. 5) Tiến hành phân tích 6) Rửa hệ thống Đặc biệt cột sắc ký phải được rửa theo quy định sau mỗi lần chạy sắc ký. Ví dụ: - Sắc ký pha thường: rửa bằng MeOH; không rửa bằng nước. - Sắc ký pha đảo: khi chạy pha động thành phần chứa muối thì phải rửa nước trước cho sạch. 7) Xử lý kết quả 8) Tắt hệ thống 9) Ghi nhật ký sử dụng máy 22 2.4. Khảo sát các điều kiện phân tích sắc ký 2.4.1. Khoảng bước sóng của detector Phương pháp nghiên cứu được lựa chọn là sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối detector PDA, vì thế việc xác định khoảng bước sóng của detector là cần thiết. Trước khi tiến hành định tính và định lượng AO và RB trên máy HPLC thì phải xác định được bước sóng ứng với cực đại hấp thụ của AO và RB. Dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch để xác định bước sóng ứng với cực đại hấp thụ. AO và RB là các hợp chất có màu, nên có thể tiến hành khảo sát phổ hấp thụ quang trong vùng khả kiến trên máy Lambda 25 UV/Vis Spectrometor ở phòng Phân tích Trung tâm 1. Dung dịch đo là chuẩn đơn AO, chuẩn đơn RB và chuẩn hỗn hợp (AO và RB) với: Nồng độ CPT 2,0 ppm đối với mỗi chất Dung môi 100% MeOH; 100% ACN Khoảng quét phổ 300 – 600 nm 2.4.2. Tối ưu hóa pha động Pha động là một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả tách trong kỹ thuật phân tích HPLC. Để tìm được điều kiện tối ưu cho pha động, chúng tôi tiến hành thay đổi từng yếu tố và khảo sát theo thứ tự sau: 1 – Khảo sát dung môi pha động 2 – Khảo sát chương trình hóa dung môi 3 – Khảo sát pH của pha động 4 – Khảo sát tốc độ dòng 5 – Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu 2.4.2.1. Khảo sát dung môi pha động Trong sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), pha động là hệ dung môi phân cực, đó là những dung môi hữu cơ tan tốt trong nước và trong nhiều trường hợp nước cũng là một thành phần của pha động. Hệ pha động được sử dụng nhiều như MeOH, ACN hay hỗn hợp MeOH với nước, ACN với nước hoặc có thêm chất đệm pH,[3]. Vì vậy việc lựa chọn dung môi phù hợp sẽ là một trong những yếu tố mang lại hiệu quả cho quá trình tách sắc ký. Đối với mẫu đơn giản, pha động gồm hỗn hợp MeOH/nước có tỷ lệ thể tích thường chọn là 80/20 [4]. 23 Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành so sánh hiệu quả tách sắc ký giữa dung môi MeOH và ACN. Và hệ pha động sử dụng là dung môi hữu cơ (MeOH hoặc ACN) kết hợp thêm nước để tạo hệ pha động phân cực hơn. Chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả tách của hệ MeOH/H2O và ACN/H2O trong hai trường hợp: thành phần pha động giữ cố định (đẳng dòng) và thành phần pha động thay đổi (gradient). Tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp dung dịch chuẩn gồm AO nồng độ 5,0 ppm và RB nồng độ 5,0 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau: - Cột tách: ZORBAX Eclipse XDB – C18 (5 μm x 4,6 mm x 250 mm) - Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút - Bước sóng cực đại ở 430 nm và 540 nm - Thể tích vòng mẫu: 20 μL - Nhiệt độ cột: 35±5oC - Nhiệt độ buồng mẫu: 20±5oC - Pha động: * Chế độ rửa giải đẳng dòng: - Thời gian phân tích: 40 phút  Chương trình 1: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v)  Chương trình 2: MeOH: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v)  Chương trình 3: ACN: HCOOH pH = 3,0 (40:60, v:v)  Chương trình 4: ACN: HCOOH pH = 3,0 (50:50, v:v) * Chế độ rửa giải gradient: Hình 2.1. Đồ thị biểu diễn chương trình 5 (MeOH – CH3COOH pH = 3,6) 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 % V ( M E O H ) Thời gian (phút) 24 Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn chương trình 6 (ACN – CH3COOH pH = 3,6) 2.4.2.2. Khảo sát chế độ rửa giải Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng đến quá trình rửa giải các chất phân tích ra khỏi cột tách. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của pha động thay đổi, tức làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích ra khỏi cột và do đó làm thay đổi hệ số dung lượng của chất phân tích. Sau khi lựa chọn được dung môi pha động ở mục 2.4.2.1, chúng tôi thực hiện các bước khảo sát như sau:  Khảo sát chương trình đẳng dòng Thực hiện phân tích sắc ký với một số chương trình đẳng dòng như sau: - Chương trình 7: MeOH và HCOOH (pH = 3,0) (80:20, v:v) - Chương trình 8: MeOH và đệm acetate (pH = 4,2) (80:20, v:v)  Khảo sát chương trình gradient Lựa chọn các đoạn gradient và đặt tỷ lệ thành phần dung môi ở đầu mỗi đoạn gradient, thời gian gradient. Chương trình sắc ký dùng để khảo sát cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ cột tách, bước sóng, tốc độ dòng, thể tích vòng mẫu, nồng độ hai chất phân tích là 2,0 ppm. 2.4.2.3. Khảo sát pH của pha động Dựa vào giá trị pKa của AO và RB, để hạn chế tồn tại đồng thời nhiều dạng phân tử AO, RB và loại bỏ sự kéo đuôi của peak AO, RB trong quá trình tách sắc ký thì nên tiến hành khảo sát với điều kiện giá trị pH < 7. Theo khuyến cáo của hãng Agilent, cột tách C18 làm việc trong khoảng pH từ 2 đến 9 nên chúng tôi chọn các acid cho chương trình dung môi pha động như sau: 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 % V ( A C N ) Thời gian (phút) 25 - Acid acetic có pH bằng 3,0; 3,6; 4,0 và 4,5 - Acid formic có pH bằng 3,0 - Acid phosphoric có pH bằng 2,3 và 2,6 Tiến hành cố định các yếu tố: cột tách, nhiệt độ, bước sóng, thể tích vòng mẫu. Đối với các giá trị pH từ 3,0 đến 4,5 tiến hành với tốc độ dòng 1,0 mL/phút và chương trình gradient pha động như đồ thị dưới đây: Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH từ 3,0 đến 4,5 Đối với các giá trị pH 2,3 và 2,6 tiến hành với tốc độ dòng 0,7 mL/phút và chương trình gradient pha động như đồ thị dưới dây: Hình 2.4. Đồ thị biểu diễn gradient pha động – khảo sát pH 2,3 và 2,6 Thực hiện phân tích sắc ký với chuẩn hỗn hợp AO và RB cùng nồng độ 2,0 ppm, tính toán các giá trị hệ số dung lượng, hệ số không đối xứng, độ phân giải để chọn loại acid thích hợp cho pha động. 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25 % V ( M eO H ) Thời gian (phút) 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 % V ( M eO H ) Thời gian (phút) 26 2.4.2.4. Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lập cân bằng của CPT giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên, nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy, chúng ta cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. Chúng tôi cố định các yếu tố: pha tĩnh, thể tích vòng mẫu, nhiệt độ cột, nhiệt độ buồng mẫu và bước sóng khảo sát và tiến hành khảo sát hệ sắc ký với các tốc độ dòng khác nhau: 0,6; 0,7; 0,85; 1,0 mL/phút và các điều kiện đã được tối ưu ở các mục trên. 2.4.2.5. Khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu Sau khi chọn được tốc độ dòng tối ưu, chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ dung môi pha động ban đầu với hai mức: 30% MeOH và 43,7% MeOH để thiết lập điều kiện sắc ký tối ưu cho quá trình phân tích HPLC. 2.5. Thẩm định phương pháp 2.5.1. Khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của CPT nằm trong khoảng tuyến tính. Đối với mỗi chất, trong một giới hạn nhất định của nồng độ, độ lớn diện tích peak sắc ký phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của chất trong mẫu phân tích. Để định lượng chính xác một chất thì nồng độ của chất đó trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính này, do đó việc xác định khoảng tuyến tính của AO và RB là hết sức quan trọng. Theo tài liệu tham khảo [14], khoảng tuyến tính của AO và RB là 0,05 – 100 ppm. Khoảng tuyến tính của AO và RB là khoảng nồng độ tương đối rộng khi sử dụng phương pháp HPLC. Tuy nhiên, hàm lượng AO và RB trong mẫu là hàm lượng vết, vì thế việc xây dựng đường chuẩn với khoảng nồng độ nhỏ gần với nồng độ của AO và RB trong mẫu sẽ cho kết quả chính xác hơn, đồng thời tiết kiệm hóa chất, thời gian và công sức tiến hành. Trong đề tài này, chúng tôi đã tiến hành xây dựng đường chuẩn của AO và RB với dãy các nồng độ dung dịch chuẩn sau: 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 ppm. 27 Bảng 2.4. Cách pha các dung dịch chuẩn để xây dựng đường chuẩn của AO và RB Nồng độ chuẩn hỗn hợp lấy pha (ppm) Thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp lấy pha (µL) Thể tích dung dịch cuối (mL) Nồng độ chuẩn hỗn hợp cuối (ppm) 2 25 1 0,05 10 10 1 0,1 10 20 1 0,2 10 50 1 0,5 10 100 1 1 10 200 1 2 2.5.2. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nền. Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của CPT mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 – 3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 3. LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 – 20 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy S/N = 10 [9]. Hình 2.5. Cách xác định S/N [4] 28 2.5.3. Xác định độ lặp lại của phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp AO và RB (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 2.4. Kết quả được đánh