Luận án Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất từ vi nấm biển phân lập tại miền trung Việt Nam

kết, cụ thể H3-17 (δH 1,88) với C-3 (δC 163,9), C-4 (δC 107,5), và C-5 (δC 155,7), H3-18 (δH 2,23) với C-4 và C-5, H-6 (δH 2,28) với C-1 (δC 165,7), C-2 (δC 97,6), và C-3, tạo thành một vòng α-pyrone (vòng A) (Hình 3.23). Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất ochraceopone F (7) Các tương tác ở phổ COSY giữa H-6 (δH 2,28) và H-7 (δH 2,47), H-9 (δH 1,91; 2,18) và H-10 (δH 1,69; 2,01) và các tương tác HMBC từ H3-19 (δH 1,30) đến C-7 (δC 42,9), C-8 (δC 80,4), và C-9 (δC 33,3) hình thành nên một vòng khác (vòng B) kết nối với vòng α-pyrone. Hình dạng của vòng 6 với nhóm ketone (vòng D) cũng được xác nhận bởi tương tác HMBC từ proton của hai germinal methyl H3-21 và 22 (δH 1,21 và 1,12) lần lượt với các carbon C-11 (δC 78,2), C- 13 (δC 53,1), và C-14 (δC 218,0) và từ H-15 (δH 2,47, 2,64) đến C-14 và C-16 (δC 32,4). Tín hiệu tương tác HMBC từ H-20 (δH 1,17) đến C-7, C-11, C-12, và C- 16 thiết lập nên một đơn vị sesquiterpene bởi sự kết nối giữa hệ thống vòng A-B và vòng D. Dữ liệu phổ cho thấy vòng tetracyclic của hợp chất 7 gần giống với hợp chất ochraceopone E, một α-pyrone merosesquiterpenoid từ chủng vi nấm Aspergillus ochraceopetaliformis SCSIO 05702 được phân lập từ Nam Cực [214]. Điểm khác biệt giữa hợp chất 7 và ochraceopone E là hợp chất 7 không có nhóm hydroxyl tại C-9. Vì vậy, cấu trúc của hợp chất 7 được xác định là 9-deoxy ochraceopone E và được đặt tên là ochraceopone F. 88 Ngoài ra, tương tác không gian trên phổ ROESY giữa H3-19 (δH 1,30) với Hb-10 (δH 2,01), Hb-10 (δH 2,01) với H3-21 (δH 1,21), H3-21 (δH 1,21) với Hb-15 (δH 2,64), và Hb-15 (δH 2,64) với H3-20 (δH 1,17) cho thấy các proton này ở cùng phía, trong khi không có sự tương tác trên phổ ROESY giữa hai nhóm methyl H3-19 và H3-20 với H-7 (δH 2,47) chỉ ra rằng H-7, H3-19, và H3-20 nằm ở các phía khác nhau trong các nối vòng. Bên cạnh đó, tương tác ROESY giữa H-7 (δH 2,47) với Hb-16 (δH 2,01) và giữa Hb-16 (δH 2,01) với Ha-15 (δH 2,49) chỉ ra hai nhóm methyl và nhóm methine ở các phía khác nhau. Cấu hình tuyệt đối của hợp chất ochraceopone E có bộ khung góc cạnh và rất giống với cấu hình của hợp chất 7. So sánh các độ dịch chuyển hóa học trên phổ NMR và tương tác trên phổ ROESY của hợp chất 7 và ochraceopone E cho thấy rằng hai hợp chất này có cùng một cấu hình lập thể tuyệt đối. Hình 3.23. Một số tương tác trên phổ COSY, HMBC và ROESY của hợp chất ochraceopone F (7) 3.4.1.8. Hợp chất 8: Asterriquinone C1 Hợp chất 8 được thu nhận dưới dạng hợp chất rắn màu tím và có công thức phân tử C29H26O4N2 được suy từ phổ ESI-MS (m/z 467,17 [M + H]+) kết hợp với dữ liệu NMR. Phổ 1H-NMR của hợp chất này cho thấy sự hiện diện của 2 singlet - OCH3 tại δH 3,66 (H-7) và 3,64 (H-8) và 2 vòng indole. Phổ 13C-NMR thể hiện hai carbon nhóm ketone δC 184,7 (C-1) và 183,9 (C-4), bốn carbon olefinic δC 156,1 (C-2); 129,2 (C-3); 154,1 (C-5) và 122,8 (C-6), trong đó có hai carbon gắn với oxy. Ở phổ HMBC, tín hiệu -OCH3 tại δΗ 3,64 and 3,66 có tương tác mạnh lần lượt với hai carbon olefinic tại δC 156,1 và 154,1 (Hình 3.24, Phụ lục 4). Dữ liệu phổ 1H and 13C-NMR của hợp chất 2 phù hợp ở từng vị trí với hợp chất asterriquinone C1 thu nhận từ chủng vi nấm 89 Aspergillus terreus Thom. [215]. Vì vậy, hợp chất 8 được xác định là asterriquinone C1. Hình 3.24. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất asterriquinone C1 (8) Kết luận: Từ dịch chiết lên men chủng vi nấm biển A. flocculosus 01NT.1.1.5 đã phân lập và xác định được cấu trúc của 8 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất mới phomaligol A2 (1) và ochraceopone F (7). 3.4.2. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 Từ cặn chiết ethyl acetate của chủng vi nấm biển Aspergillus sp. 01NT.1.12.3, tiến hành phân tách trên sắc ký cột silica gel và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 4 hợp chất 9-12. Sơ đồ phân tách các hợp chất được trình bày ở Hình 3.25. Phân đoạn n-hexane–EtOAc (75:25) được tinh chế bằng HPLC (cột YMC-SIL, 250 mm x 10 mm i.d., 5 μm, tốc độ dòng 1,5 mL/phút; đầu dò RI) sử dụng hệ dung môi MeOH–CHCl3-NH4Ac (97:3:1) thu được hợp chất 9 (16,0 mg), 10 (10,7 mg) và 11 (8,9 mg). Phân đoạn n-hexane–EtOAc (70:30) được tinh chế bằng HPLC (cột YMC-SIL, 250 mm x 10 mm i.d., 5 μm, tốc độ dòng 1,5 mL/phút; đầu dò RI) với hệ dung môi MeOH–CHCl3-NH4Ac (97:3:1), sau đó tiếp tục được tinh sạch bằng HPLC trên cột YMC- Pack-ODS (250 mm x 10 mm i.d., 5 μm), tốc độ dòng 1,5 mL/phút, đầu dò RI, sử dụng hệ dung môi MeOH 55% thu được hợp chất 12 (5,5 mg). 90 Hình 3.25. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 3.4.2.1. Hợp chất 9: Dihydroaspyrone Hợp chất 9 được thu nhận dưới dạng hợp chất dầu màu vàng và có công thức phân tử C9H14O4 được dự đoán từ phổ HR-ESI-MS (m/z 185,0819 [M-H]-). Phổ 1H- NMR khá ít tín hiệu, cho thấy đây là một chất có cấu trúc đơn giản. Tín hiệu của 2 nhóm methyl tại δH 1,42 (H-7) và 1,19 (H-10), 1 nhóm methylene tại δH 2,39; 2,40 (H2-8), và 4 nhóm methine tại δH 6,63 (H-4), 4,15 (H-5), 4,37 (H-6), và 3,97 (H-9). Phổ 13C-NMR thể hiện một carbon nhóm ketone δC 165,5 (C-2), hai carbon olefinic δC 144,9 (C-4), một carbon bậc bốn δC 128,8 (C-3), hai carbon có gắn với oxy δC 67,4 (C-5), 66,8 (C-9) (Hình 3.26, Phụ lục 4). Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 9 thể hiện sự tương đồng cao với hợp chất dihydroaspirone thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus ochraceus DSM-7428 [216]. Hợp chất 9 được xác định là dihydroaspirone. CC, silica gel – Gradient n-hexan/EtOAc Chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 Cặn chiết EtOAc (20 g/800 g gạo) Lên men trên môi trường RYE n-hexane–EtOAc (75:25) n-hexane–EtOAc (70:30) n-hexane–EtOAc (60:40) 9 (16,0 mg) 10 (10,7 mg) 12 (5,5 mg) 11 (8,9 mg) n-hexane–EtOAc (80:20) HPLC 91 Hình 3.26. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất dihydroaspirone (9) 3.4.2.2. Hợp chất 10: Aspilactonol F Hợp chất 10 được thu nhận dưới dạng hợp chất bột màu trắng và có công thức phân tử C9H14O4 được dự đoán từ phổ HR-ESI-MS (m/z 209,0785 [M+Na]+). Các tín hiệu proton và carbon olefinic ở trường thấp tại δH 7,27 (H-4), δC 147,4 (C-4) của phổ 1H và 13C-NMR và tín hiệu carbon ester ở δC 174,2 (C-2) trong phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của vòng lactone không bão hòa (Hình 3.27, Phụ lục 4). Bên cạnh đó, phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của 2 nhóm methyl tại δH 1,31 (H-7) và 1,25 (H-10), 1 nhóm methylene tại δH 2,52; 2,45 (H-8), và 4 nhóm methine tại δH 7,27 (H-4), 4,85 (H-5), 4,05 (H-6), 4,08 (H-9). Phổ 13C-NMR còn thể hiện một carbon olefinic bậc bốn δC 132,8 (C-3), hai carbon có gắn với oxy δC 67,8 (C-6), 66,2 (C-9). Hình 3.27. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất aspilactonol F (10) Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 10 thể hiện sự tương đồng cao với hợp chất aspilactonol F thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 16-02-1 phân lập từ trầm tích biển sâu thuộc vùng Tây Nam Thái Bình Dương [217]. Vì vậy, hợp chất 10 được xác định là aspilactonol F. 92 3.4.2.3. Hợp chất 11: 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (Hợp chất mới) Hợp chất 11 được thu nhận dưới dạng hợp chất bột màu trắng và có công thức phân tử được dự đoán là C15H22O5 được suy từ phổ HR-ESI-MS (m/z 305,1361 [M + Na]+). Phổ 1H-NMR có tín hiệu singlet của hai nhóm methyl ở δH 0,97 (H-13) và 1,40 (H-15); hai nhóm methylene có gắn với oxy tại δH 4,94; 4,79 (H-11) và 3,94; 3,26 (H-14); ba nhóm methylene tại δH 1,59; 1,54 (H-1), 1,71; 1,45 (H-2), 1,32; 1,10 (H- 3); ba nhóm methine, trong đó có hai nhóm oxymethine tại δH 3,99 (H-6) và 4,00 (H- 7) và một nhóm methine không gắn với oxy tại δH 1,57 (H-5). Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu một carbon ester tại δC 173,4 (C-12); hai carbon olefinic bậc bốn tại δC 122,1 (C-8) và 173,1 (C-9); bốn carbon có gắn với oxy tại δC 70,0 (C-6), 64,1 (C-7), 68,1 (C-11), 65,6 (C-14) (Hình 3.28, Phụ lục 4). Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11) Phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa ba nhóm methine (δH 1,57; 3,99 và 4,0) với các carbon tương ứng, cụ thể H-5 (δH 1,57) với C-9 (δC 173,1), C-10 (δC 36,3), H-6 (δH 3,99) với C-5 (δC 48,6), C-7 (δC 64,1), C-8 (δC 122,1) và C-10; H-7 (δH 4,0) với C-5 và C-6 của vòng sáu. Bên cạnh đó, có một vòng 6 khác cũng được xác nhận bởi các tương tác HMBC từ H-5 đến C-1 (δC 37,8), từ H-1 đến C-2 (δC 18,0) và C-5, từ H-3 đến C-1 và C-2. Tương tác HMBC từ hai nhóm methyl tại H-13 và H-15 lần lượt với các carbon C-4, C-5 và C-1, C-9, C-10 và tương tác HMBC của H-11 với C-8 và C-9 đã xác định được kết nối giữa ba vòng của khung sesquiterpene (Hình 3.27). 93 Dữ liệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 11 gần giống với hợp chất 6β,14- dihydroxy-7α-methoxyconfertifolin từ chủng vi nấm Aspergillus ochraceus Jcma1F17 được phân lập từ mẫu rong biển Coelarthrum sp. thu nhận ở vùng biển phía Nam Trung Quốc [218]. Điểm khác biệt giữa hợp chất 11 và 6β,14-dihydroxy- 7α-methoxyconfertifolin là hợp chất 11 có nhóm hydroxyl tại C-7 thay cho nhóm methoxy. Vì vậy, hợp chất 11 được xác định là hợp chất mới và được đặt tên là 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin. 3.4.2.4. Hợp chất 12: 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (Hợp chất mới) Hợp chất 12 được thu nhận dưới dạng hợp chất bột màu trắng và có công thức phân tử C15H22O5 được dự đoán từ sự kết hợp số liệu phổ NMR và phổ HR-ESI-MS (m/z 281,1390 [M-H]-). Quan sát các phổ NMR của hợp chất 12 cho thấy có sự tương tự với hợp chất 11. Sự khác biệt là có sự thay đổi vị trí nhóm hydroxyl tại C-7 ở hợp chất 11 trong khi chất 12 là ở C-9. Cụ thể, trên phổ 1H-NMR của hợp chất này thể hiện tín hiệu singlet của hai nhóm methyl ở δH 1,15 (H-13) và 1,23 (H-15); hai nhóm methylene có gắn với oxy tại δH 4,24; 4,44 (H-11) và 3,42; 4,41 (H-14); ba nhóm methylene không gắn với oxy tại δH 1,24; 2,13 (H-1), 1,50; 1,50 (H-2), 1,38; 1,63 (H- 3). Phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng tương tự với hợp chất 11 với tín hiệu của một carbon ester tại δC 169,6 (C-12); hai carbon olefinic bậc bốn tại δC 139,1 (C-7) và 130,1 (C-8); bốn carbon có gắn với oxy tại δC 63,5 (C-6), 77,5 (C-9), 75,0 (C-11), 68,4 (C-14) (Hình 3.29, Phụ lục 4). Hình 3.29. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12) 94 Dữ liệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất 12 gần giống với hợp chất pereniporin B được phân lập từ chủng vi nấm Perenniporia medullaepanis Aj 8345 [219]. Điểm khác biệt giữa hợp chất 12 và pereniporin B là hợp chất 12 có nhóm hydroxyl gắn với nhóm methyl tại C-14. Vì vậy, hợp chất 12 được xác định là hợp chất mới và được đặt tên là 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide. Kết luận: Như vậy, từ dịch chiết lên men chủng vi nấm biển Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất 9-12, trong đó có 2 hợp chất mới là 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11) và 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12). 3.4.3. Tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 Hình 3.30. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 CC, C18 – Gradient MeOH/H2O 50%-3 13 (7,6 mg) 14 (17,6 mg) Chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 Lên men trên môi trường RYE Cặn chiết MeOH (8,9 g) 10% M 20% M 40% M 50% M 60% M 70% M 80% M 100% M 70%-1 HPLC Cặn chiết EtOAc (12,5 g/800 g gạo) 95 Cặn chiết methanol của chủng vi nấm P. chrysogenum 045-357-2 được phân tách trên sắc ký cột gel C18 và tinh chế bằng HPLC thu nhận được 2 hợp chất 13 và 14. Sơ đồ phân tách các hợp chất được thể hiện ở Hình 3.30. Phân đoạn 70% được tiếp tục tinh sạch trên HPLC (cột YMC-Pack-ODS-A, 250 mm x 4,6 mm i.d., 5 μm, tốc độ dòng 1 mL/phút, đầu dò RI) sử dụng hệ dung môi phân tách 63% MeOH trong H2O (v/v) thu được hợp chất 13 (7,6 mg). Kết tủa từ phân đoạn 50% được rửa nhiều lần với MeOH và thu được hợp chất sạch 14 (17,6 mg). 3.4.3.1. Hợp chất 13: Andrastin A Hợp chất 13 được phân lập dưới dạng chất rắn màu nâu. Công thức phân tử của hợp chất này được đề nghị là C28H38O7 qua peak m/z 485,2 [M-H]- ở phổ ESI- MS. Phổ 1H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của khung meroterpenoid bao gồm sáu nhóm methyl tại H 1,59 (H-18); 1,15 (H-20); 1,74 (H-21); 1,23 (H-22); 0,94 (H-24); 0,87 (H-25), một nhóm acetoxy tại H 1,59 (H-18) và một nhóm methoxy tại H 3,58 (H-28). Ngoài ra, phổ cũng thể hiện tín hiệu của proton olefinic tại H 5,38 (H-11). Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của một carbon aldehyde tại C 205,5 (C-23); một carbon ketone tại C 200,0 (C-17); hai carbon ester tại C 170,8 (C-19) và 170,6 (C-26); bốn tín hiệu đặc trưng của carbon mang nối đôi là C 122,0 (C-11); 135,9 (C-12); 185,0 (C15) và 112,7 (C-16); tín hiệu của carbon acetoxy methyl C 19,7 (C-27), methyl ester C 50,7 (C-28); hai tín hiệu của nhóm methyl geminal C 25,7 (C-24) và 20,1 (C-25), hai tín hiệu methyl vinyl C 5,1 (C-18) và 18,5 (C-21) và hai nhóm methyl gắn trên carbon bậc bốn C 14,6 (C-20) và 18,4 (C-22) (Hình 3.31, Phụ lục 4). Phổ HMBC cho thấy mối tương quan từ proton đến các carbon như sau: H-1 đến C-5, C-9, C-23; H-3 đến C-1, C-4 ; H-5 đến C-4, C-6, C-7, C-10, C-23, C-24 và C-25; H-7 đến C-6, C-8, C-9 và C-14; H-9 đến C-8, C-10, C-11, C-12 và C-23; H-11 đến C-8, C-9 và C-13 điều này chứng minh cho sự có mặt của các vòng A, B, C của khung meroterpenoid. Ngoài ra, phổ còn cho thấy sự xuất hiện của nhóm –CHO qua 96 các tương quan của H-1, H-5, H-9 đến C-23. Hình 3.31 thể hiện một số tương quan từ proton đến các carbon đặc trưng. Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất andrastin A (13) Các số liệu phổ của hợp chất 13 được so sánh với số liệu phổ của hợp chất andrastin A từ chủng vi nấm Penicillium sp. FO-3929 [220] cho thấy có sự trùng khớp nhau, vì vậy hợp chất 13 được xác định là andrastin A. 3.4.3.2. Hợp chất 14: Citreohybridonol Hợp chất 14 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Công thức phân tử của hợp chất 14 được đề nghị là C28H36O8 qua peak m/z 499,23 [M-H]- ở phổ ESI- MS. Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất 14 cũng thể hiện những tín hiệu đặc trưng của khung meroterpenoid và cũng cho thấy có nhiều tín hiệu tương đồng với phổ của hợp chất 13. Ngoại trừ sự biến mất của nhóm –CHO và thay vào đó là nhóm ester vòng B. Sự xuất hiện của ester vòng được thể hiện bằng mối tương quan trên phổ HMBC (Hình 3.32, Phụ lục 4). Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác trên phổ HMBC của hợp chất citreohybridonol (14) 97 Số liệu phổ của hợp chất 14 được so sánh với số liệu phổ của hợp chất citrohybridonol từ chủng vi nấm Penicillium citreo – viride B. IFO 4692 [221] thấy có sự trùng hợp. Vì vậy hợp chất 14 được xác định là citreohybridonol. Kết luận: Như vậy, từ dịch chiết lên men chủng vi nấm biển P. chrysogenum 045-357-2 đã phân lập được hai hợp chất andrastin A và citreohybridonol. 3.5. Xác định hoạt tính sinh học của 14 hợp chất chuyển hóa thứ cấp từ 3 chủng vi nấm biển tuyển chọn 3.5.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết quả cho thấy 14 hợp chất thu nhận thể hiện hoạt tính kháng sinh với hầu hết các chủng VSV kiểm định (Bảng 3.7). Trong đó, hợp chất mới ochraceopone F (7) phân lập từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 thể hiện hoạt tính kháng hiệu quả nhất đối với các chủng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và cả chủng nấm men C. albicans với giá trị MIC từ 8-32 µg/mL. Bốn hợp chất phomaligol A2 (1), wasabidienone E (2), aspertetranone D (3) và mactanamide (4) có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng VSV kiểm định với giá trị MIC 16-128 µg/mL. Riêng 3 hợp chất cycloechinulin (5), asteltoxin (6) và asterriquinone C1 (8) không có khả năng kháng hoặc kháng yếu đối với 2 chủng vi khuẩn S. aureus và E. coli. Nghiên cứu cũng cho thấy 4 hợp chất dihydroaspyrone (9), aspilactonol F (10), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11) và 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12) thu nhận từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 đều có hoạt tính kháng 6 chủng VSV kiểm định với giá trị MIC 16-32 µg/mL. Trong số 2 hợp chất thu nhận từ chủng P. chrysogenum 045-357-2, hợp chất citreohybridonol (14) thể hiện hoạt tính kháng các chủng B. cereus, S. aureus và S. faecalis mạnh hơn so với hợp chất andrastin A (13), MIC 16-32 µg/mL. Kết quả ở Bảng 3.7 cho thấy cả 14 hợp chất thử nghiệm đều kháng lại C. albicans (MIC, 16-64 µg/mL), hiệu quả hơn so với 2 kháng sinh được sử dụng làm đối chứng dương là amoxicillin và cefotaxime. 98 Bảng 3.7. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất 1-14 STT Tên hợp chất Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (MIC, µg/mL) Vi khuẩn Gram (+) Vi khuẩn Gram (-) Nấm men B. cereus ATCC 11778 S. faecalis ATCC 19433 S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 C. albicans ATCC 10231 Hợp chất từ chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 1 Phomaligol A2 (1) 128 32 128 64 16 16 2 Wasabidienone E (2) 128 32 64 64 16 16 3 Aspertetranone D (3) 64 32 64 64 16 16 4 Mactanamide (4) 64 32 64 128 16 32 5 Cycloechinulin (5) 64 64 > 256 128 64 64 6 Asteltoxin (6) 64 64 > 256 128 64 64 7 Ochraceopone F (7) 8 8 8 32 16 16 8 Asterriquinone C1 (8) 32 32 > 256 > 256 32 64 Hợp chất từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 9 Dihydroaspyrone (9) 16 32 32 32 32 32 10 Aspilactonol F (10) 16 32 32 32 32 32 11 6β,7α,14- trihydroxyconfertifolin (11) 32 32 32 32 32 32 12 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12) 32 32 32 32 32 32 Hợp chất từ chủng P. chrysogenum 045-357-2 13 Andrastin A (13) 128 128 64 32 16 32 14 Citreohybridonol (14) 32 64 16 32 16 32 Đối chứng dương 15 Amoxicillin 256 256 0,25 8 64 > 256 16 Cefotaxime 128 16 2 0,125 8 > 256 99 Bảng 3.8. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất 1-14 STT Tên hợp chất Hoạt tính ức chế sự phát triển tế bào ung thư của các hợp chất ở nồng độ 30 µg/mL (%) HCT-15 NUGC-3 NCI-H23 ACHN PC-3 MDA-MB-231 Hợp chất từ chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 1 Phomaligol A2 (1) 26,45 ± 2,14 19,77 ± 7,70 28,55 ± 5,74 19,62 ± 1,92 26,94 ± 3,78 19,74 ± 4,26 2 Wasabidienone E (2) 21,71 ± 3,44 17,91 ± 8,65 22,02 ± 2,12 21,05 ± 6,85 23,22 ± 0,45 23,68 ± 1,77 3 Aspertetranone D (3) 19,17 ± 2,64 25,82 ± 9,86 23,03 ± 6,92 20,20 ± 6,76 25,89 ± 5,18 37,16 ± 1,37 4 Mactanamide (4) 22,76 ± 2,09 19,14 ± 7,19 20,78 ± 3,51 22,22 ± 2,62 19,51 ± 0,28 16,51 ± 2,71 5 Cycloechinulin (5) 28,47 ± 2,49 24,60 ± 7,79 29,12 ± 5,27 25,33 ± 3,31 22,97 ± 3,72 26,66 ± 6,74 6 Asteltoxin (6) 16,19 ± 1,58 14,57 ± 6,32 19,45 ± 3,78 17,02 ± 2,15 18,59 ± 3,02 15,33 ± 2,19 7 Ochraceopone F (7) 19,32 ± 3,59 16,97 ± 6,92 21,03 ± 4,25 19,78 ± 5,21 20,67 ± 2,45 17,56 ± 3,22 8 Asterriquinone C1 (8) 81,58 ± 2,49 77,36 ± 5,52 83,58 ± 2,35 80,3 ± 3,32 88,07 ± 3,24 92,51 ± 2,08 Hợp chất từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 9 Dihydroaspyrone (9) - - - - - - 10 Aspilactonol F (10) - - 12,25 ± 2,56 - 9,41 ± 3,42 8,62 ± 2,37 11 6β,7α,14- trihydroxyconfertifolin (11) - - - - - - 12 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12) - - - - - - Hợp chất từ chủng P. chrysogenum 045-357-2 13 Andrastin A (13) 33,25 ± 2,67 29,86 ± 3,92 34,55 ± 4,01 26,74 ± 2,15 39,54 ± 3,08 22,36 ± 1,78 14 Citreohybridonol (14) 36,72 ± 3,05 35,19 ± 4,06 32,15 ± 3,78 34,22 ± 3,03 40,25 ± 2,97 38,65 ± 2,31 Đối chứng dương Adriamycin (0,3 µg/mL) 80,07 ± 6,96 78,01 ± 6,00 80,52 ± 2,58 79,58 ± 6,60 84,22 ± 1,03 81,79 ± 4,86 “-”: Không có hoạt tính 100 3.5.2. Xác định hoạt tính gây độc tế bào Các hợp chất thu nhận được đánh giá hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào ung thư gồm HCT-15, NUGC-3, NCI-H23, ACHN, PC-3 và MDA-MB-231 theo phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro ở nồng độ 30 µg/mL (Bảng 3.8). Adriamycin (0,3 µg/mL) được sử dụng làm đối chứng dương. Trong số 8 hợp chất thu nhận từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5 chỉ có hợp chất asterriquinone C1 (8) thể hiện khả năng ức chế hiệu quả đối với cả 6 dòng tế bào thử nghiệm. Các hợp chất phân lập từ 2 chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 và P. chrysogenum 045- 357-2 đều không có khả năng ức chế hoặc ức chế yếu đến sự phát triển của các dòng tế bào thử nghiệm. Hợp chất asterriquinone C1 (8) thể hiện hoạt tính ức chế >50% sự phát triển tế bào ung thư HCT-15, NUGC-3, NCI-H23, ACHN, PC-3 và MDA-MB-231 nên được tiếp tục thí nghiệm ở các nồng độ khác nhau để xác định giá trị IC50. Kết quả cho thấy hợp chất 8 có khả năng ức chế các dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 30-40 µM (Bảng 3.9). Bảng 3.9. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hợp chất asterriquinone C1 (8) Dòng tế bào IC50 (µM) HCT-15 36,52 ± 2,57 NUGC-3 40,05 ± 4,02 NCI-H23 33,28 ± 2,96 ACHN 35,82 ± 3,51 PC-3 32,94 ± 3,05 MDA-MB-231 30,50 ± 2,36 3.5.3. Xác định hoạt tính chống oxy hóa Các hợp chất thu nhận được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS. Kết quả ở Bảng 3.10 cho thấy các hợp chất thử 101 nghiệm có khả năng khử gốc tự do ABTS hiệu quả hơn so với gốc tự do DPPH. Nghiên cứu cho thấy trong số 8 hợp chất thu nhận từ chủng vi nấm A. flocculosus 01NT.1.1.5, có 7 hợp chất thể hiện hoạt tính chống oxy hóa, riêng hợp chất asterriquinone C1 (8) không có khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS. Hợp chất mactanamide (4) và wasabidienone E (2) có khả năng bắt gốc tự do ABTS hiệu quả nhất với giá trị EC50 lần lượt 1,72 và 12,03 µg/mL. Bảng 3.10. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất 1-14 STT Tên hợp chất EC50 (µg/mL) DPPH ABTS Hợp chất từ chủng A. flocculosus 01NT.1.1.5 1 Phomaligol A2 (1) 441,02 ± 3,79 119,33 ± 1,51 2 Wasabidienone E (2) 251,52 ± 16,20 12,03 ± 0,02 3 Aspertetranone D (3) 251,87 ± 0,67 67,81 ± 0,68 4 Mactanamide (4) 85,47 ± 0,64 1,72 ± 0,01 5 Cycloechinulin (5) 190,19 ± 1,64 73,48 ± 1,25 6 Asteltoxin (6) 212,20 ± 0,97 90,24 ± 0,29 7 Ochraceopone F (7) 324,39 ± 0,84 117,84 ± 0,49 8 Asterriquinone C1 (8) - - Hợp chất từ chủng Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 9 Dihydroaspyrone (9) - - 10 Aspilactonol F (10) - - 11 6β,7α,14- trihydroxyconfertifolin (11) - - 12 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12) - - Hợp chất từ chủng P. chrysogenum 045-357-2 13 Andrastin A (13) 100,01 ± 1,29 6,86 ± 0,02 14 Citreohybridonol (14) 135,75 ± 0,69 11,06 ± 0,50 Đối chứng Axit ascorbic 57,05 ± 1,04 10,31 ± 0,89 “-”: Không có hoạt tính 102 Bốn hợp chất dihydroaspyrone (9), aspilactonol F (10), 6β,7α,14- trihydroxyconfertifolin (11) và 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12) thu nhận từ chủng vi nấm Aspergillus sp. 01NT.1.12.3 đều không thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. Trong khi đó, hai hợp chất andrastin A (13) và citreohybridonol (14) phân lập từ chủng P. chrysogenum 045-357-2 có khả năng bắt gốc tự do ABTS hiệu quả với giá trị EC50 lần lượt 6,86 và 11,06 µg/mL. 3.5.4. Xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Các hợp chất aspertetranone D (3), mactanamide (4), dihydroaspyrone (9) và aspilactonol F (10), 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11) và 6β,9α,14- trihydroxycinnamolide (12) được đánh giá khả năng gây độc đối với dòng tế bào thần kinh Neuro2a. Kết quả cho thấy trong số 6 hợp chất thử nghiệm, chỉ có hợp chất 6β,9α,14-trihydroxycinnamolide (12) có khả năng gây độc tế bào ở nồng độ IC50 là 24,1 µM. Trong khi 5 hợp chất thử nghiệm còn lại đều không gây ức chế sự phát triển của tế bào thần kinh Neuro2a ở nồng độ lên đến 100 µM. Hình 3.33. Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Neuro2a của hợp chất mactanamide ở nồng độ 1 µM và 10 µM Các hợp chất aspertetranone D (3), mactanamide (4), dihydroaspyrone (9) và aspilactonol F (10), và 6β,7α,14-trihydroxyconfertifolin (11) tiếp tục được xác định hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh Neuro2a được xử lý bằng 6-OHDA. Tuy nhiên chỉ có hợp chất mactanamide (4) thể hiện hoạt tính làm tăng 42% khả năng tồn tại của tế bào Neuro2a được xử lý bằng 6-OHDA ở nồng độ 50 µM khi hợp chất này được bổ sung vào trước khi gây độc tế bào thần kinh 1 giờ (Hình 3.33). 103 CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Hình thái và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của vi nấm biển ở miền Trung Việt Nam Phân tích hình thái của 273 chủng vi nấm thu nhận từ 3 vùng biển Ninh Thuận, Nha Trang và Đà Nẵng cho thấy hầu hết các chủng có khuẩn lạc hình dạng tròn (86,1%), bề mặt phẳng (55,3%) và viền liền (74,7%). Các tài liệu công bố đã chỉ ra rằng vi nấm có những đặc trưng về hình thái khuẩn lạc khi được thu nhận từ các nguồn và địa điểm phân lập khác nhau [222]. Trong nghiên cứu này, các chủng vi nấm có bề mặt trơn/mịn chiếm tỷ lệ cao trong số các chủng vi nấm phân lập từ Nha Trang và Đà Nẵng nhưng lại không được phổ biến ở các chủng vi nấm thu nhận từ vùng biển Ninh Thuận. Phần lớn