Luận án Nghiên cứu thành phần, phân bố các loài nưa (amorphophallus spp.) củ có glucomannan và chọn loài có triển vọng phát triển trồng ở một số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam

quản khô trong điều kiện chum, vại tới tỷ lệ nảy mầm của hạt. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.13. 76 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của phương pháp bảo quản hạt tới tỷ lệ nảy mầm của hạt Nưa konjac Công thức Số lƣợng hạt thí nghiệm Số hạt nảy mầm TB Tỷ lệ (%) nảy mầm BQ1: Bảo quản lạnh ở 50C 50 33,33 66,67 BQ2: Bảo quản khô bằng chum, vại 50 17 34 CV (%) 5,1 LSD0,05 2,92 Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy, có sự khác biệt rõ về tỷ lệ nảy mầm hạt Nưa konjac của hai phương pháp bảo quản lạnh ở 50C (BQ1) và bảo quản khô bằng chum, vại. Cụ thể, với số hạt nảy mầm ở phương pháp bảo quản lạnh cho số hạt nảy mầm là 33,33 hạt đạt tỷ lệ 66,67 %, bên cạnh đó với phương pháp bảo quản khô bằng chum, vại (BQ2) tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 34 % với 17 hạt nảy mầm. Từ số liệu này có thể thấy với phương pháp bảo quản lạnh ở 50C cho hiệu quả tốt hơn với phương pháp bảo quản hạt Nưa konjac trong điều kiện chum vại. Nguyên nhân có thể là do nguồn gốc cây Nưa konjac sống ở các vùng có khí hậu nhiệt đới, qua mùa đông lạnh nên hạt bảo quản trong điều kiện chum vại dễ bị tổn thương do độ ẩm không khí thấp hoặc nhiệt độ quá lạnh gây ảnh hưởng tới sự phát triển của phôi hạt. 3.3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản hạt tới tỷ lệ nảy mầm của hạt Với mỗi loài, thời gian bảo quản hạt giống sẽ khác nhau. Thông thường thời gian bảo quản càng dài thì chất lượng hạt giống càng kém và tỷ lệ nảy mầm của hạt cũng kém, do trong quá trình bảo quản phôi vẫn sống, phát triển và nó dần sử dụng dinh dưỡng trong hạt, cũng như thải ra các chất độc. Đối với mỗi loại hạt thời gian bảo quản hạt là khác nhau, trong thí nghiệm này nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản 3 tháng, 6 tháng và 9 tháng. Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.14. 77 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản hạt tới tỷ lệ nảy mầm của hạt Nưa konjac Công thức Số lƣợng hạt thí nghiệm Số hạt nảy mầm Tỷ lệ (%) nảy mầm TGQ1: Thời gian bảo quản 3 tháng 60 43,67 72,78 TGQ2: Thời gian bảo quản 6 tháng 60 41 68,33 TGQ3: Thời gian bảo quản 9 tháng 60 27 45 C (V%) 6,9 LSD0,05 2,9 Từ bảng 3.14 cho thấy, có sự khác biệt rõ về tỷ lệ nảy mầm với các khoảng thời gian bảo quản khác nhau, điều này chứng tỏ thời gian bảo quản hạt Nưa konjac ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm của hạt loài cây này. Trong bảng ta thấy, thời gian bảo quản 3 tháng (TGQ1) cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất 72,78 %; thời gian bảo quản 6 tháng (TGQ2) tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm xuống còn 68,33%; sau 9 tháng (TGQ3) bảo quản tỷ lệ nảy mầm của hạt giảm rất nhanh chỉ còn 45%. Như vậy thời gian bảo quản càng dài, chất lượng hạt Nưa sẽ càng kém và đặc biệt là sau 6 tháng bảo quản. 3.3.1.4. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt giống tới tỷ lệ nảy mầm của hạt và sinh trưởng phát triển của cây con trong vườn ươm Hạt Nưa konjac khó nảy mầm trong điều kiên tự nhiên, vì vậy các biện pháp xử lý hạt có thể giúp hạt Nưa konjac dễ nảy mầm hơn, rút ngắn thời gian trong vườn ươm dẫn đến rút ngắn thời vụ và tăng hiệu quả nhân giống bằng hạt. Hạt sau khi thu hái, phơi khô và tiến hành thí nghiệm với các phương pháp khác nhau. Bảng 3.15 sẽ cho thấy sự ảnh hưởng của các biện pháp xử lý hạt đến tỷ lệ nảy mầm, tỷ lệ cây sống và sinh trưởng của cây con trong vườn ươm. 78 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt Nưa konjac tới tỷ lệ nảy mầm của hạt và sinh trưởng phát triển của cây con trong vườn ươm Công thức Số lƣợng hạt thí nghiệm Số hạt nảy mầm TB Tỷ lệ (%) nảy mầm Số cây sống Tỷ lệ (%) cây sống Chiều cao TB sau 60 ngày (cm) XLH1 60 16 26,67 14 87,5 8,13 XLH2 60 37 61,67 33 89,18 10,26 XLH3 60 41 68,33 38 92,68 10,37 XLH4 60 33 55 30 90,90 10,3 XLH5 60 25 41,67 22 88 10,15 CV (%) 7,6 7,1 6,7 LSD0,05 4,2 5,9 3,35 Từ kết quả thu được cho thấy, với các phương pháp xử lý hạt giống khác nhau, có sự ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm, số cây sống và sinh trưởng của cây con. Cụ thể với biện pháp xử lý hạt giống ở công thức XLH3 cho kết quả tốt nhất với điều kiện ngâm hạt trong nước ấm 40-50°C trong 6 giờ, ủ rửa chua rồi đem gieo cho kết quả với số hạt nảy mầm là 41 hạt, chiếm 68,33% số hạt đem gieo; số cây sống là 38 cây chiếm tỷ lệ 92,68% và chiều cao cây là 10,37cm. Ở công thức XLH1 không tiến hành xử lý hạt cho số hạt nảy mầm là 16 hạt, chiếm tỷ lệ 26,67%; số cây sống là 14 và chiều cao cây sau 60 ngày gieo là 8,13cm. Ở các công thức còn lại kết quả lần lượt là XLH2 (tỷ lệ hạt nảy mầm là 61,67%; số cây sống là 33 cây; chiều cao cây 10,26cm) XLH4 (tỷ lệ hạt nảy mầm là 55%; số cây sống là 30 cây;chiều cao cây 10,3cm); công thức XLH5 (tỷ lệ hạt nảy mầm là 41,67%; số cây sống là 22 cây; chiều cao cây 10,15cm). Như vậy phương pháp không xử lý cho kết quả kém nhất, các biện pháp tăng thời gian xử lý hạt lên 9 giờ, giảm thời gian xử lý hạt xuống 3 giờ hoặc không xử lý hạt chỉ ủ rồi gieo vào cát đều cho kết quả kém hơn so với việc ngâm hạt trong nước ấm 40-50°C trong 6 giờ, ủ và rửa chua sau đó gieo hạt vào trong cát khi cây có chiều cao khoảng 5- 10 cm chuyển vào bầu đất cho tỷ lệ nảy mầm, số cây sống và sinh trưởng của cây trong vườn ươm là tốt nhất. 79 A9: Quả Nưa konjac B9: Hạt Nưa konjac nảy mầm C9: Cây ra bầu trong vườn ươm Hình 3.19. Hình ảnh nhân giống hữu tính cây Nưa konjac 3.3.2. Nhân giống loài Nưa konjac bằng củ 3.3.2.1. Ảnh hưởng phương pháp xử lý vết cắt củ tới tỷ lệ nảy chồi của củ con Củ Nưa con khi thu hoạch được cắt từ củ cái, sau đó đem bảo quản để tới vụ gieo được mang đi trồng. Trong quá trình bảo quản, việc giữ bột Nưa không bị nhiễm bệnh hay bị khô là rất quan trọng, ảnh hưởng lớn tới chất lượng củ giống khi trồng. Vì vậy, việc xử lý vết cắt củ, để tránh củ bị nhiễm bệnh trong quá trình bảo quản quyết định rất lớn tới hiệu quả của việc nhân giống bằng củ con. Trong thí nghiệm trình bày các phương pháp xử lý củ giống khác nhau, kết quả được trình bày trong bảng 3.16. 80 Bảng 3.16. Ảnh hưởng phương pháp xử lý vết cắt củ tới tỷ lệ nảy chồi của củ con Công thức Số lƣợng củ thí nghiệm Số củ nảy chồi TB Tỷ lệ (%) nảy chồi Số củ bị nhiễm bệnh TB Tỷ lệ (%) củ bị bệnh Số cây sống TB Tỷ lệ (%) cây sống XVC1 50 19,33 38,67 30,33 60,67 13,33 26,67 XVC2 50 38,67 77,33 17,67 35,33 29,33 58,67 XVC3 50 29,33 58,67 8,67 17,33 27,67 55,33 XVC4 50 46,67 93,33 8,67 17,33 43,67 87,33 CV (%) 12,2 8,5 9,6 LSD0,05 9,47 2,76 3,75 Từ kết quả thu được, cho thấy có sự ảnh hưởng rất rõ của phương pháp xử lý vết cắt củ tới tỷ lệ nảy chồi và số cây sống của củ con khi gieo trồng. Với việc không xử lý vết cắt củ (XVC1), để vết cắt tự khô thì cho tỷ lệ nảy chồi thấp (38,67%), tỷ lệ củ bị nhiễm rất cao (30,33%) và tỷ lệ cây sống thấp (26,67%) so với việc sử dụng vôi bột, tro bếp hoặc xi măng xử lý vết cắt củ. Phương pháp xử lý vết cắt củ bằng tro bếp (XVC2) cho hiệu quả cao hơn so với việc không xử lý vết cắt củ, phương pháp này cho tỷ lệ nảy chồi (77,33%), tỷ lệ củ bị nhiễm (35,33%) và tỷ lệ cây sống (58,67%). Phương pháp xử lý vết cắt củ bằng vôi bột (XVC3) cho tỷ lệ nảy chồi (58,67%), tỷ lệ củ bị nhiễm thấp (17,33%) và tỷ lệ cây sống (55,33%). Phương pháp xử lý vết cắt củ bằng xi măng (XVC4) cho tỷ lệ nảy chồi (93,33%), tỷ lệ củ bị nhiễm (17,33%) và tỷ lệ cây sống (87,33%). Như vậy, việc xử lý vết cắt củ bằng xi măng cho hiệu quả xử lý tốt nhất (XVC4), cây có tỷ lệ nảy chổi cao, số cây bị nhiễm bệnh thấp và tỷ lệ cây sống cao hơn so với các phương pháp xử lý bằng tro bếp, bằng vôi bột và không xử lý để vết cắt tự khô. Do cây Nưa konjac củ có hàm lượng glucomannan cao nên nếu vết cắt củ không được xử lý củ rất dễ bị nhiễm khuẩn gây thối củ và ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy chồi và tỷ lệ sống của củ con. Đối với phương pháp xử lý bằng tro bếp cho kết quả cao hơn với việc không xử lý, nhưng thấp hơn so với việc sử dụng vôi bột và xin măng, vì tro bếp có tính diệt khuẩn nhưng khả năng làm khô nhanh vết cắt, bao kín vết cắt thấp hơn so với vôi bột và xi măng nên tỷ lệ nảy chồi cao nhưng số củ bị 81 nhiễm lớn dẫn đến tỷ lệ cây sống thấp. Đối với phương pháp xử lý vết cắt củ bằng vôi bột, số củ bị nhiễm bệnh thấp như đối với xử lý củ bằng xi măng, nhưng phươn pháp này tỷ lệ nảy chồi và tỷ lệ củ sống lại thấp hơn xử lý bằng xi măng, do xử lý bằng vôi củ dễ bị khô và gây chết củ. 3.3.2.2. Ảnh hưởng phương pháp bảo quản củ giống tới tỷ lệ nảy chồi, tỷ lệ nhiễm bệnh, tỷ lệ sống Củ giống cây Nưa konjac khi bị nhiễm bệnh thường sẽ chết trong quá trình trồng và lây nhiễm sang các cây khác trên ruộng. Vì vậy việc bảo quản củ giống trước khi đem trồng là rất quan trọng đối với công tác chuẩn bị giống trồng loài Nưa này. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp bảo quản tới tỷ lệ nảy chồi, tỷ lệ nhiễm bệnh, tỷ lệ sống của cây được thể hiện trong bảng 3.17. Bảng 3.17. Ảnh hưởng phương pháp bảo quản củ giống tới tỷ lệ nảy chồi, tỷ lệ nhiễm bệnh, tỷ lệ sống của cây Nưa konjac Công thức Số lƣợng củ thí nghiệm Số củ nảy chồi TB Tỷ lệ (%) nảy chồi Số củ bị nhiễm bệnh TB Tỷ lệ (%) củ bị bệnh Số cây sống TB Tỷ lệ (%) cây sống PBQ1 50 21,33 42,67 30,67 61,33 20,67 41,33 PBQ2 50 47,33 94,67 2,33 4,67 47,00 94,00 PBQ3 50 43,67 87,33 7,33 14,67 40,67 81,33 PBQ4 50 46,67 93,33 4,00 8,00 47,00 94,00 PBQ5 50 44,33 88,67 8,33 16,67 42,67 85,33 CV (%) 10,2 12,8 6,7 LSD0,05 3,71 2,53 2,79 Trong các phương pháp bảo quản, phương pháp bảo quản PBQ2 là bảo quản lạnh ở điều kiện 100C cho tỷ lệ củ nảy chồi cao nhất (94,67%); số củ bị nhiễm bệnh thấp nhất (2,33%) và tỷ lệ cây sống cao nhất (94%).Công thức PQ4 là vùi trong cát sạch, cho hiệu quả bảo quản giống tốt thứ 2 với tỷ lệ củ nảy chồi là 93,33%, tỷ lệ củ nhiễm bệnh 8 %, tỷ lệ cây sống 94%. Công thức PBQ1 với việc không bảo quản để ở nền đất trong nhà cho chất lượng củ giống thấp nhất với tỷ lệ củ bị nhiễm bệnh cao nhất (61,33%), số củ nảy chồi thấp nhất (21,33%) và tỷ lệ cây sống thấp nhất (41,33%). 82 Công thức PBQ3 và PBQ5 với việc bảo quản củ trên các giàn bảo quản và vùi trong đất sạch cho kết quả bảo quản cao hơn so với việc để dưới đất ở công thức PBQ1 và thấp hơn so với phương pháp bảo quản lạnh công thức PBQ2 và vùi trong cát công thức PBQ4. Kết quả lần lượt là công thức PBQ3 tỷ lệ củ nảy chồi là 87,33%, tỷ lệ củ nhiễm bệnh 14,67 %, tỷ lệ cây sống 81,33%; công thức PBQ5 tỷ lệ củ nảy chồi là 88,67%, tỷ lệ củ nhiễm bệnh 16,67 %, tỷ lệ cây sống 85,33%. Như vậy, có thể thấy trong các phương pháp bảo quản, phương pháp bảo quản trong kho lạnh cho chất lượng củ giống tốt nhất, sau đó đến việc bảo quản bằng cách vùi trong cát sạch, đất sạch và làm giàn để bảo quản củ. A10: Dải thân củ cây Nưa konjac B10: Củ con cây Nưa konjac C10: Kiểm tra khối lượng và kích thước củ con cây Nưa konjac 83 D10: Trồng cây Nưa konjac củ được bảo quản trong cát Hình 3.20. Hình ảnh nhân giống Nưa konjac bằng củ 3.3.3. Nghiên cứu nhân giống cây Nưa konjac bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào 3.3.3.1. Ảnh hưởng hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro Trong quy trình kỹ thuật nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, tỷ lệ mẫu sạch có khả năng tái sinh chồi có ý nghĩa rất quan trọng đối với các bước tiếp theo. Vì vậy, cần phải tìm ra công thức khử trùng tối ưu để nâng cao hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro và khả năng nảy mầm của mẫu sạch. Tuỳ thuộc vào loại chất khử trùng, nồng độ và thời gian khử trùng khác nhau mà hiệu quả tạo mẫu sạch in vitro thu được khác nhau.Trong thí nghiệm này sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng với thời gian 4, 6 và 8 phút và NaClO (javel) 60% trong 6, 12 và 18 phút. Kết quả thí nghiệm với 6 công thức KT1, KT2, KT3, KT4, KT5, KT6 được trình bày ở bảng 3.18. 84 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro Công thức Hóa chất Thời gian (phút) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Mẫu sạch Mẫu sạch tái sinh Thời gian mẫu nảy chồi (ngày) Số mẫu sạch (mẫu) Tỷ lệ (%) mẫu sạch Số mẫu sạch nảy chồi Tỷ lệ (%) mẫu sạch nảy chồi KT1 HgCl2 0,1% 4 30 26 86,67 21,33 c 71,11 16 KT2 6 30 27,33 91,11 13,67 d 45,56 21 KT3 8 30 30 100 3,67 e 12,22 25 KT4 Javen 60% (NaClO) 6 30 22,67 75,56 21,67 c 72,22 15 KT5 12 30 30 100 30 a 100 15 KT6 18 30 30 100 25 b 83,33 19 ( a,b,c...) : những chữ cái khác nhau được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa α = 0,05 trong Ducan's test Kết quả bảng 3.18 cho thấy, khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% (công thức KT1, KT2, KT3) cho tỷ lệ mẫu sạch cao (86,67-100%) nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại thấp. Khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu nảy chồi giảm xuống rất thấp (chỉ đạt 12,22% ở công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 8 phút) và thời gian phôi củ nảy mầm cũng chậm hơn. Ở công thức khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút (KT1), tỷ lệ mẫu sạch đạt 86,67%, tỷ lệ mẫu nảy chồi đạt cao nhất (71,11%) và thời gian tái sinh chồi thấp (16 ngày). Khi khử trùng mẫu với hoá chất Javen 60% ( công thức KT4, KT5, KT6) đem lại kết quả tốt hơn, cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh cao. Với thời gian khử trùng 12 phút (KT5), tỷ lệ mẫu sạch và tái sinh đạt cao nhất (100%), sau 15 ngày nuôi cấy mẫu nảy chồi. Với thời gian khử trùng là 6 và 18 phút cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp hơn chỉ đạt 72,22 và 83,33%. Từ kết quả trên cho thấy, khử trùng bằng Javen 60% cho kết quả tốt hơn so với HgCl2 0,1%, nguyên nhân là do HgCl2 là chất khử trùng mạnh có độc tính cao đối với tế bào nên khi tăng thời gian khử trùng thì tỷ lệ mẫu sạch tăng nhưng tỷ lệ mẫu tái sinh lại giảm và thời gian hạt nảy mầm cũng chậm hơn. 85 Vậy công thức khử trùng tốt nhất cho phôi hạt là sử dụng Javen 60% trong thời gian 12 phút (KT5) cho tỷ lệ mẫu sạch và tỷ lệ mẫu tái sinh đều đạt 100%, sau 15 ngày mẫu nuôi cấy nảy chồi. A11: Mẫu khử trùng bằng Javen 60% trong 12 phút B11: Mẫu khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 4 phút Hình 3.21. Đỉnh sinh trưởng Nưa konjac nảy chồi trên môi trường MS 3.3.3.2. Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi in vitro Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng được xem là nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống. Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy. Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy là việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất. Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi của cây in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng cơ bản khác nhau, gồm 5 công thức môi trường MT1, MT2, MT3, MT4, MT5 lần lượt là môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu (N6) (bảng 3.19) Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 2 tuần nuôi cấy và được thể hiện trong bảng 3.19 dưới đây. 86 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Công thức Môi trƣờng dinh dƣỡng Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi) Số mẫu tái sinh chồi Tỷ lệ (%) mẫu tái sinh chồi Số chồi Trung bình/mẫu MT1 1/2 MS 45 37,67 a 83,7 1,81 b MT2 MS 45 41,33 a 91,85 2,45 a MT3 WPM 45 39,33 a 87,41 1,82 b MT4 B5 45 30,33 b 67,41 1,58 b MT5 N6 45 25,67 c 57,04 1,34 b ( a,b,c...) : những chữ cái khác nhau được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa α = 0,05 trong Ducan's test Kết quả bảng 3.19 cho thấy, ở công thức môi trường MS (MT2) thì mẫu cấy có khả năng tái sinh tốt nhất (đạt 91,85%), số chồi trung bình/mẫu đạt 2,45 và chất lượng chồi tốt (chồi mập, khỏe mạnh, lá xanh đậm, phát triển nhanh). Trong các môi trường còn lại thì môi trường WPM (MT3) cho tỷ lệ mẫu tái sinh cao hơn cả (đạt 87,41%), số chồi trung bình là 1,82; còn môi trường B5 và N6 cho tỷ lệ mẫu tái sinh thấp, chất lượng chồi kém. Với môi trường 1/2 MS (MT1) cho số chồi trung bình/mẫu chỉ đạt 1,81; tỷ lệ tái sinh đạt 83,7% và chất lượng chồi ở mức trung bình (chồi yếu, lá xanh vàng, phiến lá hẹp, mỏng). Tóm lại, môi trường MS phù hợp nhất cho tái sinh chồi Nưa konjac trong điều kiện nuôi cấy in vitro. 3.3.3.3. Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro Sau khi xác định được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Nưa in vitro, cần xác định loại chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) và nồng độ của chất ĐHST phù hợp cho sự tái sinh chồi, nhằm xác định công thức môi trường nuôi cấy hiệu quả nhất cho tái sinh chồi Nưa in vitro. Chất điều hoà sinh trưởng thường được sử dụng trong giai đoạn này các chất thuộc nhóm Cytokinin để kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và tăng trưởng chồi in vitro. Các loại Cytokinin được sử dụng trong nuôi cấy mô – tế bào là BAP, Kinetin, TDZ, Zeatin,....Trong 87 quá trình nhân nhanh chồi có thể bổ sung Auxin nhưng với hàm lượng ít hoặc không đáng kể, còn hàm lượng Cytokinin lớn để kích thích tạo chồi. Thông qua tham khảo một số công trình nghiên cứu đã công bố, trong thí nghiệm này, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của BAP đến khả năng tái sinh chồi, sau đó sẽ tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp BAP với Kinetin để xác định công thức tốt nhất cho sự tái sinh chồi cây Nưa. Trong thí nghiệm này, sử dụng môi trường cơ bản MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP với 7 công thức thí nghiệm CT0, CT1, CT2, CT3, CT4, CT5, CT6 các nồng độ khác nhau: 0 mg/l; 0,5 mg/l; 1 mg/l; 1,5 mg/l; 2 mg/l; 2,5 mg/l và 3,0 mg/l. Kết quả thí nghiệm được thu thập sau 3 tuần nuôi cấy và được thể hiện ở bảng 3.20. Bảng 3.20. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Công thức BAP (mg/l) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu tái sinh chồi (mẫu) Tỷ lệ (%) mẫu tái sinh chồi Số chồi trung bình/mẫu (chồi) Chiều cao trung bình chồi (cm) CT0 0 45 24,67 e 54,81 1,23 e 1,51 d CT1 0,5 45 36,33 c 80,74 1,92 c 1,47 d CT2 1 45 40,33 b 89,63 1,66 d 1,72 c CT3 1,5 45 41,33 b 91,85 2,29 b 2,25 b CT4 2 45 45,00 a 100 2,75 a 2,96 a CT5 2,5 45 33,33 d 74,07 1,67 d 1,29 e CT6 3 45 32,33 d 71,85 1,27 e 1,18 e ( a,b,c...) : những chữ cái khác nhau được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa α = 0,05 trong Ducan's test Kết quả bảng 3.20 cho thấy, công thức môi trường CT4 cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất là 2 mg/l BAP (đạt 100%), tỷ lệ mẫu tái sinh chồi thấp nhất là công thức CT0 đối chứng (0 mg/l BAP), đạt 54,81%. Các công thức CT1, CT2, CT3, CT5 và CT6 đều cho tỷ lệ mẫu tái sinh đạt trên 74%. Từ kết quả thu được có thể khẳng định, BAP ở các nồng độ khác nhau có ảnh hưởng mạnh mẽ tới khả năng phát sinh chồi của mẫu cấy. Khi tăng hàm lượng BAP cao hơn 2 mg/l BAP ở các thí nghiệm sau thì số mẫu tái sinh chồi và chiều cao của chồi đều giảm, đồng thời thấy xuất hiện khối mô sẹo rất lớn. 88 Vậy công thức môi trường CT4 (MS + 30g/l Sucrose + 8g/l Agar + 2 mg/l BAP) là công thức môi trường tốt nhất để nhân nhanh chồi Nưa konjac trong số các công thức môi trường thí nghiệm và công thức môi trường này được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp giữa BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Nưa konjac. Hình 3.22. Hỉnh ảnh tái sinh chồi Nưa konjac in vitro 3.3.3.4. Ảnh hưởng nồng độ BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Nhằm xác định các loại chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ thích hợp cho tái sinh chồi Nưa konjac, trong môi trường nuôi cấy, ngoài bổ sung chất điều hòa sinh trưởng là BAP, đã nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP với Kinetin bằng cách sử dụng công thức môi trường có hàm lượng 2 mg/l BAP và bổ sung thêm Kinetin ở các nồng độ khác nhau (0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l và 1,0 mg/l). Kết quả thí nghiệm thu được sau 3 tuần nuôi được thể hiện ở bảng 3.21. 89 Bảng 3.21. Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi Nưa konjac in vitro Công thức BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu tái sinh chồi (mẫu) Tỷ lệ (%) mẫu tái sinh Số chồi trung bình/mẫu (chồi) Chiều cao trung bình chồi (cm) CT7 2 0,2 40 40,00 a 100 5,22 a 3,84 a CT8 0,4 40 36,67 b 91,67 3,35 b 3,36 b CT9 0,6 40 34,33 b 85,83 2,74 c 3,29 b CT10 0,8 40 30,33 c 75,83 2,63 c 3,20 b CT11 1 40 29,67 c 74,17 2,33 d 2,79 c ( a,b,c...) : những chữ cái khác nhau được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa α = 0,05 trong Ducan's test Kết quả bảng 3.21 cho thấy, sự khác nhau giữa ảnh hưởng tổ hợp của Kinetin và BAP đến khả năng tái sinh chồi so với ảnh hưởng riêng rẽ của BAP. Sau khi nuôi cấy 3 tuần, công thức CT7, với môi trường MS + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin cho tỷ lệ mẫu tái sinh chồi cao nhất (đạt 100%), số chồi trung bình/mẫu cấy là 5,22, chiều cao trung bình của chồi đạt 3,84 cm. Khi tăng hàm lượng Kinetin lên 1,0 mg/l ở CT11 cho tỷ lệ mẫu tái sinh, số chồi trung bình/mẫu và chiều cao trung bình của chồi thấp nhất. Các công thức môi trường khác như công thức CT8; CT9; CT10 thì tỉ lệ mẫu tái sinh chồi tương đối cao >75%, nhưng số chồi trung bình/mẫu và chiều cao chồi lại thấp và giảm dần khi hàm lượng Kinetin bổ sung vào môi trường tăng lên lần lượt là 0,4 mg/l; 0,6 mg/l; 0,8 mg/l. Công thức CT7 (2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin) cho số chồi trung bình gấp 1,90 lần và chiều cao chồi trung bình gấp 1,29 lần so với công thức CT4 (công thức tốt nhất khi sử dụng riêng rẽ BAP). Điều này chứng tỏ sự kết hợp giữa BAP và Kinetin sẽ cho hiệu quả tạo chồi tốt hơn và sự tương quan nồng độ giữa BAP và Kinetin có tác động lớn đến tỉ lệ tạo chồi của mẫu nuôi cấy. Khi hàm lượng Kinetin tăng lên thì tỉ lệ mẫu mẫu tái sinh chồi, số chồi trung bình và chiều cao chồi đều giảm, tạo ra khối mô sẹo nhiều hơn. 90 Từ kết quả trên, đã chọn ra công thức môi trường tốt nhất cho nhân nhanh chồi cây Nưa konjac in vitro là công thức CT7 (MS + 8g/l Agar + 30g/l Sucrose + 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin). Hình 3.23. Chồi Nưa konjac trên môi trường bổ sung 2 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin sau 2 tuần nuôi cấy 3.3.3.5. Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi in vitro Trong nhân giống in vitro môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng phát triển của cây, nó không chỉ ảnh hưởng tới khả năng nhân nhanh chồi mà nó còn ảnh hưởng mạnh mẽ đến khả năng ra rễ của chồi in vitro. Bởi nó là nguồn cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho mẫu tồn tại, sinh trưởng và phát triển trong suốt thời gian nuôi cấy. Nhằm xác định công thức môi trường dinh dưỡng để chồi Nưa konjac ra rễ đạt hiệu quả cao nhất, đã sử dụng 8 công thức môi trường khác nhau, gồm: môi trường MS và 1/2 MS (giảm 1/2 hàm lượng các chất khoáng đa lượng và vi lượng) + 8 g/l Agar + 0,5 mg/l IBA + 1 g/l than hoạt tính + đường sucrose với các hàm lượng khác nhau (12 g/l, 14 g/l, 16 g/l và 20 g/l). Số liệu được thu thập sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ ở bảng 3.22. 91 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi Nưa konjac in vitro Công thức Môi trƣờng Sucrose Tổng số mẫu cấy (mẫu) Số mẫu ra rễ (chồi) Tỷ lệ (%) mẫu ra rễ Thời gian bắt đầu ra rễ (ngày) Số rễ trung bình/chồi (rễ) Chiều dài trung bình rễ (cm) CR1 1/2 MS 12 45 37,33 cd 82,96 9 4,43 c 1,76 d CR2 14 45 45,00 a 100 7 4,98 a 2,67 a CR3 16 45 45,00 a 100 9 4,56 bc 2,09 c CR4 20 45 42,33 ab 94,07 9 4,10 d 2,13 c CR5 MS 12 45 35,33 d 78,52 14 3,88 d 1,78 d CR6 14 45 45,00 a 100 7 4,81 ab 2,22 bc CR7 16 45 45,00 a 100 9 4,57 bc 2,29 bc CR8 20 45 40,33 bc 89,63 9 4,44 c 2,10 c ( a,b,c...) : những chữ cái khác nhau được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa α = 0,05 trong Ducan's test Kết quả bảng 3.22 cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường ra rễ có bổ sung đầy đủ các chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và hàm lượng đường khác nhau cho kết quả chồi ra rễ với tỷ lệ rất khác nhau. Mẫu được nuôi cấy ở công thức 1/2 MS + 8 g/l Agar + 0,5 mg/l IBA + 14 g/l sucrose cho hiệu quả cao nhất (đạt 100%), số lượng rễ trung bình/chồi đạt 4,98, chiều dài trung bình của rễ đạt 2,67 cm và thời gian chồi bắt đầu ra rễ là 7 ngày, chất lượng rễ tốt (rễ mập, khỏe mạnh), khả năng đâm xuyên mạnh, ít hình thành mô sẹo. Mẫu cấy cũng trên công thức môi trường như trên nhưng khi thay đổi hàm lượng đường tăng/giảm khác nhau đều cho kết quả thấp hơn. Trong đó, công thức môi trường hàm lượng đường giảm xuống còn 12 g/l cho tỷ lệ chồi ra rễ và chiều dài trung bình rễ t