Luận án Nghiên cứu phát hiện các biến thể ở một số bệnh nhân tự kỷ Việt Nam bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa (Exome) - Nguyễn Thu Hiền

CASK (Hình 3.6). Gen CASK có mối tương quan mạnh với gen ATP2B2, gen SHANK2 tương quan với gen LARGE và OLFM1. Trong biểu hiện hành vi, có 3 gen được xác định trong hệ thống là ADCY1, ATP2B2, EFNB3. Mức độ tương tác giữa gen CASK và ATP2B3 đã được phân tích trong ở bệnh nhân T01. Sự tương tác còn lại đáng chú ý là gen SHANK2 tương quan với gen LARGE và OLFM1. Theo đánh giá của hệ thống, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen SHANK2 và OLFM1 là 0,53. Chỉ số này được tính toán dựa trên 68,2% mức độ đồng biểu hiện, 17,6% phân tích microRNA mục tiêu, 11,6% sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền, hóa học và 2%, sự liên kết các yếu tố phiên mã giữa 2 gen. Trong khi đó, chỉ số tin cậy của mối tương tác giữa gen SHANK2 và LARGE là 0,58. Các thông tin đóng góp để tính toán được chỉ số này bao gồm 69,3% sự động biểu hiện, 11,8% sự liên kết các yếu tố phiên mã, 10,5% sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền, hóa học và 8,4% phân tích microRNA mục tiêu giữa 2 gen. 3.3.3.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02 Sau khi loại bỏ các biến thể được đánh giá là an toàn, không gây bệnh và các biến thể nằm trong ngân hàng db142SNP, số lượng các biến thể nằm trên các gen mới ở bệnh nhân T02 là 16 biến thể. Các biến thể này nằm trên 15 gen: RP1L1, MYOM3, PDIA5, ADCY2, DST, PKD2L1, CTBP2, MYO1E, MYH13, SDK2, MUC16, INPP5J, EYS, ATP2B3, GPRASP1 (bảng 3.9). Trong 15 gen này, gen MUC16 chứa 2 biến thể p.Ala2224Ser, p.Trp13569Cys. Gen MUC16 là một thành viên của họ muci glycoprotein và còn có tên gọi khác như: CA-125, gen này mã hóa cho protein MUC16 hay còn gọi là mucin. Gen MUC16 nằm trên nhiễm sắc thể số 19, ở vị trí 19.1 (19P13.2), bao gồm 83 exon, dài 132499 bp và nằm từ nucleotide 8848844 đến nucleotide 8981342 trên nhiễm sắc thể số 19. 59 Bảng 3.9. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T02 STT Tên gen NST HGVS.c HGVS.p 1 ADCY2 chr5 c.1726A>G p.Ile576Val 2 ATP2B3 chrX c.3538A>C p.Asn1180His 3 CTBP2 chr10 c.2868C>A p.Asn956Lys 4 DST chr6 c.12913G>C p.Glu4305Gln 5 EYS chr6 c.5504C>T p.Ser1835Leu 6 GPRASP1 chrX c.688A>C p.Asn230His 7 INPP5J chr22 c.853C>T p.Pro285Ser 8 MUC16 chr19 c.6670G>T p.Ala2224Ser 9 MUC16 chr19 c.40707G>C p.Trp13569Cys 10 MYH13 chr17 c.5485G>A p.Glu1829Lys 11 MYO1E chr15 c.861C>A p.Asn287Lys 12 MYOM3 chr1 c.631G>A p.Gly211Arg 13 PDIA5 chr3 c.539C>G p.Pro180Arg 14 PKD2L1 chr10 c.302T>C p.Leu101Pro 15 RP1L1 chr8 c.4744C>G p.Arg1582Gly 16 SDK2 chr17 c.5504G>A p.Arg1835Gln HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN) HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ Protein) Protein MUC16 biểu hiện trên đường niêm mạc ruột và hạch bạch huyết thường nằm gần lớp niêm mạc. Các cytokine kích hoạt quá trình gây viêm như 60 TNF-α dẫn đến giảm biểu hiện của gen bài tiết như MUC16, trong khi đó MUC16 lại có vai trò bảo vệ lớp niêm mạc của tế bào chống lại các tác nhân gây viêm ruột. Chính vì thế, các biến thể trên MUC16 có thể ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện của bệnh tự kỷ kèm với bệnh rối loạn tiêu hóa. Những bất thường về tiêu hóa không những có thể ảnh hưởng đến các đặc tính thần kinh và hành vi của người mắc ASD, mà còn ảnh hưởng đến những quá trình khác như rối loạn miễn dịch, tăng serotonin huyết và rối loạn chuyển hóa (Rossignol et al, 2012; Frye et al, 2014). Các nghiên cứu gần đây cho thấy, các triệu chứng về bệnh dạ dày, đường ruột ở trẻ bị mắc ASD có lỷ lệ cao hơn so với nhóm trẻ chỉ mắc ASD từ 20-70% (Molloy et al, 2003; Valicenti-McDermott et al, 2006; Ibrahim et al, 2009; Nikolov et al, 2009; Gorrindo et al, 2012). Hsiao và cộng sự đã chứng minh mối liên hệ mật thiết giữa triệu chứng rối loạn tiêu hóa và các triệu chứng của bệnh tự kỷ. Bất thường đường tiêu hóa, chẳng hạn như tăng khả năng thẩm thấu đường ruột, thay đổi thành phần của hệ vi sinh đường ruột, rối loạn chức năng tiêu hóa và rối loạn bài tiết, đều được tìm thấy trong các cá nhân ASD. Thực tế cho thấy, những biểu hiện đó đều có thể ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện các triệu chứng khác của bệnh tự kỷ. Ngoài ra, tăng tính thấm của ruột có thể dẫn đến sự rò rỉ các chất chuyển hóa có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc được điều chế qua đường ruột và vào máu, điều này có thể làm giảm mức độ chuyển hóa của vi khuẩn và sự thay đổi trong tiết niệu và huyết thanh ở các cá nhân tự kỷ. Hơn nữa, các vấn đề tiêu hóa có thể dẫn đến rối loạn miễn dịch. Theo nghiên cứu của Mizejewski và cộng sự năm 2015, gen MUC16 liên quan đến khả năng miễn dịch và các vấn đề tiêu hóa, đặc biệt gen này nằm trong 15 chỉ thị phân tử, thuộc nhóm thứ 3 dùng để đánh giá bệnh tự kỷ (Mizejewski et al, 2013). Chính vì thế, các biến thể trên gen MUC16 được lựa chọn để tiến hành giải trình tự Sanger kiểm chứng. Kết quả kiểm chứng cho thấy, hai biến thể p.Ala2224Ser và p.Trp13569Cys đều là hai biến thể mới phát sinh ở bệnh nhân 02, không phải là những biến thể di truyền từ bố mẹ (Hình 3.7, Hình 3.8). 61 Gen MUC16 . Hình 3.7. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Ala2224Ser trên gen MUC16 ở bệnh nhân T02 Hình 3.8. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Trp13569Cys trên gen MUC16 ở bệnh nhân T02 62 3.3.4. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T03 3.3.4.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T03 Sau khi chọn lọc bằng các phần mềm chuyên dụng, 16 biến thể nằm trên 14 gen liên quan đến ASD được tìm thấy ở bệnh nhân T03. Các gen này gồm có: NTNG1, ZEB2, MBD5, FOXP1, KLHL3, HOXA1, ST7, DPP6, DLGAP2, GRIN2B, TRPM1, SOX5, UBE3A, RBFOX1, CACNA1C (Bảng 3.10) Bảng 3.10. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T03 STT Gen Vị trí trên DNA NST Thay đổi cDN Dạng biến thể 1 CACNA1C 2.721.137 chr12 c.3846C>T Dị hợp tử 2 DLGAP2 1.651.465 chr8 c.*1905_*1906delAA Dị hợp tử 3 DPP6 154.592.882 chr7 c.1300-183C>T Dị hợp tử 5 FOXP1 71.004.983 chr3 c.*3403_*3414dupTG TGTGTGTGTG Dị hợp tử 6 GRIN2B 13.768.499 chr12 c.1428T>C Dị hợp tử 7 HOXA1 27.134.983 chr7 c.549C>A Dị hợp tử 8 KLHL3 136.954.578 chr5 c.*3207_*3208delAA Đồng hợp tử 9 KLHL3 136.954.583 chr5 c.*3201_*3203dupTTT Đồng hợp tử 10 NTNG1 108.024.677 Chr1 c.*2338_*2338delAAA AAAAAAAAAA Dị hợp tử 11 RBFOX1 7.743.418 chr16 c.1059-15639_1059- 15638delTT Dị hợp tử 12 ST7 116.778.443 chr7 c.866-45delT Dị hợp tử 13 TRPM1 31.362.352 chr15 c.212G>A Đồng hợp tử 14 UBE3A 25.583.489 chr15 c.*771_*794dupCTTA GTATATGAAAGGAC AGGGAT Dị hợp tử 15 ZEB2 145.275.181 chr2 c.-69-198_-69- 196delCAA Dị hợp tử 16 ZEB2 145.275.184 chr2 c.-69-199_-69- 198insGT Dị hợp tử 63 Hình 3.9. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T03 Kết quả phân tích mối tương quan của các gen trong các biểu hiện bệnh, cho thấy, đối với bệnh nhân T03, chỉ có gen DDP6 tham gia và mối tương quan với các gen liên quan đến 3 biểu hiện trong nghiên cứu này (Hình 3.9). Cụ thể, gen DPP6 có mối tương tác rất mạnh với gen NTRK3 thể hiện ở đường tương tác màu cam đậm. NTRK3 là một thụ thể màng, tham gia vào con đường MAPK. NTRK3 đã được chứng minh có liên quan tới di truyền bệnh tự kỷ, hội chứng Asperge (Chakrabarti et al., 2009). Các nghiên cứu cho thấy, cho thấy biểu hiện của các sản phẩm gen NTRK3 khác nhau có liên quan tạm thời với sự hình thành khớp thần kinh (Valenzuela et al., 1993; Menn et al., 2000). Ngoài ra, các đột biến hiếm gặp trên 64 NTRK3 đã được tìm thấy có liên quan di truyền với rối loạn ám ảnh cưỡng chế (Muios-Gimeno et al., 2009). Mức độ tương tác của gen DPP6 và NTRK3 đã được dự đoán trong mối tương tác của các gen ở bệnh nhân T01, với chỉ số tin cậy 0,65. 3.3.4.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03 Bệnh nhân T03 có 8 biến thể trên 8 gen mới FLNC, ADAMTS9, NIN, ASB16, MUC16, TMPRSS15, KDELR3, ALPI (Bảng 3.11). Trong đó, cũng có 1 biến thể trên gen MUC16, vì thế, biến thể này được kiểm chứng bằng phương giải trình tự Sanger. Tương tự như trường hợp biến thể trên MUC16 ở bệnh nhân T02, biến thể c.39687T>A, p.Asp13229Glu cũng được lựa chọn để kiểm chứng lại bằng phương pháp Sanger. Kết quả kiểm chứng cho thấy, đây cũng là một biến thể mới phát sinh ở bệnh nhân mà không phải do di truyền từ bố mẹ (Hình 3.10). Bảng 3.11. Thống kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T03 STT Tên gen NST HGVS.c HGVS.p 1 ADAMTS9 chr3 c.5431G>A p.Asp1811Asn 2 ALPI chr2 c.1453G>C p.Ala485Pro 3 ASB16 chr17 c.871G>A p.Ala291Thr 4 FLNC chr7 c.5548T>G p.Leu1850Val 5 KDELR3 chr22 c.35A>G p.His12Arg 6 MUC16 chr19 c.39687T>A p.Asp13229Glu 7 NIN chr14 c.4048G>C p.Ala1350Pro 8 TMPRSS15 chr21 c.3019G>T p.Val1007Phe HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ DNA) HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ Protein) 65 Hình 3.10. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Asp13229Glu trên gen MUC16 ở bệnh nhân T03 3.3.5. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T06 3.3.5.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T06 Sau các bước chọn lọc, kết quả thu được ở bệnh nhân T06 bao gồm 17 biến thể trên 15 gen đã biết liên quan đến ASD: ANKRD11, AUTS2, CASK, DOCK4, DPP6, KATNAL2, KLHL3, NIPBL, RBFOX1, RELN, SHANK2, SOX5, TCF4, TSC1, TSC2 (Bảng 3.12). Kết quả phân tích các gen ở bệnh nhân T06 cho thấy, bệnh nhân này có 5 gen quan trọng, tham gia vào mối tương tác với các gen liên quan đến các biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội. Đó là TSC1, TSC2, NIPBL, SHANK2, DPP6 (Hình 3.11). Trong đó gen TSC1, TSC2 nằm trong danh sách gen của hệ thống, chứng tỏ sự quan trọng của gen này liên quan đến biểu hiện giao tiếp. Theo tính toán của hệ thống, chỉ số tin cậy của mức độ tương tác giữa 2 gen TSC1, TSC2 là 0,62. Chỉ số này được tính toán dựa trên 77,2 % sự tương tác, 14% mức độ đồng biểu hiện. 5,3% sự liên kết các yếu tố phiên mã, và 3% sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền và hóa học giữa 2 gen. Gen NIPBL liên kết với nhiều gen, đáng chú ý như gen ZMYM2, PUM2, PNISRM, CRP350. Chỉ số độ tin cậy về mức độ tương tác giữa gen NIPBL với các gen trên lần lượt là 0,72; 0,74, 0,73 và 66 0,68. Đối với gen SHANK2, trong mối tương quan này, SHANK2 tương tác mạnh với gen PLCB1 với chỉ số độ tin cậy là 0,56. Bảng 3.12. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T06 STT Gen Vị trí trên DNA NST Thay đổi cDN Dạng biến thể 1 ANKRD11 89.353.340 chr16 c.745-748_745- 747delAA Dị hợp tử 2 AUTS2 70.257.473 chr7 c.*1511delA Dị hợp tử 3 CASK 41.377.023 chrX c.*2626_*2649delGCT GCTGCTGCTGCTGC TGCTGCT Đồng hợp tử 4 DOCK4 111.512.198 chr7 c.1927-53_1927- 52insA Dị hợp tử 5 DPP6 154.685.161 chr7 c.*971_*972insA Đồng hợp tử 6 KATNAL2 44.601.085 chr18 c.793-563G>A Dị hợp tử 7 KLHL3 136.997.803 chr5 c.637-84_637- 83insCTTT Đồng hợp tử 8 NIPBL 37.020.541 chr5 c.5011-20T>C Dị hợp tử 9 RBFOX1 7.760.099 chr16 c.1135-526G>C Dị hợp tử 10 RELN 103.183.415 chr7 c.6524-91delA Dị hợp tử 11 RELN 103.183.417 chr7 c.6524-93delC Dị hợp tử 12 SHANK2 70.346.760 chr11 c.2093-62G>T Dị hợp tử 14 TCF4 53.131.202 chr18 c.513+95_513+104del TCTCACACAC Dị hợp tử 15 TCF4 53.131.202 chr18 c.513+96_513+103del CTCACACA Dị hợp tử 16 TSC1 135.770.428 chr9 c.*1194G>A Dị hợp tử 17 TSC2 2.138.001 chr16 c.5069-48_5069- 47insGCAGGAAAG Dị hợp tử 67 Hình 3. 11. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T06 3.3.5.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T06 Bệnh nhân T06 có 19 biến thể trên 17 gen: BRF1, ABCA13, ATP2B3, CCNL2, CIT, CLTCL1, CTBP2, DISP1, FNDC7, MUC16, MUC5B, RSL1D1, RYR3, SGSM3, TTYH1 và WDFY4 (Bảng 3.13). Đối với bệnh nhân T06, có 2 gen mang 2 biến thể dị hợp là RYR3 và MUC16. Ngoài gen MUC16 như đã phân tích ở bệnh nhân T02 và T03, gen RYR3 cũng là một gen tiềm năng liên quan đến bệnh tự kỷ. Chính vì thế, đột biến trên 2 gen này được kiểm chứng lại bằng phương pháp Sanger. 68 Bảng 3.13. Thống kê biến thể của bệnh nhân T06 STT Tên gen NST nh hưởng HGVS.c HGVS.p 1 ABCA13 chr7 missense_variant c.9728A>G p.Gln3243Arg 2 ATP2B3 chrX missense_variant c.250A>T p.Ile84Phe 3 BRF1 chr14 missense_variant c.176C>T p.Ser59Phe 4 CCNL2 chr1 missense_variant c.83C>T p.Ala28Val 5 CIT chr12 missense_variant c.507C>G p.His169Gln 6 CLTCL1 chr22 missense_variant c.1123G>C p.Gly375Arg 7 CTBP2 chr10 missense_variant c.2868C>A p.Asn956Lys 8 DISP1 chr1 missense_variant c.3629A>G p.Tyr1210Cys 9 FNDC7 chr1 missense_variant c.1901T>G p.Val634Gly 10 MUC16 chr19 missense_variant c.39511C>T p.Leu13171Phe 11 MUC16 chr19 missense_variant c.38605G>A p.Glu12869Lys 12 MUC5B chr11 missense_variant c.3445G>A p.Asp1149Asn 13 RSL1D1 chr16 missense_variant c.17C>G p.Ser6Trp 14 RYR3 chr15 missense_variant c.332T>C p.Leu111Pro 15 RYR3 chr15 missense_variant c.9142C>T p.Arg3048Cys 17 SGSM3 chr22 missense_variant c.1658C>T p.Thr553Met 18 TTYH1 chr19 missense_variant c.1301C>G p.Pro434Arg 19 WDFY4 chr10 missense_variant c.6482C>T p.Pro2161Leu HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN) HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ Protein) 69 Hình 3.12. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Leu13171Phe trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06 Hình 3.13. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Glu12869Lys trên gen MUC16 ở bệnh nhân T06 70 Kết quả kiểm chứng biến thể trên gen MUC16 cho thấy, 2 biến thể trên gen này ở bệnh nhân T06 cũng là những biến thể mới, không phải di truyền từ bố hoặc mẹ (Hình 3.12, Hình 3.13). Gen RYR3 Như đã trình bày ở phần tổng quan tài liệu, các nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng trong một số trường hợp tự kỷ có thể là do sự bất thường nội cân bằng Ca 2+ trong quá trình phát triển thần kinh (Krey et al, 2007). Mà RYR3 đã được chứng minh có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015). Bên cạnh đó, RYR3 còn nằm trên nhiễm sắc thể 15q14-q15 khu vực nhạy cảm với bệnh tự kỷ (Sorrentino et al, 1993). Chính vì thế, biến thể trên gen RYR3 được xem như ứng cử viên gây bệnh tự kỷ và hai biến thể trên gen này ở bệnh nhân T06 được lựa chọn để kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger (Hình 3.14) cho thấy bệnh nhân mang hai biến thể thay thế dạng dị hợp. Bệnh nhân thừa hưởng biến thể p.L111P từ bố và biến thể p.R3048C từ mẹ. Biến thể đầu tiên (p.L111P) xảy ra trong exon 4, trong đó T được thay thế bằng C ở vị trí 332 trong cDNA, dẫn đến việc thay thế Leu (L) bởi Pro (P) tại vị trí 111 trên protein RYR3 (Hình 3.15). Biến thể thứ hai (p.R3048C) đã được quan sát thấy trên exon 65, trong đó C đã được thay thế bởi T ở vị trí 9142, dẫn đến sự thay đổi của một amino acid ở vị trí 3048, nơi Arg (R) được thay thế bởi Cys (C) trên protein RYR3 (Hình 3.15). 71 Hình 3.14. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Leu111Pro và p.Arg3048Cys trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06 Hình 3.15. Mô h nh mô phỏng cấu trúc 3D của biến thể p.L111P và p.R3048C trên gen RYR3 ở bệnh nhân T06 Cha và mẹ của bệnh nhân là những người không có triệu chứng liên quan đến bệnh tự kỷ nhưng có mang biến thể thay thế c.332 T>C, p.L111P và c. 94.132 C>T, p.R3048C trong khi hai biến thể được tìm thấy ở người con bị chẩn đoán mắc chứng 72 tự kỷ, điều đó cho thấy rằng các biến thể thay thế trong gen RYR3 có thể liên quan với chứng tự kỷ. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả giải trình tự exome bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới. Ngoài ra, biến thể p.L111P còn nằm trên vùng domain MIR1 của protein RYR3. MIR1 nằm tại vị trí amino acid 100 đến 150. Domain MIR được biết đến là vùng chức năng quan trọng của RYRs (Lajtha et al. 2009) (Hình 3.16). Hình 3.16. Vị trí 5 domain đầu tiên của protein RYR3 (p.L111P nằm ở domain đầu tiên) Ion Ca 2+ được giải phóng từ lưới nội chất thông qua các kênh RYR3 và sau đó điều chỉnh hoạt động của các kênh này. Ngoài ra, so sánh các trình tự protein được mã hóa bởi gen RYR3 của con người với gà, khỉ đột, chuột, cá heo, ngựa, gấu trúc, bò và mèo cho thấy rằng các amino acid trong hai đột biến không thay đổi trong các loài khác nhau. Hai điểm biến thể xảy ra trong các amino acid bảo thủ (Hình 3.17). Từ đó cho thấy vai trò quan trọng của hai amino acid trên các chức năng của protein RYR3. Những đột biến xảy ra trong gen này có thể ảnh hưởng đến các chức năng vận chuyển của kênh Ca2+. Do đó, gen RYR3 có thể được coi là một ứng cử viên về nguyên nhân di truyền trong bệnh tự kỷ. Qua phân tích và so sánh, những đột biến này có thể dẫn đến những thay đổi trong liên kết protein-protein trong con đường truyền tín hiệu của kênh Ca2+. Nghiên cứu này cung cấp kiến thức bổ sung cho các đột biến gen liên quan đến bệnh tự kỷ và có thể góp phần vào việc phát hiện và điều trị rối loạn phát triển thần kinh này. 73 Hình 3.17. Tr nh tự amino acid của RYR3 ở các loài khác nhau 3.3.6. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T07 3.3.6.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T07 Bệnh nhân T07 mang 17 biến thể trên 16 gen liên quan đến ASD đã được biết: ATRX, AUTS2, DLGAP2,FOXP1, KDM5C, KIRREL3, MED12, PTEN, SHANK2, SMG6, KCNJ10, SOX5, SPAST, ST7, VPS13B, CACNA1H (Bảng 3.14). 74 Bảng 3.14. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T07 ST T Gen Vị trí trên DNA NST Thay đổi cDN Dạng biến thể 1 ATRX 76.776.795 chrX c.7071+85delT Dị hợp tử 2 ATRX 76.776.797 chrX c.7071+84T>A Dị hợp tử 3 AUTS2 70.257.473 chr7 c.*1511delA Dị hợp tử 4 CACNA1H 1.252.369 chr16 c.1919C>T Dị hợp tử 5 DLGAP2 1.651.465 chr8 c.*1905_*1906delAA Dị hợp tử 6 DLGAP2 1.651.465 chr8 c.*1906dupA Dị hợp tử 7 FOXP1 71.004.981 chr3 c.*3416_*3417insTGTGTGTGTG Dị hợp tử 8 KCNJ10 160.012.40 6 chr1 c.*3053C>G Dị hợp tử 9 KDM5C 53.254.396 chrX c.-326dupG Đồng hợp tử 11 KIRREL3 126.864.92 6 chr11 c.55+5425T>C Dị hợp tử 12 MED12 70.352.617 chrX c.4416-78_4416- 77insCTCTTCTCTT Đồng hợp tử 13 SHANK2 70.507.605 chr11 c.1744+90_1744+95delGTGTGT Dị hợp tử 14 SMG6 2.139.995 chr17 c.2724-74_2724- 65delTGTGTGTGTG Đồng hợp tử 15 SPAST 32.366.959 chr2 c.1494-13delT Dị hợp tử 16 ST7 116.607.17 2 chr7 c.151+13428_151+13429delTT Đồng hợp tử 17 VPS13B 100.847.72 5 chr8 c.9818-42_9818-41insT Dị hợp tử 16 gen này được đưa vào hệ thống phân tích dữ liệu của trường Đại học Princeton để phân tích mối tương quan giữa các gen. Kết quả phân tích cho thấy, ở cả 3 biểu hiện hành vi, giao tiếp, tương tác xã hội, có 4 gen trong số 16 gen này tham gia đó là ATRX, SPAST, KDM5C, SHANK2. Ngoài ra, gen ATRXN1, PCLB1 75 những gen có vai trò rất quan trọng, thể hiện kích thước và màu xanh của vòng tròn đại diện (Hình 3.18). Hình 3.18. Sự tƣơng tác của các gen ở bệnh nhân T07 Một số mối tương tác gen đáng chú ý trong các biểu hiện này là gen ATRX tương tác mạnh với gen ZMYM2, MFR, PHF3, PPP1R12A chỉ số độ tin cậy lần lượt là 0,58, 0,56, 0,55, 0,58. Chỉ sộ độ tin cậy của mức độ tương tác giữa gen SPAST và PPP1R12A là 0,55. trong khi chỉ số này của sự tương tác giữa gen ATN1 và KDM5C là 0,61. 3.3.6.2. Biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07 Bệnh nhân T07 có 10 gen mới mang biến thể, tổng số biến thể ở mới là 11 biến thể (Bảng 3.15) . Trong 10 gen HECW2, RYR2, PLCH2, SPEN, ADAMTS9, RBM47, IQCE, MUC5B, MUC16, UMODL1, tương tự như bệnh nhân T06, hai gen RYR2 và MUC16 được lựa chọn để tiến hành giải trình tự bằng phương pháp Sanger kiểm chứng lại biến thể (Hình 3.19). 76 Bảng 3.15. Thông kê biến thể trên các gen mới ở bệnh nhân T07 STT Tên gen NST HGVS.c HGVS.p 1 ADAMTS9 chr3 c.5431G>A p.Asp1811Asn 2 HECW2 chr2 c.1013T>C p.Ile338Thr 3 IQCE chr7 c.741G>C p.Glu247Asp 4 MUC16 chr19 c.39499G>C p.Val13167Met 5 MUC5B chr11 c.3445G>A p.Asp1149Asn 6 PLCH2 chr1 c.1108G>A p.Val370Met 7 RBM47 chr4 c.814G>A p.Gly272Ser 8 RYR2 chr1 c.2401C>T p.Arg801Cys 9 RYR2 chr1 c.2456A>G p.Tyr819Cys 10 SPEN chr1 c.7978G>A p.Val2660Ile 11 UMODL1 chr21 c.3481C>G p.His1161Asp HGVS.c: Variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ ADN) HGVS.p: Nếu variant là mã hóa, thì mô tả các variant sử dụng ký hiệu HGVS (cấp độ Protein). Gen MUC16 Hình 3.19. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Val13167Met trên gen MUC16 ở bệnh nhân T07 77 Gen RYR2 Hình 3.20. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Arg801Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07 Hình 3.21. Kết quả giải tr nh tự bằng phƣơng pháp Sanger phát hiện biến thể p.Tyr819Cys trên gen RYR2 ở bệnh nhân T07 78 Tương tự như gen RYR3, gen RYR2 có vai trò trong giải phóng ion Ca2+ của kênh canxi cũng như đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết Ca2+ nội bào trong tế bào thần kinh (Fill and Copello 2002; Lu et al, 2012; Schmunk et al, 2015). Hai biến thể trên gen này ở bệnh nhân T07 được lựa chọn để kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự Sanger. Kết quả giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho thấy, bệnh nhân T07 mang một biến thể dị hợp tại vị trí c.2401 C>T, gây biến đổi trên protein tại vị trí 801, amino acid Arg bị biến đổi thành Cys. Biến thể này được di truyền từ người mẹ không mang bệnh. Biến thể xảy ra làm xuất hiện một liên kết Hydro giữa amino acid Cys801 và Leu803. Đột biến thứ 2 là tại vị trúc.2456A thành G, gây biến đổi amino acid Tyr thành Cys trên protein tại vị trí 819. Đây là một biến thể mới phát sinh, không di truyền từ bố hoặc mẹ. Hình 3.22. Mô h nh mô phỏng cấu trúc biến thể p.Arg801Cys và p.Tyr819Cys ở bệnh nhân T07 Mô hình mô phỏng cấu trúc 3D (Hình 3.22) của biến thể cho thấy, khi đột biến xảy ra, làm mất một liên kết Hydro giữa amino acid Pro816 và Cys819. Tuy liên kết Hydro là những liên kết yếu, những những sự thay đổi này đều ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng của protein. Có thể thấy, sự kết hợp của 2 biến thể dị hợp này có thể là nguyên nhân gây biểu hiện bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T07. Đột biến p.Arg801Cys nằm trên vùng chức năng SPRY (từ amino acid 670 đến 808) của 79 protein RYR2. Tuy nhiên, chức năng của vùng này vẫn còn đang chưa được khám phá. Khi so sánh trình tự protein RYR2 ở một số loài như người, lợn, cá ngựa, gà, tinh tinh, chuột, bò, ngựa, gấu trúc cho thấy, hai điểm xảy ra biến thể đều nằm ở vùng bảo thủ của các loài (Hình 3.23). Điều này chứng tỏ vị trí quan trọng của điểm xảy ra biến thể. Hình 3.23. Tr nh tự amino acid của RYR2 ở các loài khác nhau 3.3.7. Biến thể di truyền ở bệnh nhân T08 3.3.7.1. Biến thể di truyền trên các gen liên quan đến ASD ở bệnh nhân T08 Kết quả chọn lọc cho thấy, ở bệnh nhân T08 có 15 biến thể, các biến thể này nằm trên 14 gen liên quan dến ASD: CASK, DLGAP2, DOCK4, FOXP1, GABRB3, RBFOX1, RELN, SCN1A, SHANK2, SHANK3, SOX5, CACNA1D, CACNA1F, KCNMA1 (Bảng 3.16). Sau khi đưa dữ liệu các gen này vào hệ thống phân tích mối tương quan, kết quả cho thấy sự quan trọng của 2 gen SHANK 2 và CACNA1F khi tham gia vào cả 3 biểu hiện (Hình 3.24). Gen SHANK2 có mối tương tác với gen PLCB1, EFNB2 với chỉ số độ tin cậy của mức độ tương tác lần lượt là 0,56 và 0,55. PLCB1, EFNB2 cũng là những gen quan trọng trong hệ thống, biểu hiện ở hình tròn đại hiện màu xanh. Gen CACNA1F liên quan đến gen ACRV1, chỉ số độ tin cậy cho mối tương tác này là 0,63. Chỉ số này được tính toán dựa trên 95,5 % mức độ đồng biểu hiện, 80 2,9 % sự nhiễu loạn trong mức độ di truyền và hóa học và 1% liên kết các yếu tố phiên mã giữa 2 gen. Bảng 3.16. Các biến thể trên các gen có liên quan đến bệnh tự kỷ ở bệnh nhân T08 TT Gen Vị trí trên DNA NST Thay đổi cDN Dạng biến thể 1 CACNA1D 53,846,077 chr3 c.*644A>G Dị hợp tử 2 CACNA1F 49,084,492 chrX c.1118+6G>A Dị hợp tử 3 DLGAP2 1626419 chr8 c.2088C>T Dị hợp tử 4 DOCK4 111585015 chr7 c.784-97_784- 90delGTCCATCT Dị hợp tử 5 FOXP1 71004981 chr3 c.*3416_*3417insTGTG TGTG Dị hợp tử 6 GABRB3 27017979 chr15 c.80+51G>T Dị hợp tử 7 KCNMA1 78,645,453 chr10 c.*1571C>T Dị hợp tử 8 RBFOX1 7647479 chr16 c.682+46C>A Dị hợp tử 9 RELN 103183415 chr7 c.6524-91delA Dị hợp tử 10 RELN 103183417 chr7 c.6524-93delC Dị hợp tử 11 RELN 103230032 chr7 c.4145+11C>A Dị hợp tử 12 SCN1A 166913130 chr2 c.386-122C>T Dị hợp tử 14 SHANK2 70315741 chr11 c.*3233T>C Dị hợp tử 15 SHANK3 51113801 chr22 c.267+122_267+123ins TG