MỞ ĐẦU . 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4
1.1. Gan và một số bệnh về gan. 4
1.1.1. Cấu trúc của gan. 4
1.1.2. Chức năng và một số hoạt động sinh lý của gan. 6
1.1.3. Một số dạng bệnh lý thường gặp của gan . 7
1.2. Stress oxy hóa trong các bệnh gan. 9
1.2.1. Gốc tự do. 9
1.2.2. Stress oxy hóa trong bệnh gan .10
1.2.3. Chống oxy hóa và bảo vệ gan .10
1.2.4. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trong bảo vệ gan in vitro, ex vivo.13
1.3. Vai trò của một số cytokine và hệ chuyển đổi tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3
(signal transducer and activator of transcription 3- stat3) trong bệnh gan.14
1.3.1. Một số cytokine liên quan đến sinh học bệnh gan .14
1.3.2. Tín hiệu hoạt hóa phiên mã 3 (Signal transducer and activator of
transcription 3 – STAT3) trong tế bào Kupffer và trong bệnh gan.18
1.4. Các loài thực vật sử dụng trong nghiên cứu.19
1.4.1. Cây Dứa dại (Pandanus odoratissimus L.f).19
1.4.2. Cây Nhó đông(Morinda longissima Y.Z.Ruan).22
1.4.3. Cây Chùm ruột (Phyllanthus acidus L. Skeels).26
Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.31
2.1. Vật liệu nghiên cứu .31
2.1.1. Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu .31
2.1.2. Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu .32
2.1.3. Thiết bị .32
2.2. Các phương pháp nghiên cứu hóa học.33
2.2.1. Phương pháp điều chế các phần chiết từ nguyên liệu thực vật để sàng lọc
hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan.33iv
2.2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất.37
2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất.37
2.3. Các phương pháp nghiên cứu sinh học .38
2.3.1. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH.38
2.3.2. Phương pháp xác định khả năng ức chế peroxyl hóa lipid (thử nghiệm MDA).39
2.3.3. Phương pháp xác định khả năng bảo vệ tế bào gan .40
2.3.4. Phương pháp xác định hoạt tính cảm ứng/ức chế cytokine .41
2.3.5. Phương pháp xử lí số liệu.42
Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .43
3.1. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa và phân tích sơ bộ thành phần hóa
học các phân đoạn của quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá Chùm ruột.43
3.1.1. Điều chế các phần chiết từ quả Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột .43
3.1.2. Sơ bộ phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn tách chiết từ quả
Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá Chùm ruột.43
3.1.3. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của quả cây Dứa dại, rễ cây
Nhó đông và lá cây Chùm ruột .45
3.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn PO-B;ML-B và
PA-C.49
3.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PO-B của quả Dứa dại.49
3.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ML-B của rễ cây Nhó đông.51
3.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PA-C của lá cây Chùm ruột.54
3.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được
tách chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột.60
3.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ
phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại .60
3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết
từ phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông .65
3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết
từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột .69
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ.85v
4.1. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của quả Dứa dại, rễ cây
Nhó đông và lá cây Chùm ruột .85
4.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ các phân đoạn PO-B; ML-B
và PA-C .86
4.2.1. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PO-D của quả cây Dứa dại .86
4.2.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn ML-B của rễ cây Nhó đông.90
4.2.3. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ phân đoạn PA-E của lá Chùm ruột.92
4.3. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách
chiết từ quả cây Dứa dại, rễ cây Nhó đông và lá cây Chùm ruột .106
4.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ
phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại .106
4.3.2. Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ
phân đoạn ML-B rễ cây Nhó đông.108
4.3.3. Hoạt tính chống oxi hóa, bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết từ
phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột .109
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .116
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH .118
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐLIÊN QUAN ĐẾN
ĐỀ TÀI .123
TÀI LIỆU THAM KHẢO .124
PHỤ LỤC
211 trang |
Chia sẻ: trungkhoi17 | Lượt xem: 471 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận án Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ gan của ba loài thực vật dứa dại (Pandanus Odoratissimus), nhó đông (morinda longissima), chùm ruột (Phyllanthus Acidus) ở Việt Nam - Nguyễn Công Thùy Trâm, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
, 6-CH3).
13
C-NMR (125MHz, CD3OD, ppm): 179,5 (s, C-4), 165,9 (s, C-7), 163,2
(s, C-5), 161,5 (s, C-4), 158,6 (s, C-9), 158,4 (s, C-2), 135,1 (s, C-3), 132,2(d, C-2,
C-6), 122,8 (s, C-1), 116,4 (d, C-3, C-5), 105,8 (s, C-10), 102,2 (s, C-1), 101,0
(d, C-1), 99,8 (d, C-6), 94,7 (d¸ C-8), 77,2 (dd, C-2), 74,0 (*,C-4), 72,7 (m, C-
3), 72,4 (s, C-2), 72,3 (dd, C-3), 70,2 (dd, C-5), 68,3 (m, C-4), 65,0 (d, C-
5), 17,7 (d, C-6).
Hợp chất PA10
Chất bột, màu vàng cam, C21H20O12 (M=464)
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD, ppm): 7,73 (1H, s, H-2), 7,60 (1H, dd, 1,5,
8,0 Hz, H-6), 6,88 (1H, d, 8,0 Hz, H-5), 6,33 (1H, s, H-8), 6,16 (1H, s, H-6), 5,17
(1H, d, 7,5, H-1), 3,73 (1H, dd, 2,0, 12,0 Hz, H-6), 3,60 (1H, dd, 5,0, 12,0 Hz, H-
60
6), 3,51 (1H, dd, 7,5, 9,0 Hz, H-2), 3,45 (1H, dd, 9,0, 9,0 Hz, H-3), 3,37 (1H, t,
9,0 Hz, H-4), 3,25 (1H, m, H-5).
13
C-NMR (125MHz, CD3OD, ppm): 179,1 (s, C-4), 169,5 (s, C-7), 162,8
(s, C-5), 158,7 (s, C-2, C-9), 150,1 (s, C-4), 145,0 (s, C-3), 135,5 (s, C-3), 123,2
(dd, C-6), 123,0 (s, C-1), 117,5 (s, C-2), 116,0 (d, C-5), 104,8 (d, C-1), 104,7
(s, C-10), 101,1 (s, C-6), 95,6 (s, C-8), 78,3 (m, C-5), 78,1 (d, C-3), 75,7 (d, C-
2), 71,2 (t, C-4), 62,6 (d, C-6).
Hợp chất PA11
Chất bột, màu vàng sẫm, C27H30O16 (M=610)
1
H-NMR (500 MHz, CD3OD, ppm): 7,69 (1H, s, H-2), 7,65 (1H, d, 8,5 Hz, H-
6), 6,89 (1H, d, 8,5 Hz, H-5) 6,42 (1H, s, H-8), 6,23 (1H, s, H-6), 5,12 (1H,d, 7,5 Hz,
H-1), 4,54 (1H, s, H-1), 3,82 (1H, d, 11,0 Hz, H-6), 3,65 (1H, s, H-2), 3,56 (1H, dd,
3,0, 9,0, H-3), 3,50 (1H, dd, 7,5, 9,0 Hz, H-2), 3,47 (1H, m, H-5), 3,43 (1H, dd, 9,0,
9,0 Hz, H-3), 3,40 (1H, dd, 5,0, 11,0 Hz, H-6), 3,33 (1H, m, H-5), 3.30 (1H, dd, 9.0,
9,0 Hz, H-4), 3,28 (1H, overlap, H-4), 1,14 (1H, d, 6,0 Hz, H-6).
13
C-NMR (125MHz, CD3OD, ppm): 179,4 (s, C-4), 166,0(s, C-7), 163,0 (s,
C-5), 159,4 (s, C-9), 158.5 (s, C-2), 149,8 (s, C-5), 145,8 (s, C-3), 135,6 (s, C-3),
123,6 (d, C-6), 123,1 (s, C-1), 117,7 (s, C-2), 116,1 (d, C-5), 105,6 (s,C-10), 104,7
(d, C-1), 99,9 (s, C-6), 94,9 (s, C-8), 78,2 (dd, C-3), 75,7 (dd, C-2), 71,4 (d, C-4).
3.3. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA
CÁC HỢP CHẤT ĐƢỢC TÁCH CHIẾT TỪ QUẢ CÂY DỨA DẠI, THÂN
RỄ CÂY NHÓ ĐÔNG VÀ LÁ CÂY CHÙM RUỘT
3.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của các hợp chất đƣợc tách chiết từ
phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại
3.3.1.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PO-B
quả Dứa dại
a. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PO-B
của quả Dứa dại bằng phương pháp DPPH
Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất thứ cấp được tách chiết từ phân
đoạn PO-B của quả Dứa dại được đánh giá trên mô hình loại bỏ gốc tự do DPPH.
61
Hiệu quả loại bỏ gốc tự do, chống oxy hóa của các chất tinh khiết được so sánh với
acid ascorbic, kết quả được thể hiện qua hình 3.4.
Hình 3.4. Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất PO1: Vanillin;
PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-medioresinol phân lập
từ phân đoạn chiết PO-B quả Dứa dại
Trong 4 hợp chất thứ cấp được phân lập từ phân đoạn PO-B, có 3 hợp chất là
(+)-pinoresinol; (+)-syringaresinol và (+)-medioresinol có hoạt tính chống oxy hóa.
Giá trị IC50 của của các hợp chất lần lượt 7,50 µg/ml; 16,53 µg/ml và 5,93 µg/ml
(Hình3.4). Qua phương pháp DDPH cho thấy (+)-medioresinol có hoạt tính loại bỏ
gốc tự do lớn hơn (+)-pinoresinol; (+)-syringaresinol. So sánh với chất chuẩn acid
ascorbic, hiệu quả chống oxy hóa của (+)-medioresinol và (+)-pinoresinol cao hơn
chất chuẩn ascorbic aicd (13,23 µg/ml), trong khi đó, tác dụng của (+)-
syringaresinol lại thấp hơn.
b. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn
PO-B của quả Dứa dại thông qua thử nghiệm MDA
Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PO-B
quả Dứa dại được tiếp tục đánh giá thông qua mô hình ức chế quá trình peroxid
hóa lipid, kết quả được trình bày qua hình 3.5.
>100
7.5
16.53
5.93
13.23
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PO1 PO2 PO3 PO4 Acid
ascorbic
IC50
(µg/ml)
Hợp chất
62
Hình 3.5. Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất PO1: Vanillin;
PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol ; PO4: (+)-medioresinol
phân lập từ phân đoạn chiết PO-B quả Dứa dại
Kết quả khảo sát về hoạt tính chống oxy hóa thông qua mô hình ức chế quá
trình peroxid hóa lipid cho thấy 2 hợp chất (+)-medioresinol và (+)-pinoresiol có hoạt
tính ức chế quá trình peroxyl hóa lipid, trong đó, hoạt tính của (+)-medioresinol cao
hơn so với (+)-pinoresiol. Giá trị IC50 của các chất lần lượt 5,82 µg/ml và 11,04
µg/ml (Hình 3.5).
Như vậy, trong 2 phương pháp nghiên cứu, (+)-medioresinol, (+)-pinoresiol
đều có hoạt tính chống oxy hóa mạnh và hợp chất (+)-medioresinol có hoạt tính
chống oxy hóa cao hơn so với hợp chất (+)-pinoresiol. Ngoài ra, hợp chất (+)-
syringaresinol cũng có hoạt tính chống oxy hóa qua con đường loại bỏ gốc tự do,
tuy nhiên chất này lại không có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid (IC50 >
100 µg/ml). Do đó, 3 chất này có khả năng bảo vệ gan thông qua hoạt tính chống
oxy hóa. Các chất được tách chiết từ phân đoạn PO-B tiếp tục được khảo sát hoạt
tính bảo vệ gan in vitro.
>100
11.04
>100
5.82
12.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PO1 PO2 PO3 PO4 Trolox Hợp chất
IC50
(µg/ml)
63
3.3.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 và tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 dưới
tác động gây độc của CCl4 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PO-B
quả cây Dứa dại
a. Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn
PO-B quả cây Dứa dại
Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PO-
B quả cây Dứa dại được trình bày qua bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất
được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả Dứa dại
Mẫu Nồng độ (µg/ml) % tế bào sống sót
PO1
100 95,67± 7,41
50 95,25± 3,56
25 96,35± 5,85
12,5 97,03± 1,19
PO2
100 90,22± 3,70
50 92,73± 1,63
25 95,77± 2,67
12,5 98,18± 3,41
PO3
100 100,70± 2,82
50 101,59± 3,19
25 98,60± 1,48
12,5 103,21± 4,89
PO4
100 106,41± 2,59
50 100,75± 5,85
25 98,08± 1,04
12,5 95,93± 0,07
Quercetin 100 92,97 ± 3,59
(Ghi chú PO1: Vanillin; PO2:(+)-pinoresinol; PO3:(+)-syringaresinol; PO4: (+)-
medioresinol.).
64
Kết quả bảng 3.5. cho thấy, t lệ tế bào sống sót ở các giếng bổ sung các hợp
chất vanillin, (+)-pinoresiol, (+)-syringaresinol, (+)-medioresinol tách chiết từ quả
Dứa dại ở nồng độ 12,5; 25; 50; 100 µg/mlđạt giá trên 90%, như vậy cả 4 hợp chất
được tách chiết từ quả cây Dứa dại đều không gây độc cho tế bào HepG2 ở các
nồng độ nghiên cứu.
b. Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 dưới tác động gây độc của CCl4 của các hợp chất
được tách chiết từ phân đoạn PO-B quả cây Dứa dại
Để đánh giá hoạt tính bảo vệ gan in vitro, các chất được phân lập từ quả Dứa
dại được đánh giá bằng cách nuôi cấy tế bào HepG2 cùng với sự có mặt của CCl4.
CCl4 là chất độc có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua việc tạo ra gốc tự
do dẫn đến quá trình peroxy hóa các phân tử lipid của tế bào và gây tổn thương
nghiêm trọng cho tế bào. Bên cạnh đó, tế bào HepG2 được xem là mô hình in vitro
thích hợp cho thử nghiệm này, do dòng tế bào này còn duy trì được khá nhiều các
đặc tính hóa sinh, hình thái tương tự như tế bào gan lành tính. Vì vậy, mô hình này
có thể được sử dụng để nghiên cứu sự tổn thương tế bào gan và sàng lọc các hợp
chất tự nhiên chống nhiễm độc gan (Krithika và cs., 2013; Gonzales và cs. 2017).
Kết quả hoạt tính bảo vệ tế bào gan HepG2 được trình bày qua hình 3.6
Ở giếng đối chứng sau khi ủ với 40 mM CCl4, tỉ lệ sống của tế bào HepG2
giảm xuống còn 37,36±1,32 %, điều này cho thấy CCl440mM gây độc tính mạnh
đối với tế bào HepG2 (Hình 3.8). T lệ phần trăm về sự sống sót của tế bào HepG2
tăng lên ở các giếng được ủ với hợp chất (+)-pinoresiol; (+)-medioresinolở nồng độ
50 và 100 µg/ml và hợp chất vanillin, (+)-syringaresinol ở nồng độ 100 µg/ml trước
khi xử lý CCl4, tuy nhiên mức tăng không đáng kể. T lệ phần trăm sống sót của tế
bào HepG2 ở các giếng được xử lý bằng (+)-pinoresiol ở nồng độ 50 và 100 µg/ml
lần lượt là 46,88 ± 0,70 %; 41,07 ± 0,58 %; xử lý bằng (+)-medioresinol ở nồng độ
50 và 100 đạt giá trị 41,07 ± 2,44% và 42,78 ± 2,54% , ở các giếng xử lý bằng
vanillin, (+)-syringaresinol ở nồng độ 100 µg/ml có t lệ tế bào Hep2G sống sót
42,61± 1,54%; 40,08 ± 0,60% (Hình 3.6).
65
Hình 3.6. Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của
các hợp chất PO1: vanillin; PO2: (+)-pinoresinol; PO3: (+)-syringaresinol; PO4: (+)-
medioresinol được tách chiết từ phân đoạn PO-B của quả Dứa dại
3.3.2. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất đƣợc tách chiết
từ phân đoạn ML-B thân rễ cây Nhó đông
3.3.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn ML-B
thân rễ cây Nhó đông
a. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn ML-B
của thân rễ cây Nhó đông bằng phương pháp DPPH
Kết quả hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình loại bỏ gốc tự do DPPH của
3 hợp chất được phân lập từ phân đoạn ML-B thân rễ cây Nhó đông được trình
bày hình 3.7.
37.36
93.75
35.81
34.24
35.81
42.61
34.78
32.5
46.88
41.07
34.26
36.55
35.54
40.08
33.68
41.56
41.07
42.78
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
t
ế
b
à
o
H
ep
G
2
s
ố
n
g
Hợp chất ở các nồng độ khác nhau và đối chứng
66
Hình 3.7. Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất ML1:
morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol
phân lập từ phân đoạn chiết ML-B rễ cây Nhó đông
Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 3 hợp chất morindone-5-methyl ether,
morindone-6-methyl ether, soranjidiol đều không thể hiện hoạt tính chống oxy hóa
thông qua hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH. Giá trị IC50 của cả 3 chất đều lớn hơn
100 µg/ml (hình 3.7).
b. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn
ML-B của thân rễ cây Nhó đông thông qua thử nghiệm MDA
Các hợp chất phân lập từ phân đoạn ML-B thân rễ cây Nhó đông được tiếp
tục đánh giá hoạt tính chống oxy hóa thông qua mô hình ức chế quá trình peroxy
hóa lipid.
>100 >100 >100
13.23
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ML1 ML1 ML3 Ascobic acid Hợp chất
IC50
(µg/ml)
67
Hình 3.8. Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất ML1: morindone-
5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether; ML3: soranjidiol phân lập từ
phân đoạn chiết ML-B thân rễ cây Nhó đông
Kết quả khảo sát (Hình 3.8) cho thấy cả 3 hợp chất morindone-5-methyl
ether, morindone-6-methyl ether, soradidiol đều không thể hiện hoạt tính chống oxy
hóa thông qua hoạt động ức chế quá trình peroxy hóa lipid.
Như vậy, trên cả 2 mô hình nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa bằng
phương pháp DDPH và MDA, cả 3 hợp chất morindone-5-methyl ether,
morindone-6-methyl ether, soradidiol đều không thể hiện hoạt chống oxy hóa. Các
chất này tiếp tục được khảo sát hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động
gây độc của CCl4.
3.3.2.2. Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 và tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 dưới tác
động gây độc của CCl4 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ
cây Nhó đông
a. Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn
ML-B thân rễ cây Nhó đông
Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất phân lập từ phân đoạn
ML-B thân rễ cây Nhó đông được trình bày qua bảng 3.6.
>100 >100 >100
12.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
ML1 ML2 ML3 Trolox Hợp chất
IC50
(µg/ml)
68
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất
được tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ cây Nhó đông
Mẫu Nồng độ (µg/ml) % tế bào sống sót
ML1
100 91,47 ± 3,30
50 105,26 ± 7,04
25 103,27 ± 3,56
12,5 107,82 ± 9,34
ML2
100 92,21 ± 1,63
50 93,10 ± 3,48
25 97,35 ± 0,89
12,5 96,04 ± 2,45
ML3
100 95,72 ± 2,15
50 104,68 ± 0,74
25 101,75 ± 1,93
12,5 107,40 ± 2,22
Quercetin 100 92,97 ± 3,59
(Ghi chú ML1: morindone-5-methyl ether; ML2:morindone-6-methyl ether;
ML3:soranjidiol.).
Qua bảng 3.6 cho thấy, t lệ tế bào sống sót ở các giếng bổ sung các hợp chất
morindone-5-methyl ether, morindone-6-methyl ether, soranjidiol tách chiết từ thân
rễ cây Nhó đông ở nồng độ 12,5; 25; 50; 100 µg/mlđạt trên 91%. Như vậy cả 3 hợp
chất được tách chiết từ thân rễ cây Nhó đông đều chưa thể hiện hoạt tính gây độc
trên tế bào HepG2 ở các nồng độ nghiên cứu.
b. Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 dưới tác động gây độc của CCl4 của các hợp chất
được tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ cây Nhó đông
Các hợp chất phân lập từ thân rễ cây Nhó đông được tiếp tục được khảo sát
hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 bị gây độc bởi CCl4. Kết quả khảo sát được trình bày
qua hình 3.9.
69
Hình 3.9. Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây racủa
các hợp chất ML1: morindone-5-methyl ether; ML2: morindone-6-methyl ether;
ML3: soranjidiol được tách chiết từ phân đoạn ML-B thân rễ cây Nhó đông
T lệ phần trăm tế bào HepG2 sống sót ở các giếng có bổ sung hợp chất
morindone-5-methyl ether, morindone-6-methyl ether, soradidiol ở các mức nồng
độ khác nhau đạt giá trị từ 38,14 ± 2,12 đến 46,33 ± 1,49 tăng cao hơn so với nhóm
đối chứng (37,36 ± 1,32%), tuy nhiên mức tăng không đáng kể.
3.3.3. Hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ gan của các hợp chất được tách chiết
từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột
3.3.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C
lá cây Chùm ruột
a. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C
lá cây Chùm ruột bằng phương pháp DPPH
Kết quả hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình loại bỏ gốc tự do DPPH của
11 hợp chất được phân lập từ phân đoạn EtOAc của lá cây Chùm ruột được trình
bày qua hình 3.10.
37.36
93.75
41.4 40.69
46.33
41.75
39.02 39.99
41.13
44.57
38.14
40.16
45.71
38.68
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
t
ế
b
à
o
H
ep
G
2
s
ố
n
g
s
ó
t
Hợp chất ở các nồng độ khác nhau và đối chứng
70
Hình 3.10. Giá trị IC50 trong thử nghiệm DPPH của các hợp chất PA1:
kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-
L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-
rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-
glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9:
kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside
(Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutinphân lập từ phân đoạn
chiết PA-C lá cây Chùm ruột
Thông qua biểu đồ kết quả thử hoạt tính loại bỏ gốc tự do (Hình 3.12) cho thấy 11
hợp chất trên được chia thành 2 nhóm: nhóm thứ nhất là nhóm có hoạt tính chống oxy hóa
thông qua hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH từ cao xuống thấp lần lượt là rutin (PA11),
myricitrin (PA7), quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin) (PA3), isoquercitrin
(PA10), kaempferol (PA1), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside (PA6) với giá trị IC50 lần lượt là 7.37; 9,37; 10,61; 12,41; 15,34 và
79,32 µg/ml, trong đó các hợp chất như myricitrin (PA7), quercetin-3-O-α-L-
rhamnopyranoside (quercitrin) (PA3), isoquercitrin (PA10) đều có hoạt tính chống oxy hóa
15.43
>100
10.61
>100 >100
79.32
9.37
>100 >100
12.41
7.37
13.23
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Hợp chất
IC50
(µg/ml)
71
thông qua hoạt động loại bỏ gốc tự do cao hơn so với chất chuẩn ascorbic acid (IC50 =
13,23 µg/ml). Nhóm thứ hai là nhóm không thể hiện hoạt tính chống oxy hóa thông qua
hoạt động loại bỏ gốc tự do, nhóm này bao gồm các hợp chất như kaempferol 3-O- β-D-
glucopyranoside (PA2), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (PA4), kaempferol-3-
O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside (PA5), kaempferol-3-
O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester (PA8),
kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside (PA9) với giá trị
IC50 lớn hơn 100 µg/ml.
b. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-C
lá cây Chùm ruột thông qua thử nghiệm MDA
11 hợp chất được phân lập từ phân đoạn PA-C tiếp tục được khảo sát hoạt
tính chống oxy hóa thông qua hoạt động ức chế quá trình peroxy hóa lipid. Kết quả
nghiên cứu được thể hiện qua hình 3.11.
Hình 3.11. Giá trị IC50 trong thử nghiệm MDA của các hợp chất PA1:
kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3: quercetin-3-O-α-
L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-
rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-
glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-
13.36
>100
5.69
54.55
>100 >100
1.67
>100 >100
8.33 10.21
12.1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Hợp chất
IC50
(µg/ml)
72
rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9:
kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside
(Drabanemoroside); PA10: isoquercitrin; PA11: rutinphân lập từ phân đoạn
chiết PA-C của lá cây Chùm ruột
Hoạt tính chống oxy hóa thông qua hoạt động ức chế quá trình peroxy hóa
lipid của 11 hợp chất được tách chiết từ lá cây chùm ruột được chia làm 2 nhóm.
Nhóm thứ nhất, nhóm có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid được sắp xếp
theo thứ tự từ cao xuống thấp gồm: myricitrin (PA7), quercitrin (PA3), isoquercitrin
(PA10), rutin (PA11), kaempferol (PA1), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside
(PA4) với giá trị IC50 lần lượt là 1,67; 5,69; 8,33; 10,21; 13,36; 54,55 µg/ml. Nhóm
thứ hai là nhóm các hợp chất không thể hiện hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa
lipd với giá trị IC50 lớn hơn 100 bao gồm các hợp chất: kaempferol 3-O- β-D-
glucopyranoside (PA2), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-
glucuronopyranoside (PA5), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside (PA6), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
glucuronopyranosyl methyl ester (PA8), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-
(12)-α-L-arabinopyranoside (PA9).
Như vậy trên cả 2 mô hình nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa bằng phương
pháp DDPH và MDA, 5 hợp chất gồm kaempferol (PA 1), quercetin-3-O-α-L-
rhamnopyranoside (Quercitrin) (PA3), myricitrin (PA 7), isoquercitrin (PA10),
rutin (PA11) đều thể hiện hoạt chống oxy hóa cao. Ngoài ra, hợp chất kaempferol-
3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside (PA6) thể hiện hoạt tính
loại bỏ gốc tự do DPPH và hợp chất kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (PA4)
thể hiện hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid tuy nhiên hoạt tính chống oxy
hóa của hai chất này còn thấp. Các chất còn lại gồm kaempferol 3-O- β-D-
glucopyranoside (PA2), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-
glucuronopyranoside (PA5), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
glucuronopyranosyl methyl ester (PA8), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-
73
(12)-α-L-arabinopyranoside (PA9) đều không thể hiện hoạt tính chống oxy
hóa trên cả 2 mô hình nghiên cứu. Các chất này tiếp tục được khảo sát hoạt tính
bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động gây độc của CCl4.
3.3.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 và tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 dưới tác
động gây độc của CCl4 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây
Chùm ruột
a. Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất được tách chiết từ phân đoạn
PA-C lá cây Chùm ruột
Hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất phân lập từ phân đoạn PA-
C lá cây Chùm ruột được trình bày qua bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát hoạt tính gây độc tế bào HepG2 của các hợp chất
được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột
Mẫu
Nồng độ
(µg/ml)
% tế bào sống
sót
Nồng độ
(µg/ml)
% tế bào sống sót
PA1
100 92,53 ± 1,63 25 99,76 ± 3,56
50 98,34 ± 2,15 12,5 104,63 ± 2,45
PA2
100 101,96 ± 8,89 25 106,88 ± 1,48
50 101,43 ± 0,44 12,5 99,91 ± 3,63
PA3
100 98,50 ± 2,07 25 96,51 ± 1,93
50 97,03 ± 4,74 12,5 102,90 ±4,45
PA4
100 90,64± 1,33 25 96,61 ± 1,48
50 92,84 ± 1,78 12,5 100,91 ± 7,26
PA5
100 91,48 ± 5,48 25 94,46 ± 2,00
50 95,46 ± 2,22 12,5 103,74 ± 4,45
PA6
100 98,92 ± 4,47 25 105,99 ± 2,89
50 102,64 ± 7,78 12,5 106,93 ± 4,82
PA7
100 99,93 ± 1,11 25 101,69 ± 3,19
50 108,09 ± 3,36 12,5 103,89 ± 0,96
PA8
100 100,44 ± 6,30 25 95,88 ± 3,56
50 99,55 ± 1,93 12,5 97,24 ± 4,45
PA9
100 92,32 ± 4,00 25 95,14 ± 3,56
50 96,66 ± 0,52 12,5 98,29 ± 0,44
PA10
100 100,17 ± 7,11 25 100,38 ± 3,85
50 99,28 ± 3,19 12,5 98,29 ± 0,44
PA11
100 98,55 ± 0,67 25 99,13 ± 0,59
50 99,8 ± 3,63 12,5 102,11 ± 0,96
Quercetin 100 92,97 ± 3,59
(Ghi chú PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3:
74
quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-
rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-
glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-
(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9: kaempferol 3-O-α-L-
rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside (Drabanemoroside); PA10:
isoquercitrin; PA11: rutin)
Qua bảng 3.7 cho thấy, t lệ tế bào sống sót ở các giếng bổ sung các hợp chất như
kaempferol (PA1), kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside, quercetin-3-O-α-L-
rhamnopyranoside (Quercitrin) (PA3), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (PA4),
kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucuronopyranoside (PA5),
kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-galactopyranoside (PA6),
myricitrin (PA7), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
glucuronopyranosyl methyl ester (PA8), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-
(12)-α-L-arabinopyranoside (Drabanemoroside) (PA9), isoquercitrin (PA10), rutin
(PA11) tách chiết từ lá cây Chùm ruột ở nồng độ 12,5; 25; 50; 100 µg/mlđạt giá trên
90%.. Như vậy cả 11 hợp chất được tách chiết từ lá cây Chùm ruột đều chưa thể hiện
hoạt tính gây độc trên tế bào HepG2 ở các nồng độ nghiên cứu.
b. Tác dụng bảo vệ tế bào HepG2 dưới tác động gây độc của CCl4 của các hợp chất
được tách chiết từ phân đoạn PA-C lá cây Chùm ruột
Trong số 11 hợp chất được tách chiết từ lá Chùm ruột có 9 hợp chất biểu
hiện hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tác động gây độc của CCl4 (Hình
3.12). Trong đó, các hợp chất quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (quercitrin)
(PA3), kaempferol-3-O-α-L-rhamnopyranoside (PA4), kaempferol 3-O-α-L-
rhamnopyranosyl-(12)-α-L-arabinopyranoside (PA9) biểu hiện hoạt tính bảo vệ tế
bào Hep2G ở nồng độ 100µg/ml, tuy nhiên t lệ tế bào Hep2G sống sót tăng không
đáng kể lần lượt là 44,36 ± 0,66%; 51,76 ± 1,87%; 46,38 ± 0,69%; so với đối chứng
là 37,36%.
Sáu hợp chất khác gồm kaempferol-3-O-(2-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-
75
glucuronopyranoside (PA5), kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside (PA6), myricitrin (PA7), kaempferol-3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester (PA8),
isoquercitrin (PA10) và rutin (PA11) biểu hiện hoạt tính bảo vệ tế bào HepG2 ở
nồng độ 50 và 100µg/ml. T lệ tế bào Hep2G sống sót dưới tác động bảo vệ của
các chất này đạt từ 42% trở lên cao hơn so với đối chứng (37,36%.). Đáng chú ý
là ở nồng độ 100µg/ml hợp chất myricitrin có khả năng bảo vệ tế bào HepG2
cao, t lệ tế bào HepG2 sống sót đạt 96,53 ± 1,45%.
37.36
93.75
37.38
30.47
35.03 36.55
37.12
36.86
36.07
35.81
35.03
38.81
38.06
44.36
37.12
34.36
38.95
51.76
34.28
34.53
43.6
46.51
31.01
40.26
46.79
48.36
0
20
40
60
80
100
120
%
t
ế
b
à
o
H
ep
G
2
s
ố
n
g
só
t
Hợp chất ở các nồng độ khác nhau và đối chứng
76
Hình 3.12. Hoạt động bảo vệ tế bào HepG2 chống lại tổn thương do CCl4 gây ra của
các hợp chất PA1: kaempferol; PA2: kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside; PA3:
quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranoside (Quercitrin); PA4: Kaempferol-3-O-α-L-
rhamnopyranoside; PA5: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-
glucuronopyranoside; PA6: kaempferol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-
galactopyranoside; PA7: myricitrin; PA8: kaempferol-3-O-[α-L-
rhamnopyranosyl-(12)]-β-D-glucuronopyranosyl methyl ester; PA9:
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- nghien_cuu_hoat_tinh_bao_ve_gan_cua_ba_loai_thuc_vat_dua_dai.pdf