Luận án Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa hợp chất kháng acetylcholinesterase của một số loài trong họ Thạch Tùng

i MeOH - TFA 0,1 % thay đổi từ (25:75) đến (85:15) trong 90 phút và bước sóng phát hiện là 210 nm để thu được hợp chất 3 (8,5 mg) T8 Nâu 129 Có 1 vết tắt quang, (+) TT Dragendorff trong đó có 1 vết đậm Rf 0,11. Khảo sát cấu trúc của hợp chất 1 Phân đoạn T3 được thực hiện tái kết tinh nhiều lần với hỗn hợp methanol – aceton thu được chất 1 (26 mg) ở dạng tinh thể hình kim ngắn, không màu, điểm chảy 228 oC. Năng suất quay cực [α]/D -151 ± 3°, (0,5 %, methanol), trên SKLM cho vết phát quang dưới đèn UV 365 nm và tắt quang dưới đèn UV 254 nm và cho màu cam với TT Dragendorff. Phổ IR có các đỉnh hấp thu đặc trưng của nhóm chức lactam ở 3178,5; 1651 cm-1 và nhóm carbonyl ở 1612,1 và 1548,7 cm-1. Phổ UV của hợp chất 1 có 2 đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 312,00 nm và 230,50 nm (Tham khảo PL 7-8) Phổ HRMS cho mũi ion phân tử giả m/z 243,1528 [M+H]+ (Tính toán lý thuyết: [C15H18N2O + H]+ = 243,1504), tương ứng với công thức phân tử C15H18N2O (M = 242,1426) và độ bất bão hòa  = 8 (Tham khảo PL 9). 66 Phổ 1H-NMR Phổ 1H NMR cho các mũi cộng hưởng với sự hiện diện của 2 proton metin H-2 (6,42; 1H; d; 9,5 Hz) và H-3 (7,90; 1H; d; 9,5 Hz); sự hiện diện của proton nhóm metylen H-6a (2,89; dd; 17/6,5 Hz) và H-6b (2,75; dd; 17/1,5 Hz) ghép spin với proton metin H-7 (3,61; 1H; brs), sự hiện diện của các proton trên vòng mở: 3 proton metin H-7, H-8 (5,41; d; 4,5 Hz) và H-11 (5,48; q; 7,0 Hz), 1 proton metylen H-14 (2,12; d) và 2 proton metyl H-10 (1,68; d; 7,0 Hz); H-16 (1,55; s) và tín hiệu của 1 nhóm –NH (13,20; brs) (Tham khảo PL 10 - 12). Phổ 13C-NMR và Dept-NMR có các tín hiệu sau: 02 nhóm -CH3 (c 12,3 và 22,6 ppm), 02 nhóm -CH2- (c 35,2 và 49,2 ppm), 05 nhóm >CH- (c 117,0; 140,2; 32,9; 124.3; 111,2 ppm), 06 nhóm C bậc 4 (c 165,4; 122,7; 143,2; 142,6; 54,3; 134,1 ppm). Trong đó có các tín hiệu đặc trưng của bốn carbon olefin bậc ba [C 117,0 (C-2), C 140,2 (C-3), C 124,3 (C-8), C 111,2 (C-11)], bốn carbon olefin bậc bốn [C 122,7 (C-4), C 143,2 (C-5), C 142,6 (C-12), C 134,1 (C- 15)], một carbon carbonyl [C 165,4, C-1], hai carbon bậc một [C 12,3 (C-10), C 22,6 (C-16)], hai carbon bậc hai [C 35,2 (C-6), C 49,2 (C-14)], một carbon bậc ba [C 32,9 (C-7)] và một carbon bậc bốn [C 54,3 (C-13)], (Tham khảo PL 13 -14). Từ dữ liệu phổ IR và 13C-NMR với sự hiện diện của carbon carbonyl (C=O) ở vùng trường C 165,4 ppm [C-1] và hai carbon olefin bậc ba [C 117,0 (C-2), C 140,2 (C-3)], hai carbon olefin bậc bốn [C 122,7 (C-4), C 143,2 (C-5)] cho thấy sự phù hợp của vòng pyridon trong cấu trúc của hợp chất 1. Do đó, hợp chất 1 thuộc nhóm hợp chất có khung cấu trúc lycodin alcaloid. Bảng 3.8. Dữ liệu phổ 1H, 13C và DEPT của hợp chất 1 C DEPT Chất 1 (CDCl3, 500 MHz) δC ppm δH ppm (m, J, Hz) 1 C 165,1 2 CH 117,2 6,42 (d; J = 9,5) 3 CH 140,2 7,82 (d, J = 9,5) 4 C 122,7 5 C 142,9 6 CH2 35,3 H-6a:2,87 (dd, J = 14,5/5,0) H-6b: 2,71 (dd, J = 15,4/0,9) 7 CH 32,9 3,61 (brs) 8 CH 124,2 5,41 (d, J = 5,0) 9 10 CH3 12,3 1,64 (d, J = 6,8) 11 CH 111,2 5,44 (q, J = 6,8) 12 C 142,6 13 C 54,3 14 CH2 49,2 14a: 2,15 (d, J = 25,5) 14b: 1,10 (d, J = 26,5) 15 C 134,2 16 CH3 22,6 1,55 (s) 67 Phổ COSY cho các tín hiệu tương tác giữa H-2 (δH 6,42 ppm) tương tác với H- 3 (δH 7,89 ppm); H-6a (δH 2,87) tương tác với H-6b (δH 2,71); H-6a, H-6b tương tác với H-7 (δH 3,61); H-7 tương tác với H-8 (δH 5,41), với H-11 (δH 5,49), với H-10 (δH 1,68). Phổ HMBC cho thấy các tín hiệu tương tác proton và carbon như sau: H-2 tương tác với C-4; H-3 tương tác với C-1, C-5 và C-13; H-6a tương tác với C-4, C-5, C-7 và C-8, H-6b tương tác với C-4, C-5, C-7, C-8 và C-12; H-7 tương tác với C-5, C-6, C-8, C-11, C-12, C-13 và C-14; H-8 tương tác với C-7, C-12, C-13, C-14 và C-16; H-10 tương tác với C-11và C-12; H-11 tương tác với C-7, C-8, C-10 và C-13; H-14 tương tác với C-4, C-8, C-12, C-13 và C-15; H-16 tương tác với C-8, C14, và C-15 (Tham khảo PL 15-24). So sánh với tài liệu tham khảo [64] [79], tập hợp các dữ liệu của chất 1 trùng khớp với dữ liệu đã công bố của huperzin A. Hình 3.7. Công thức cấu tạo của huperzin A Khảo sát cấu trúc hợp chất 2 Phân đoạn T2 được thực hiện tái kết tinh nhiều lần với hỗn hợp methanol – aceton thu được hợp chất 2 (16,3 mg) dưới dạng bột vô định hình, màu trắng, điểm chảy 258 oC, trên SKLM cho vết phát quang dưới đèn UV 365 nm, vết tắt quang dưới đèn UV 254 nm và cho màu cam với TT Dragendorff. Phổ IR của chất 2 có các đỉnh hấp thu: 3397, 1685, 1630, 1452 cm-1, do đó chất 2 có dao động của các nhóm chức O-H, C=O, C-O, C-C. Phổ UV của hợp chất 2 có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 255 nm (Tham khảo PL 25). Phổ HRMS của hợp chất 2 cho mũi ion phân tử giả m/z 320,1868 [M+H]+ (Tính toán lý thuyết: [C18H25NO4 + H]+ = 320,1885), tương ứng với công thức phân tử C18H25NO4 (M = 319,1807) (Tham khảo PL 26). Phổ 1H, 13C và Dept cho biết hợp chất 2 có 1 nhóm metyl δC 22,9 (C-16), 2 nhóm N-CH2 δC 50,9 (C-1 và C-9), 6 nhóm methylen ở vùng trường cao δC 18,4 (C-2), 22,1 (C-3), 37,4 (C-6), 25,1 (C10), 30,3 (C-11), 32,7 (C-14), 1 nhóm oxymethin δC 79,7 (C- 8), 2 nhóm methin δC 45,0 (C-7) và 29,6 (C-15), cùng với 4 carbon bậc 4 δC 205,7 (C- 68 5), 173,1 (C-13), 169,8 (C-12), 142,7 (C-4). Hơn nữa, tín hiệu của 1 carbon δC 169,7 (C-17) và 1 nhóm metyl δC 20,9 (C-18) chỉ ra đây là tín hiệu của nhóm acetoxyl. Phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton metyl của nhóm acetoxyl tại δH 2,19 (3H, s, H-18), nhóm metyl thứ 2 có δH 1,08 (3H, d, J = 6,3 Hz, H-16) và 1 proton của nhóm oxymethin δH 5,06 (1H, brd, J = 5,0 Hz, H-8). So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với các tài liệu tham khảo [101] [102] cho thấy hợp chất 2 có thể chứa khung phlegmariurin B với vòng 5 carbon >C12=C4-C5(C=O)-C6-C7. (Tham khảo PL 27-32) N O R1R2 O CH 3 4 7 12 15 11 9 1 13 Hình 3.8. Công thức cấu tạo của một số hợp chất khung cấu trúc Phlegmariurin B Nguồn: Tan C. 2003” [105] Bảng 3.9. Dữ liệu phổ 1H, 13C và DEPT của hợp chất 2 C DEPT Hợp chất 2 (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) δC ppm δH ppm (m, J, Hz) 1 CH2 50,9 4,06 (dd, J = 13,6; 3,6); 2,90 (dt, J = 13,6; 3,0) 2 CH2 18,4 2,39 m; 1,41 m 3 CH2 22,1 2,53 m; 2,46 m 4 C 142,7 5 C 205,7 6 CH2 37,4 2,55 m; 2,03 (brd, J = 19,0) 7 CH 45,0 3,04 m 8 CH 79,7 5,06 (brd, J = 5,0) 9 CH2 50,9 3,96 (td, J = 15,0; 3,0); 3,23 (brd, J = 15,0) 10 CH2 25,1 2,78 m; 1,93 m 11 CH2 30,3 2,98 m; 2,78 m 12 C 169,8 13 C 173,1 14 CH2 32,7 1,59 (d, J = 15,5); 3,06 (dd, J = 8,5; 15,5) 15 CH 29,6 2,56 m 16 CH3 22,9 1,08 (d, J = 6,3) CH3CO (CH3) 169,8 CH3CO (CH3) 20,9 2,19 (3H, s) Việc biện luận cấu trúc hợp chất 2 được tiếp tục bằng cách khai thác các thông tin trên phổ COSY, HMBC, HSQC. Phân tích phổ 1H-1H COSY và HSQC cho thấy sự Phlegmariurin B: R1 = R2 =H 7α-hydroxyphlegmariurin B: R1 = OOH, R2 = H 11α-hydroxyphlegmariurin B: R1 = H, R2 = OOH 7α,11α -hydroxyphlegmariurin B: R1 = R2 = OOH 69 hiện diện của 3 chuỗi carbon H-1/H-2/H-3, H-6/H-7/H-8/H-15/H-14 và H-9/H-10/H- 11. Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác xa giữa proton của nhóm oxymethin (H-8) và carbon carbonyl δC 169,7 (C-17) cho thấy nhóm acetoxyl được gắn vào C-8. Tương tác giữa H-16 và H-7 chứng tỏ nhóm metyl ở C-15 theo hướng α, điều này tương tự như các phlegmariurin alcaloid trong họ Thạch tùng [102]. Mặt khác, định hướng β của nhóm acetoxyl ở C-8 được khẳng định từ tương tác trên phổ NOESY giữa Hα-7/H-16 và H-8. Từ các dữ liệu trên, hợp chất 2 được khẳng định là một dẫn xuất 8β-acetoxyl của phlegmariurin B lần đầu tiên phân lập được từ cây Râu rồng. Cấu trúc hóa học này được kiểm tra trên SciFinder ngày 15 - 2 - 2014 cho biết đây là hợp chất tự nhiên mới và được đề nghị đặt tên là lycosquarosin A. Công bố quốc tế của hợp chất mới đã được thực hiện trên tạp chí ISI lả Molecules 2014. Dữ liệu phổ được trình bày trong PL 33- 43). Hình 3.9. Công thức cấu tạo của hợp chất 2 (Lycosquarosin A) Hình 3.10. Các tương tác xa của hợp chất 2 (lycosquarosin A) Khảo sát cấu trúc hợp chất 3 Phân đoạn T7 có 4 vết tắt quang, (+) TT Dragendorff trong đó có vết đậm Rf 0,23; các vết tách rõ ràng. Cao T7 được tiếp tục thực hiện phương pháp sắc ký lỏng bán điều chế với cột YMC Pak ODS và tỉ lệ dung môi MeOH-TFA 0,1 % thay đổi từ (25:75) 70 đến (85:15) trong 90 phút, bước sóng phát hiện là 210 nm để thu được hợp chất 3 (8,5mg) hợp chất 3 kết tinh trong CH2Cl2 dạng chất rắn vô định hình không màu, cho màu cam bền với thuốc thử Dragendorff. Phổ UV có 3 đỉnh hấp thu 334, 288 và 242 nm. Phổ HRMS của hợp chất 3 cho mũi ion phân tử giả m/z 322,2051 [M+H]+ (Tính toán lý thuyết: [C18H27NO4 + H]+ = 322,2011), tương ứng với công thức phân tử C18H27NO4 (M = 321,1933) (Tham khảo PL 44). Phổ 1H, 13C và Dept cho biết chất 3 có 18 tín hiệu trong đó có 4 tín hiệu carbon bậc 4, 4 nhóm methin, 8 nhóm methylen và 2 nhóm methyl. Trong đó, 2 nhóm methylen (δC 54,9, δH 3,90 và 2,99), (δC 50,9, δH 3,58 và 3,27) tương ứng với C-1 và C-9 thuộc vòng nitơ. Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 cho thấy tín hiệu methyl của nhóm acetoxyl tại δH 2,14 (3H, s, H18), 1 nhóm methyl tại δH 1,02 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-16) có vị trí tương tự như hợp chất 2. Các tín hiệu trên phổ 13C-NMR được so sánh với chất 2 cho thấy hợp chất 3 phải là một pentacyclic. Phân tích các phổ NMR của hợp chất 3 cho thấy hợp chất 3 có cấu trúc tương tự hợp chất 2 nhưng ngoại trừ sự hiện diện của nhóm carbinolamin tại δC 94,5 (C-13), 1 nhóm carbon bậc 4 δC 47,5 (C-12) và 1 nhóm methin tại vị trí C-4 (δC 47,6, δH 2,4) thay vì là 3 carbon bậc 4 có vị trí tương tự như hợp chất 2 (Tham khảo PL 45-51). Bảng 3.10. Dữ liệu phổ 1H, 13C và DEPT của hợp chất 3 C DEPT Hợp chất 2 (CDCl3 & MeOD, 500 MHz) δC ppm δH ppm (m, J, Hz) 1 CH2 54,9 3,90 (ddd, J = 15,0; 8,5; 4,5); 2,95 m 2 CH2 18,9 1,90 brs; 1,85 m 3 CH2 23,7 2,20 m; 2,15 m 4 CH 47,6 2,20 m 5 C 214,8 6 CH2 40,1 2,43 (dd, J = 16,0; 8,5); 2,40 m 7 CH 26,6 2,38 m 8 CH 72,8 5,04 brs 9 CH2 50,8 3,56 (ddd, J = 14,0; 14,0; 3,7); 3,19 (dd, J = 14,0; 5,0) 10 CH2 21,2 1,91 m; 1,67 (d, J = 14,0) 11 CH2 34,1 1,50 (dd, J = 14,0; 4,5); 2,50 m 12 C 47,5 13 C 94,5 14 CH2 34,7 1,60 (dd, J = 13,4; 2,7); 2,45 m 15 CH 26,9 2,22 m 16 CH3 16,4 1,02 (d, J = 6,5) CH3CO (CH3) 170,4 CH3CO (CH3) 21,2 2,15 s Kết hợp phổ HSQC và phổ 1H-1H COSY cũng cho thấy rằng sự sắp xếp của 3 chuỗi carbon: (1) –CH2CH2CH2-CH- (C-1 – C-4), (2) –CH2CHCHCHCH2- (C-6 – C-8 71 – C-15 – C-14-) và (3) –CH2CH2CH2- (C-9 – C-11). Tương tác giữa H-8 và carbon C- 17 (δC 170,4) xác nhận vị trí của nhóm acetoxyl thuộc về C-8. Tương tác giữa proton của nhóm oxymethin δH 5,04 (1H, brs, H-8) và carbon δC 72,8 (C-8), trong khi hợp chất 2 là giữa δH (1H, brd, J = 5,0 Hz) với δC 80,8 chỉ ra rằng nhóm acetoxyl định hướng α, điều này cũng phù hợp với định hướng của các hợp chất phlegmariurin B (Tham khảo PL 52-59).. Để xác định cấu hình không gian của hợp chất 3, tiếp tục khai thác các dữ kiện trên phổ NOESY. Cụ thể là trên phổ NOESY các dữ liệu tiếp tục cho thấy nhóm acetoxyl định hướng α bằng các tương tác của hydro H-6β và H-15. Các tương tác giữa H-4 và H-7, H3-16 cho thấy các hydro này đều hướng α. Do đó, cấu hình không gian của hợp chất 3 đã được thiết lập, so sánh với các tài liệu tham khảo, cho phép kết luận hợp chất 3 là acetylaposerratinin [52] (Tham khảo PL 60). Hình 3.11. Công thức cấu tạo của acetylaposerratinin Khảo sát cấu trúc hợp chất 4 Phân đoạn T5 có 6 vết tắt quang, (+) TT Dragendorff trong đó có 1 vết đậm Rf 0,29. Cao T5 được tiếp tục thực hiện phương pháp sắc ký lỏng bán điều chế với cột YMC Pak ODS và tỉ lệ dung môi MeOH –TFA 0,1 % thay đổi từ (25:75) đến (85:15) trong 90 phút và bước sóng phát hiện là 210 nm để thu được hợp chất 4 (5,5 mg). Chất 4 phân lập được ở dạng tinh thể hình kim, không màu, điểm chảy 228 oC, dễ tan trong DCM, MeOH; ít tan trong aceton; năng suất quay cực [α]/D -153 ± 5°, (0,5 %, methanol), trên SKLM cho vết phát quang dưới đèn UV 365 nm, vết tắt quang dưới đèn UV 254 nm và cho màu cam với TT Dragendorff. Phổ UV cho cực đại hấp thu tại 229,5 nm và 308 nm. Phổ IR Có các băng hấp thụ đặc trưng ở 2902,26; 1660,22; 1619,94; 1554,02 cho thấy hợp chất 4 có nhóm >C=O. Phổ LC-MS (ESI+) có mũi ion phân tử giả m/z 271,25, có thể tương đương với [M+H]+ (Tính toán lý thuyết: [C17H22N2O + H]+ = 271,18), tương ứng với công thức phân tử C17H22N2O (M = 270,17) (Tham khảo PL 61-62). 72 Phổ NMR cho thấy sự hiện diện của 16 nhóm tín hiệu carbon, trong đó có 1 tín hiệu của 2 carbon tương đương. Có 3 nhóm methyl, gồm: 1 nhóm CH3- gắn với CIV (δC 22,8), 2 nhóm CH3- gắn với N (δC 39,5). Có 3 nhóm methylen, gồm: 2 nhóm -CH2- sp3 (δC 29,2; 44,5), 1 nhóm =CH2 sp2 (δC 116,3). Có 6 nhóm methin, gồm: 2 nhóm >CH- sp3 (δC 38,9; 45,8), 4 nhóm =CH- sp2 (δC 117,6; 124,5; 140,2; 142,4). Có 5 CIV, gồm: 1 nhóm –NH-C=O (δC 165,1), 3 nhóm >C= sp2 (δC 118,7; 134,3; 142,8), 1 nhóm >C-N< (δC 59,9).. Các dữ liệu phân tích của chất 4 trùng khớp với các dữ liệu đã công bố của hợp chất huperzinin [48] (Tham khảo PL 63-67). Hình 3.12. Công thức cấu tạo của huperzinin Bảng 3.11. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 4 Vị trí C Hợp chất 4 (CDCl3, 500 MHz) Dept C δH (ppm,m,J) 1 C 165,1 2 C 117,6 6,45 (d, J=9,4) 3 C 142,4 7,66 (d, J =9,45) 4 C 118,7 5 C 142,8 6 CH2 29,2 2,98 (dd, J=17,6; 5,1), 2,42 s 7 CH 38,8 2,42 s 8 C 124,5 5,36 (d, J=5,1) 10 CH2 116,3 5,19 (dd, J=17; 1,7), 5,05 (dd, J=10,1; 1,85) 11 CH 140,2 5,96 (ddd, J=17; 10,1; 10,1) 12 CH2 45,8 2,86 (dd, J=10,1; 3,9) 13 C 59,9 14 CH2 44,5 1,62 (d, J=17,35), 2,79 (d, J=17,35) 15 CH 134,3 16 CH3 22,8 1,54 s N(Me)2 39,5 2,42 s 39,5 2,42 s N-H 13,00 s 3.3.3. Chiết xuất và phân lập hợp chất 5 và 6 từ cây Thạch tùng nghiên Kết quả nghiên đánh giá hoạt tính sinh học đã chứng tỏ Thạch tùng nghiên có tác dụng kháng AChE. Tác dụng này có thể do trong cây sở hữu hợp chất tự nhiên nào đó khác huperzin A. Thạch tùng nghiên có trữ lượng lớn và phân bố rộng khắp các khu vực Tây Nguyên ở độ cao từ 700 m. Kết quả khào sát phân bố, sinh thái phù hợp với số 11 12 13 4 5 6 7 N H 1 23 14 8 15 O 10 N H 16 73 liệu điều tra nguồn tài nguyên dược liệu họ Thạch tùng ở các tỉnh Tây Nguyên từ năm 2010 – 2013 của Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM. Quá trình nghiên cứu phân lập các nhóm hợp chất từ cây Thạch tùng nghiên được thực hiện nhằm tìm ra chất có tác dụng sinh học tương tự huperzin A để có thêm thuốc mới trong việc điều trị AD. Các bước khảo sát được thực hiện để chọn dung môi cho quy trình chiết xuất và phân lập. Thực nghiệm khảo sát 3 quy trình chiết xuất alcaloid cho thấy quy trình chiết bằng MeOH hiệu quả nhất vì hiệu suất chiết cao hơn so với phương pháp 2 chiết bằng nước acid và phương pháp 3 kiềm hóa bột dược liệu chiết với diclomethan. Kết quả được trình bày trong bảng 3.12. Bảng 3.12. So sánh kết quả của PP1, PP2, PP3 Phương pháp Hiệu suất chiết alcaloid Phương pháp 1: chiết bằng MeOH 21,34 % Phương pháp 2: Chiết bằng nước acid HCl 5 % 18,55 % Phương pháp 3: Kiềm hóa và chiết bằng dicloromethan 11,24 % Từ kết quả khảo sát, quy trình được chọn lựa để phân lập các hợp chất như sau: Bột dược liệu toàn cây Thạch tùng nghiên (3 kg) được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với methanol. Cô thu hồi dung môi thu được hòa 650 g cao chiết. Phân tán cao chiết này trong nước và lắc lần lượt với n-hexan và ethyl acetat. Dịch nước còn lại được acid hóa đến pH = 2 với HCl 5 % và lắc phân bố với dicloromethan. Dịch nước tiếp tục được kiềm hóa đến pH = 11 - 12 với NaOH và lắc phân bố với dicloromethan. Cô thu hồi dicloromethan thu được 4,8 g cao dùng để phân lập một số alcaloid. Dịch nước còn lại được phân bố qua cột Diaion HP20. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Thạch tùng nghiên được tóm tắt theo sơ đồ 3.2. 74 Sơ đồ 3.2. Quy trình chiết xuất và phân lập các hợp chất trong cây Thạch tùng nghiên Tiến hành phân lập alcaloid toàn phần trong cao dichloromethan bằng sắc ký cột cổ điển với dung mội DCM - MeOH - NH3 với tỉ lệ tăng dần từ (10:0:0,1) đến (9:1:0,1) thu được 11 phân đoạn. Trong đó có 6 phân đoạn dương tính với thuốc thử Dragendorff. Các phân đoạn của cột Dianion Dịch CH2Cl2 Lắc phân bố với CH2Cl2 Diaion HP20 Lắc với etyl acetat Dịch etyl acetat Acid hóa với HCl 5 % Kiềm hóa pH 11-12 Dịch acid hóa Lắc với n-hexan Cô dịch chiết MeOH thu cắn, hòa cắn vào nước Cô thu hồi dung môi Lắc phân bố với CH2Cl2 Làm ẩm, ngâm, chiết với MeOH 3 kg bột Thạch tùng nghiên Dịch chiết MeOH Dịch chiết nước Dịch kiềm hóa Dịch CH2Cl2 Cao CH2Cl2 Dịch n-hexan Hợp chất 5 (157,2 mg) Hợp chất 6 (12 mg) 75 UV 254 nm UV 365 nm Thuốc thử Dragendorff Hình 3.13. Sắc ký đồ các phân đoạn alcaloid Phân đoạn 4 có khối lượng 861,2 mg được tiến hành sắc ký cột tiếp theo với dung mội DCM - MeOH - NH3 với tỉ lệ tăng dần từ (10:0:0,1) đến (9:1:0,1) để thu được hợp chất 5 (Tham khảo PL 89.1). Lớp nước còn lại được phân tách bằng cột Diaion HP -20 với nồng độ MeOH tăng dần để thu được các phân đoạn sau: Hình 3.14. Sắc ký đồ các phân đoạn cột Diaion Phân đoạn 1 đến phân đoạn 4 nồng độ MeOH tăng dần từ 0 % đến 50 %. Phân đoạn 5 đến phân đoạn 7 nồng độ MeOH tăng dần từ 60 % đến 75 %. Phân đoạn 8 đến phân đoạn 12, nồng độ MeOH tăng dần từ 80 % đến 100 %. Phân đoạn 8 có khối lượng 1,52 g, các vết trên SKĐ tách rõ, được lựa chọn để tiếp tục phân tách bằng cột silica gel (3,0 x 60 cm), hệ dung môi CH2Cl2 - MeOH - H2O (3:1:0,1) thu được 8 phân đoạn. Phân đoạn 8.1: Gộp các ống nghiệm từ 1 đến 9; Phân đoạn 8.2: Gộp các ống nghiệm từ 10 đến 15; Phân đoạn 8.3: Gộp các ống nghiệm từ 16 đến 20; Phân đoạn 8.4: Gộp các ống nghiệm từ 21 đến 29; Phân đoạn 8.5: Gộp các ống nghiệm từ 30 đến 36; Phân đoạn 8.6: Gộp các ống nghiệm từ 37 đến 40; Phân đoạn 8.7: Gộp các ống nghiệm từ 41 đến 46; Phân đoạn 8.8: Gộp các ống nghiệm từ 47 đến 60 (Tham khảo PL 89.2). TT. VS 76 Phân đoạn 8.8 có khối lượng 150 mg, trên SKĐ cho 1 vết đậm, tiếp tục phân lập bằng cách sử dụng cột Sephadex LH-20 (2,0 x60 cm), hệ dung môi MeOH - H2O (1:1) và thu được hợp chất 6 (12 mg) (Tham khảo PL 89.3). Khảo sát cấu trúc của hợp chất 5 Hợp chất 5 kết tinh trong methanol, tinh thể hình kim, không màu, điểm chảy 225 oC. Trên SKLM,hợp chất 5 không cho vết phát quang và vết tắt quang, có vết màu cam với TT Dragendorff. Phổ HRMS của hợp chất 5 cho mũi ion phân tử giả m/z 279,2107 [M + H]+ (Tính toán lý thuyết: [C16H26N2O2 + H]+ = 279,2066), tương ứng với công thức phân tử C18H27NO4 (M = 278,1988). Phổ IR của hợp chất 5 có 2 băng hấp thụ đặc trưng của nhóm chức OH, C=O ở 3402 và 1614 cm-1 (Tham khảo PL 68). Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT và HSQC cho thấy 16 tín hiệu carbon bao gồm: 1 nhóm CIV >C=O ( C 171,2 ), 1nhóm −CH3 (C 23,2 ; H 0,88 d; J = 6,5 Hz), 8 nhóm −CH2− (C 42,5; 42,3; 38,9; 34,1; 33,7; 31,2; 19,9; 17,5 ppm ), 6 nhóm >CH− (C 70,7; 68,8; 60,3; 52,4; 50,3; 26,9 ppm). Trong đó, có 1 nhóm >CH−OH (C 70,7; H 3,74 m) (Tham khảo PL 69-71). Phổ NMR của chất 5 cho thấy nhóm hydroxy ở vị trí C12, phổ HMBC của chất 5 có H12 (H =3,74) – C10 (c =17,5), H14a (H =1,41) – C12 (c =70,7) và phổ COSY, H11a (H =1,88) – H12 (H=3,74), H12 (H =3, 74) – H13 (H =2,87) (Tham khảo PL 72-74). Các dữ liệu phân tích của hợp chất 5 đều trùng khớp với lycocernuin đã công bố [108]. Hình 3.15. Công thức cấu tạo của lycocernuin H H N N O H H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 OH 77 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 5 Vị trí Carbon Hợp chất 5 (CDCl3, 500 MHz) DEPT C H; m; (J,Hz) 1 >C=O 171,2 2 CH2 34,1 1,93 m 2,41 m 3 CH2 19,9 1,71 m 1,82 m 4 CH2 31,2 1,52 m 2,05 m 5 CH 52,4 3,66 m 6 CH2 42,3 1,08 m 1,64m 7 CH 50,3 3,63m 8 CH2 42,5 0,80 dd ( 12,5; 23,5) 1,68m 9 CH 68,8 5,48 dd (2,5; 12) 10 CH2 17,5 1,13 m 2,48 m 11 CH2 33,7 1,88 m 2,39 m 12 CH 70,7 3,74 m 13 CH 60,3 2,87m 14 CH2 38,9 1,41 m 1,79 t (2) 15 CH 26,9 2,46 m 16 CH 23,2 0,88 d (6,5) Khảo sát cấu trúc của hợp chất 6 Hợp chất 6 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ HR-FAB-MS cho mũi ion phân tử giả m/z z 559,1794 [M + Na]+ (Tính toán lý thuyết: [C26H32O12 + Na]+ = 559,1791), tương ứng với công thức phân tử C18H27NO4 (M = 536,1894) (Tham khảo PL 75). Phổ IR cho tín hiệu của nhóm hydroxyl (3379 cm-1), nhóm carboxylic acid (1638 cm-1) và tín hiệu của vòng thơm (1600, 1515 cm-1). Phổ 1H-NMR của hợp chất 6 cho thấy có một vòng thơm thế ở vị trí 1, 3, 4 với tín hiệu của proton tại H 7,06 (1H, br s, H-2), H 7,17 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5) và H 6,96 (1H, br dd, J = 8,0 Hz, H-6) cùng một vòng thơm thế ở vị trí 1, 3, 4, 5 với tín hiệu của proton tại H 6,80 (1H, br s, H-2ʹ) và H 6,76 (1H, br s, H-6ʹ). Các tín hiệu proton cho thấy hợp chất 6 có nhóm chức propanoic tại H 2,84 (2H, t, J = 7,6 Hz, H-7ʹ), H 2,53 (2H, t, J = 7,6 Hz, H-8ʹ), một nhóm oxymethin tại H 5,55 (1H, d, J = 6,0 Hz, H- 7), một nhóm methin tại H 3,51 (1H, m, H-8), 2 nhóm oxymethylen tại H 3,88 (1H, 78 m, H-9a) và H 3,78 (1H, m, H-9b), 2 nhóm methoxyl tại H 3,85 và H 3,88 (3H, s). Ngoài ra còn có tín hiệu của nhóm glycosyl tại H 4,89 (1H, d, J = 7,6, H-1ʹʹ). Dữ liệu phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy hợp chất 6 có 26 carbon bao gồm 12 carbon thuộc 2 vòng thơm, 1 nhóm oxymetyl tại C 88,4 ppm (C-7), 1 nhóm methin tại C 55,5 ppm (C-8), 2 nhóm methylen tại C 32,3 (C-7ʹ) và 38,1 ppm (C-8ʹ), 1 nhóm oxymethylen tại C 65,2 ppm (C-9), 2 nhóm methoxy tại C 56,7 (3-OCH3) và 56,8 (6ʹ- OCH3) cùng với 6 carbon của đường. Các dữ liệu phổ cho thấy hợp chất 6 có khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid [131]. Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 6 Vị trí C Hợp chất 6 δH (ppm, J / Hz) (500 MHz, Methanol) δC (ppm) (125 MHz, Methanol) 1 C 129,6 2 CH 7,06, brs 111,2 3 C 150,9 4 C 147,5 5 CH 7,17, d (8,0) 118,1 6 CH 6,96, brd (8,0) 119,4 7 CH 5,55, d (6,0) 88,4 8 CH 3,51, m 55,5 9 CH2 3,88, m; 3,78, m 65,2 1′ C 136,1 2′ CH 6,80, brs 114,1 3′ C 138,5 4′ C 147,7 5′ C 145,2 6′ CH 6,76, brs 117,8 7′ CH 2,84, t (7,6) 32,3 8′ CH 2,53, t (7,6) 38,1 9′ C 178,1 1″ CH 4,89, d (7,6) 102,8 2″ CH 3,53, m 74,8 3″ CH 3,51, m 77,8 4″ CH 3,43, m 71,3 5″ CH 3,45, m 79,4 6″ CH2 3,72, dd (3,5, 12,0) 3,89, m 62,4 3-OMe 3,88, s 56,7 5′-OMe 3,85, s 56,8 79 R = CH2CH2CH2OH: Dihydrodehydrodiconiferyl alcohol 4-O-b-d glucopyranoside R = COCH3: Bombasin 4-O-b-glucosid Hình 3.16. Khung cấu trúc dihydrobenzofuran neolignan glycosid “Nguồn: Jun Wu., 2008 [131]” Thủy phân hợp chất 6 bằng acid HCl 1N trong methanol thu được D-(+)-glucose, bằng cách đối chiếu với mẫu chuẩn cho thấy 2 chất tương đồng trên SKLM. Phân tích các dữ liệu phổ COSY đã xác định vị trí của các nhóm bằng các tương tác giữa proton oxymethin tại H 5,55 (H-7) và proton tại H 3,51 (H-8), proton của nhóm methylen tại H 2,84 (H-7ʹ) và proton tại H 2,53 (H-8ʹ). Phổ HMBC xuất hiện các tương tác xa giữa H-2/H-6 và C-7, và H-7ʹ/H-8ʹ và C-1ʹ và C-9ʹ. Vị trí của 2 nhóm methoxy được xác định tại C-3 và C-6ʹ nhờ vào các tương tác HMBC giữa proton tại H 3,85 và H 3,88 tương ứng với C 150,9 và C 145,2. Tương tác trên phổ HMBC của H-1” (H 4,89) và C-4 (147,5) cho thấy nhóm glucopyranosyl liên kết với oxy tại C-4 và hằng số liên kết J = 7,6 Hz xác định kiểu liên kết là β-glucosid. JH-7/H-8 = 6,0 Hz cho thấy hai H-7 và H-8 ở vị trí trans, ngoài ra dữ liệu trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa H-7 và H-9 cũng bổ sung cho nhận định này (Tham khảo PL 76-79). Các tương tác xa của hợp chất 6 được trình bày trong hình 3.17. Từ các dữ kiện trên, hợp chất 6 được xác định là (7R,8S)- 7,8-dihydro-8-hydroxymethyl-7-(3-methoxyphenyl-4-O-β-D-glucopyranosid)- 1ʹbenzofuranpropanoic acid. Cấu trúc hóa học này được kiểm tra trên SciFinder ngày 10 - 12 - 2014 cho biết đây là hợp chất tự nhiên mới và được đề nghị tên gọi là lycocernuasid A. Công bố quốc tế của hợp chất mới đã được thực hiện trên tạp chí ISI là Chemical-Biological Interactions 2015. Vào năm 2017, nhóm tác giả Trung Quốc đã trích dẫn và sử dụng tên lycocernuasid cho công trình nghiên cứu trên cùng cây Thạch tùng nghiên. Nghiên cứu này đã phân lập 3 hợp chất mới có cùng khung cấu trúc, đặt tên là lycocernuasid B - D và công bố trên tạp chí Fitoterapia (2017). 80 COSY HMBC Hình 3.17. Cấu trúc hóa học và các tương tác của lycocernuasid A 3.3.4. Đánh giá tác động ức chế AChE