Luận văn Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L và Hydrocotyle vulgaris L

yển. So với cây Foeniculum vulgare L. thì cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. nhận NaCl nhiều hơn. Cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis L. đã được người dân sử dụng để làm thực phẩm và theo họ cây có vị đắng hơn các loại Rau Má thường. Chưa có sự nghiên cứu nào về thành phần hóa học trên cây này. 1.2.2. Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris L. [4] 1.2.2.1. Tên gọi Tên khoa học: Hydrocotyle vulgaris L. Tên khác: Marsh pennywort, Umbrella plant, Rau Má Lá Sen. Hình 4: Cây Hydrocotyl vulgaris Hình 5: Hoa Hydrocotyle vulgaris 1.2.2.2. Sinh thái học - Cây sống trong môi trường ẩm ướt, tập trung thành quần thể lớn. Xuất xứ ở Châu Âu, vùng Bắc Phi, gần đây phát hiện ở Việt Nam. - Là loại cỏ lưu niên, dạng dây leo, cây mảnh khảnh, phân nhiều rễ ở các mấu đốt. Phiến lá hình tròn, đường kính khoảng 0,8-3,5 cm, có thể phát triển đến 3- 6 cm, có khía tai bèo, có 6-9 gân lá. - Hoa màu trắng, hồng nhạt hoặc hơi xanh, có đường kính 1 mm. - Quả hình trứng dài khoảng 2 mm, rộng khoảng 2,5 mm, dày 0,8 mm. 1.2.2.3. Thành phần hóa học Có hai nhóm chất chính đã được xác định trên cây Hydrocotyle vulgaris L. là triterpen và flavonoid. - Năm 1971, Hiller và các cộng sự [8]cô lập được các saponin từ Hydrocotyle vulgaris L. Kaempferol Kaempferol-3-O-D-galactoside - Năm 1974, Rzadkowska-Bodalska [9] đã cô lập từ cây được hai hợp chất quercetin-3-galactoside và quercetin-3-rhamnoglactoside. Quercetin-3-galactoside - Năm 1979, Hiller [10] và cộng sự đã cô lập được quercetin-3-b-D- galactopyranosyl-6-O-a-L-arabinopyranoside, còn gọi là rumarin, từ phần mọc trên mặt đất của cây Hydrocotyle vulgaris L. Quercetin-3-b-D-galactopyranosyl-6-O-a-L-arabinopyranoside - Năm 1981, Voigt [10] và các cộng sự cô lập từ Hydrocotyle vulgaris L. tươi được hỗn hợp gồm sáu flavonol glycoside bên cạnh các kaempferol và quercetin glycoside. Đó là các chất sau: quercetin-3-O-robinobioside, quercetin-3-O-b-D-galactopyranoside, quercetin-3-O-b-D-galactopyranosyl-6- O-a-L-arabinopyranoside, kaempferol-3-O-robinobioside, và hai chất với phần đường tương tự của kaemferol. Kaempferol-3-O-robinobioside 1.3. Công dụng của cây Rau Má - Rau Má có vị hơi đắng, tính mát, có tác dụng giải nhiệt nên được dùng trong thực phẩm như một loại rau gia vị hoặc dùng làm nước giải khát rất thích hợp trong mùa hè. - Ngoài ra Rau Má còn được dùng trong y học có thể chữa được nhiều loại bệnh như: Cầm máu, làm lành vết thương, bảo vệ thần kinh, trị mụn nhọt, trị kiết lị, trị bệnh chảy máu cam, chữa sốt, trị ho… 1.4. Giới thiệu chung về flavonoid 1.4.1. Định nghĩa - Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, có vai trò rất lớn trong việc tạo ra màu sắc của nhiều loại rau, hoa, quả…. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy flavonoid rất hữu ích trong việc điều trị và ngăn ngừa được nhiều loại bệnh. Flavonoid được tìm thấy nhiều trong các loại trái cây, các loài thực vật, trà, rượu, trái cây và cả rễ cây,… Sau đây là bảng một số nhóm flavonoid có chứa trong thực phẩm quen thuộc hằng ngày. Bảng 3: Một số nhóm flavonoid quen thuộc trong cuộc sống hằng ngày Hạt đậu tương (đậu nành) Isoflavone Mì Rutin Trà Flavan-diol và Catechin Cà chua Naringeninchalcone Rượu, cacao Polyphenol - Về cấu trúc flavonoid là một nhóm chất thiên nhiên quan trọng có chứa 2 vòng benzene (ký hiệu là vòng A và vòng B) được nối với nhau bởi một mạch 3 cacbon. Mạch cacbon này được đánh theo thứ tự các số tương ứng là 2, 3, 4, có thể liên kết với 1 nhóm hydroxyl (-OH) ở vòng A để hình thành nên vòng C. Flavonoid được phân loại dựa theo cấu trúc của vòng C này. [6,12] Khung sườn của flavonoid - Khác với nhóm carotenoid vốn cũng có màu vàng và đỏ, không tan trong nước, các glucosid của flavonoid đều dễ tan trong nước. Một số tan trong rượu acid vô cơ loãng và bazơ loãng. Flavonoid cho kết tủa màu vàng cam hoặc đỏ với acetate chì, kết tủa màu xanh lục hoặc đỏ nâu với FeCl3. [6-7] 1.4.2. Phân loại 1.4.2.1. Phân loại dựa vào cấu trúc hóa học [13] Hơn 4000 hợp chất flavonoid đã được phân lập và phân loại dựa vào cấu trúc hóa học. Dựa vào cấu trúc hóa học flavonoid được phân ra làm 4 nhóm chính gồm: PCO, quercetin, biflavonoid cam quít và rượu đa chức ở trà xanh. 1.4.2.1.1. PCO Một trong những nhóm flavonoid thực vật hữu ích nhất là proanthocyanidins (còn được gọi là procyanidins). Nhóm này mang lại rất nhiều ích lợi cho sức khỏe. Mỗi proanthocyanidins liên kết với các loại proanthocyanidins khác tạo thành một hỗn hợp gồm các proanthocyanidins nhị trùng, tam trùng, tứ trùng và các phân tử trùng phân lớn hơn được gọi chung là procyanidolic oligomer, gọi tắt là PCO. PCO có trong nhiều loại thực vật và rượu vang đỏ, tuy nhiên về mặt thương mại người ta hay dùng PCO trong dịch trích hạt nho. 1.4.2.1.2. Quercetin Quercetin là một flavonoid làm xương sống cho nhiều loại flavonoid khác gồm: rutin, quercitrin, hesperidin – các flavonoid của cam quít. Những dẫn xuất này khác với quercetin ở chỗ chúng có các phân tử đường gắn chặt vào bộ khung quercetin. Quercetin là một flavonoid bền vững và hoạt động nhất trong các nghiên cứu và nhiều chế phẩm từ dược thảo có tác động tốt nhờ vào thành phần quercetin với hàm lượng cao. 1.4.2.1.3. Biflavonoid của họ chanh (cam, quít, chanh,…) Các Biflavonoid trong cam quít gồm: Rutin, hesperidin, quercitrin và naringin. Hầu hết các khảo sát về rutin và hỗn hợp biflavonoids thô đều được thực hiện trong thập niên 1970. Từ đó đến nay người ta thường dùng loại hỗn hợp rutinoside định chuẩn gọi là hydroxyethylrutosides (HER). Các bằng chứng lâm sàng rõ rệt nhất trong điều trị tăng tính thấm thành mạch, dễ bị vết bầm dưới da, trĩ và các trường hợp dãn tĩnh mạch. 1.4.2.1.4. Polyphenol của trà (chè) xanh Cả trà xanh và trà đen đều xuất nguồn từ cây trà (chè) (Camellia sinensis). Trà xanh được làm từ đọt lá, sấy nhẹ, còn trà đen được hình thành sau một quá trình oxy hóa lá trà. Polyphenol có chứa vòng phenol trong cấu trúc phân tử. Polyphenol chính trong trà xanh là các flavonoid (catechin, epicatechin, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, và proanthocyanidin). 1.4.2.2. Phân loại dựa theo màu sắc [14] Dựa theo màu sắc flavonoid được phân ra làm 3 nhóm chính: - Anthocyanin cho màu đỏ, xanh, tím. - Anthoxanthin và flavone cho màu vàng. - Tanin thực phẩm: Bao gồm catechin và leucoanthocyanin không màu. 1.4.2.2.1. Anthocyanin - Các hợp chất thuộc nhóm này đều là những sắc tố quan trọng của hoa quả, chúng làm hoa quả có màu xanh đỏ với nhiều sắc thái khác nhau. - Các anthocyanin hiện diện trong thực vật ở dạng hợp chất glycoside với 1 hay 2 phân tử đường đơn như glucose, galactose, ramnose và có khi là pentose. - Có 3 loại anthocyanidin tìm thấy trong mô thực vật là: üPelagonidin. üCyanidin (phổ biến nhất). üDelphinidin. - Màu sắc của các anthocyanin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ và nhiều yếu tố khác. Thí dụ: Cyanin ở pH <= 3: màu đỏ pH = 8: màu tím pH = 11: màu xanh - Việc tăng nhóm -OH trong phân tử anthocyanidin sẽ làm tăng cường độ màu xanh, còn khi tăng mức độ methyl hóa các nhóm -OH ở vòng benzene càng cao thì màu càng đỏ. 1.4.2.2.2. Anthoxathin và flavone - Là những sắc tố màu vàng, hòa tan trong dịch tế bào, thường ở dạng glycoside. - Flanone cho nhiều dẫn xuất như: flavonol, flavanonol và isoflavone. - Một số flavone thường gặp: üQuercetin có trong vỏ củ hành, chanh, quýt. üApigenin là glycoside có trong cây ngò và thược dược. üHesperitin là sắc tố của cam, chanh. 1.4.2.2.3. Catechin và leucoanthocyanin Các chất này vô sắc, nhưng phản ứng với kim loại đều cho màu. - Catechin là cấu tử của chất tannin thu được từ một số cây như thông, liễu và nhất là trong chồi non cây trà. Catechin còn có trong một số loại quả như lê, táo, mận, nho. - Các tannin thiên nhiên đều là hỗn hợp của acid galic và acid digalic ở dạng tự do cũng như dạng kết hợp với glucose. - Dưới tác dụng của tannin, protein dễ bị đông vón, chúng rất bền với nước và các vi khuẩn gây tối, có tính dẻo, đàn hồi. 1.4.3. Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm sắc tố flavonoid Các flavonoid đều có chung một khung sườn flavonoid và chúng được phân loại dựa vào khung sườn này, sau đây là bảng trình bày một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid thường gặp: [12,15] Bảng 4: Một số cấu trúc phân tử thuộc nhóm flavonoid Tên Cấu trúc phân tử Thí dụ Flavanone Vỏ của mận, cam Flavone Ngò tây, cần tây Dihydroflavonol Nho Flavonol Củ hành, táo, trà Flavan Táo, trà, rượu Anthocyanin Nho Isoflavonoid Đậu 1.4.4. Tác dụng sinh học của nhóm sắc tố flavonoid - Kháng viêm, kháng dị ứng, chống virus và ung thư. - Hoạt tính chống oxy hóa mạnh tác dụng đến nhiều hệ enzyme và ít độc đối với cơ thể sống. Khi đưa vào cơ thể sống, flavonoid có thể tác động lên các biến đổi sinh hóa học bằng cách trực tiếp hay gián tiếp như thông qua hoạt động của các enzyme hay hệ thống thần kinh, nội tiết…. - Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ hệ tim mạch, giảm nguy cơ tử vong do các bệnh lý tim mạch như thiếu máu cơ tim, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim, xơ vữa động mạch,…nhờ khả năng chống oxy hóa không hoàn toàn cholesterol (cũng giống như các chất chống oxy hóa khác như vitamin C, E,…). [13] - Nhiều loại flavonoid có chứa vitamin P, tăng cường tác dụng của acid ascorbic, giúp củng cố các thành mạch máu đang bị suy yếu và có tác dụng làm dịu các cơn đau. Chúng còn được xem là một loại thuốc tiêu độc. - Ngoài ra, nếu lượng flavonoid cung cấp hàng ngày giảm đi, nguy cơ các bệnh lý này tăng lên rõ rệt. Khả năng chống oxy hóa của flavonoid còn mạnh hơn các chất khác như vitamin C, E, selenium và kẽm. Mỗi một loại flavonoid đều mang lại những lợi ích riêng, nhưng chúng thường hoạt động hỗ trợ cho nhau. CHƯƠNG 2 MỘT SỐ QUI TRÌNH TRÍCH FLAVONOID Ở VIỆT NAM 2.1. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ 2.1.1. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetat chì [6] Cơ sở lý thuyết: Chuẩn bị cao cần để trích flavonoid. Hòa tan cao bằng dung dịch ethanol 10% trong nước, chứa trong một bình tam giác. Sau đó rót từ từ dung dịch nước 10% acetate chì vào bình tam giác này, khuấy nhẹ ta thu được tủa flavonoid. Lọc thu lấy tủa, hòa tan tủa trở lại vào dung dịch alcol loãng, khuấy nhẹ cho thành một dung dịch keo đồng nhất. Sau đó thêm từ từ dung dịch nước bão hòa Na2SO4, nhằm loại bỏ tủa PbSO4. Lọc lấy dung dịch nước, cô quay dịch lọc ở áp suất kém ta thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần. Sắc ký cột để tách riêng các flavonoid. Qui trình: Cao trích Hòa vào ethanol 10% Dung dịch nước Dung dịch nước acetate chì 10%, khuấy đều, để yên, lọc. Dung dịch nước Tủa Hòa vào ethanol 10%. Thêm dung dịch nước bão hòa Na2SO4. Để yên. Lọc. Tủa PbSO4 Sơ đồ 1: Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng dung dịch acetate chì Dung dịch nước Cô quay Flavonoid thô + Na2SO4 dư Hòa vào methanol. Cô quay. Flavonoid thô Sắc khí cột Các flavonoid riêng 2.1.2. Trích flavonoid ra khỏi cây cỏ bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau [6] Cơ sở lý thuyết: Các flavonoid do có mang nhiều nhóm –OH phenol nên có thể tan được trong dung dịch kiềm. Dựa vào nguyên tắc này, sử dụng các dung dịch kiềm loãng hoặc nước vôi ta có thể trích được flavonoid ra khỏi cây cỏ, dung dịch trích sau đó sẽ được acid hóa để trả flavonoid về dạng –OH tự do, quá trình trích này được thực hiện như sau: Chuẩn bị cao cần để trích flavonoid. Hòa tan cao vào dung môi hữu cơ thích hợp thí dụ: chloroform, ethyl acetate… Tiến hành trích lỏng - lỏng dung dịch này với dung dịch nước kiềm 5 – 10% như: dung dịch NaHCO3, Na2CO3… Acid hóa các dịch trích. Sau đó sử dụng dung môi hữu cơ phù hợp để trích các flavonoid ra khỏi dung dịch nước. Làm khan nước bằng CaCl2, Na2SO4… Sau đó đuổi dung môi, ta thu được cao thô chứa flavonoid toàn phần. Tiến hành sắc ký cột để tách riêng các flavonoid. Qui trình:  Cao trích Hòa vào chloroform hoặc ethy acetate Dung dịch hữu cơ Thực hiện sự trích lỏng - lỏng với dung dịch nước kiềm 5 – 10% Pha hữu cơ Pha nước kiềm Acid hoá Pha nước acid Thực hiện sự trích lỏng - lỏng với dung môi hữu cơ: chloroform, ethyl acetate,… Pha nước Pha hữu cơ Làm khan nước. Đuổi dung môi. Flavonoid thô Sắc kí cột Các flavonoid riêng rẽ Sơ đồ 2: Trích flavonoid bằng các dung dịch kiềm có độ kiềm khác nhau 2.2. Trích rutin từ hoa Hòe [2] Cơ sở lý thuyết: - Nguyên liệu sử dụng chính là hoa Hòe khô. Sau khi mua về, sàng để loại đất cát, cành lá. Tất cả đem sấy khô ở nhiệt độ 50- 600C. Sau đó đem nghiền mịn, ta thu được bột hoa Hòe, bột này được bảo quản kín và sử dụng để đều chế rutin. - Bột hoa Hòe được trích với dung môi ở nhiệt độ sôi thích hợp, riêng với dung môi là NaOH thì thực hiện ở 750C. Tiến hành lọc để thu dịch lọc. Dịch lọc sau đó được acid hóa với HCl về pH = 3 – 4, sau đó làm lạnh và kết tinh. - Kết quả thu được nhận thấy khi độ phân cực của dung môi giảm dần, lượng rutin thu được cũng tăng dần. Hơn nữa, khi dung môi là nước thì những thành phần chất nhầy, nhựa, saponin, … cũng được trích ra và kết hợp với rutin mịn khi nhiệt độ hạ, tạo thành hệ gần như keo, làm quá trình lọc tách bã rất khó khăn. Các dung môi là cồn không gặp trở ngại này. Tiến hành tinh chế rutin sản phẩm bằng phương pháp kết tinh lại trong dung môi ethanol 800. Qui trình: Qui trình trích rutin từ hoa Hòe được tóm tắt trong sơ đồ sau: Dung môi Nguyên liệu Trích với dung môi Lọc nóng Bã Loại dung môi Làm lạnh, kết tinh Lọc Dịch Sấy ở 700C Rutin thô Sơ đồ 3: Trích rutin từ hoa Hòe 2.3. Trích polyphenol từ trà (có hỗ trợ bằng vi sóng) [11] Cơ sở lý thuyết: Trà tươi nguyên liệu sau khi được mang về phòng thí nghiệm được xử lý ức chế enzyme, để ráo và xay nhỏ bằng máy xay thực phẩm. Sau đó, bột trà được cân với lượng thích hợp rồi cho vào bình cầu, thêm dung môi và thực hiện quá trình trích ly. Để tránh hiện tượng quá nhiệt do chiếu vi sóng liên tục, quá trình chiếu sóng được thực hiện gián đoạn theo chu kì, 1 phút chiếu sóng, 2 phút làm mát bằng ống giải nhiệt trong bình, nhiệt độ trong suốt quá trình trích ly được giữ ở mức 75 – 800C. Sau khi kết thúc quá trình trích ly, dịch trà được đem lọc, bỏ bã, dịch lọc được định mức lên thể tích thích hợp và đem phân tích để đánh giá hiệu quả trích ly thu được. Qui trình: Qui trình trích polyphenol từ trà được tóm tắt trong sơ đồ sau: Búp trà nguyên liệu Diệt men Đánh giá: - Tỷ lệ nguyên liệu: dung môi - Nồng độ dung môi - Thời gian chiếu vi sóng - Công suất lò - Chất kháng oxy hóa hỗ trợ - Thu suất trích ly Xay nhỏ Trích ly có hỗ trợ vi sóng Lọc Bã Dịch trích Xác định polyphenol tổng  Phương pháp so màu Đánh giá hiệu quả quá trình trích ly Sơ đồ 4: Trích polyphenol từ trà có hỗ trợ bằng vi sóng Sau khi polyphenol được trích ra từ trà, sẽ được tinh chế sơ bộ lại theo qui trình được thể hiện trong sơ đồ sau: Dịch lọc Dung dịch gelatin 25% Tỉ lệ 1: 60 Gia nhiệt đến 400C Tạo tủa (loại các phần tử lơ lửng) Làm lạnh dưới 100C Lọc hút chân không Tủa Vtđ Chloroform Dịch lọc Tách loại các chất màu Vtd ethyl acetate ( 200mlx2) Na2SO4 làm khan Chất bảo quản Trích Lớp nước Chuyển pha ethyl acetate Làm khan Cô chân không Sấy phun / Sấy thăng hoa  Lớp Chloroform Ethyl acetate Sản phẩm dạng bột Sơ đồ 5: Tinh chế sơ bộ sản phẩm Thuyết minh qui trình: Dịch trích thu được sau quá trình trích ly được tách loại sơ bộ các tạp chất lơ lửng, tách các tannin phân tử lớn bằng cách gia nhiệt đến 400C và tạo tủa với dung dịch gelatin 25%, sau đó dung dịch được làm lạnh đến < 100C và lọc bỏ tủa. Dịch trích thu được trong suốt, không bị tủa lại trong thời gian quan sát 1 tháng. Do các catechin không bị tủa với gelatin nên quá trình xử lý sẽ không ảnh hưởng đến thành phần catechin của dịch trích. Dịch trích sau khi lọc được tách loại chất màu và một phần caffeine bằng cách trích với chloroform, sau đó loại bỏ lớp chloroform (có màu xanh). Lớp nước thu được có màu vàng. Phần catechin trong lớp nước được chuyển sang lớp ethyl acetate, bằng cách trích với 3 thể tích ethyl acetate, dung dịch ethyl acetate sau cùng có màu vàng nhạt. Sau đó dịch ethyl acetate được tiến hành làm khan và cô đặc để loại bỏ dung môi, trong quá trình cô đặc một lượng nước thích hợp được thêm vào để tách hoàn toàn ethyl acetate. Dịch đặc được đem làm khô bằng cách sấy phun hoặc sấy thăng hoa. CHƯƠNG 3 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TRÍCH TÁCH HỢP CHẤT RA KHỎI CÂY Có nhiều cách để trích tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Sau đây là một vài phương pháp trích tách hợp chất ra khỏi cây cỏ đã được thực hiện trong đề tài luận văn. 3.1 Phương pháp trích lỏng – lỏng [6] Phương pháp trích lỏng – lỏng thường được áp dụng để: üTrích hợp chất cần quan tâm ra khỏi dung dịch ban đầu. üPhân chia cao alcol thô ban đầu có chứa quá nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân cực thành những phân đoạn có tính phân cực khác nhau. Việc trích lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóng. Cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước để làm pha căn bản. Sử dụng lần lượt các dung môi hữu cơ để trích ra khỏi pha nước các hợp chất có tính phân cực khác nhau. Việc trích được thực hiện từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực. Với mỗi loại dung môi hữu cơ, việc trích được thực hiện nhiều lần, mỗi lần một lượng nhỏ thể tích dung môi, trích đến khi không còn chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang trích với dung môi có tính phân cực hơn. Dung dịch của các lần trích được gom chung lại, làm khan nước với các chất làm khan, đuổi dung môi thu được cao trích. Cần lưu ý là kỹ thuật trích lỏng – lỏng phải được thực hiện ở nhiệt độ phòng. Kỹ thuật trích lỏng – lỏng có nhược điểm là do phải lắc bình lóng nhiều lần, nên ở những lần trích sau, dung môi trong bình lóng dễ tạo nhũ tương, gây khó khăn trong việc tách pha thành hai lớp. 3.2. Phương pháp trích rắn – lỏng [6] 3.2.1. Phương pháp trích ngâm dầm Đây là kỹ thuật trích đơn giản nhất, có thể dễ dàng thao tác với một lượng lớn mẫu cây. Chỉ cần ngâm bột cây trong một bình chứa bằng thủy tinh hoặc bằng thép không rỉ, bình có nắp đặy. Rót dung môi vào bình sao cho xấp xỉ bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên trong cây. Sau đó dung dịch trích được lọc qua giấy lọc, đuổi dung môi sẽ có được cao trích. Tiếp theo rót dung môi mới vào bình chứa bột cây và tiếp tục quá trình trích cho đến khi trích kiệt mẫu cây. Có thể gia tăng hiệu quả trích bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn bột cây hoặc dùng máy lắc để lắc nhẹ. 3.2.2. Phương pháp trích bằng máy Soxhlet Đây là kỹ thuật trích có sử dụng nhiệt, trong đó hợp chất cần trích ra được chứa trong một bình cầu riêng. Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng một lượng ít dung môi mà vẫn có thể trích kiệt được hoạt chất. Quá trình trích tự động, liên tục nên nhanh chóng. Nhược điểm của phương pháp này là không trích được một lượng lớn mẫu cây nên chỉ thích hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. Một bất tiện nữa là trong suốt quá trình trích mẫu cây luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên những hợp chất kém bền nhiệt như carotenoid có thể bị hư hại. PHẦN 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ CHƯƠNG 1 VỊ TRÍ, THỜI GIAN, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1. Địa điểm - thời gian tiến hành Việc nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp “Khảo sát các hợp chất họ flavonoid trong cây Rau Má Lá Sen ”, được tiến hành tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ – Khoa Khoa Học – Trường Đại Học Cần Thơ. Thời gian thực hiện đề tài từ ngày 15/1/2008 và kết thúc ngày 16/5/2008. 1.2. Phương tiện nghiên cứu 1.2.1. Dụng cụ Bảng 5 : Các dụng cụ thí nghiệm Dụng cụ Nhãn hiệu Nước sản xuất Cột sắc ký Đức Bình tam giác, giấy lọc Bomex Trung Quốc Bình cô quay Quickfit Anh Ống hút Pasteur thủy tinh Hed Đức Tủ sấy WTB Binder Đức Bếp điện Hữu Nghị Việt Nam Silica gel 60 GF254 (0,040 – 0,063 mm) Merck Đức Bản mỏng silica gel 60 F254 Merck Đức Ống mao quản Merck Đức Hệ thống máy cô quay RE 200 Anh Hệ thống trích Soxhlet Đức Một số dụng cụ khác 1.2.2. Hóa chất  Bảng 6: Hóa chất sử dụng Tên Loại Nước sản xuất Petroleum ether 60-900 Tinh khiết Trung Quốc Ethyl acetate Tinh khiết Trung Quốc n–Hexan Tinh khiết Trung Quốc Methanol Tinh khiết Trung Quốc Chloroform Tinh khiết Trung Quốc n–Buthanol Tinh khiết Trung Quốc H2SO4 đậm đặc Tinh khiết Trung Quốc Nước cất Phòng nghiên cứu - Khoa Khoa Học Một số hóa chất khác 1.3. Phương pháp nghiên cứu Để hoàn thành các yêu cầu của đề tài luận văn, quá trình thực hiện gồm: - Thu thập và xử lý nguyên vật liệu: Mẫu cây Hydrocotyle bonariensis được lấy tại đường Ấp Bắc, Phường 5, Thành phố Mỹ Tho, Tỉnh Tiền Giang. Cây Hydrocotyle vulgaris được lấy tại đường Vành Đai Phi trường, Phường An Hòa, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ. - Ly trích tạo các cao thô từ lá và thân cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris theo hai phương pháp: Phương pháp trích lỏng – lỏng và phương pháp trích rắn – lỏng (trích bằng máy Soxhlet). - Định tính sự có mặt của các hợp chất họ flavonoid trong các cao trích. - Điều chế flavonoid thô từ cao methanol tổng của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris. - Cô lập flavonoid tự nhiên từ cao flavonoid thô bằng sắc ký cột với Silica gel 60 GF254 (0,040 – 0,063 mm) Merck (Đức). CHƯƠNG 2 ĐIỀU CHẾ VÀ ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU CAO 2.1. Lựa chọn và chuẩn bị nguyên liệu - Rau Má Lá Sen tươi Hydrocotyle bonariensis được thu hái tại khu vực 5, Phường 5, đường Ấp Bắc, Thành phố Mỹ Tho, Tỉnh Tiền Giang với khối lượng 20 kg. - Rau Má Lá Sen tươi Hydrocotyle vulgaris được thu hái tại đường Vành Đai Phi Trường, Phường An Hoà, Quận Ninh Kiều, Thành phố Cần Thơ với khối lượng 20 kg. - Đem về rửa sạch, loại bỏ rễ, các lá úa, sâu, các cây cỏ lẫn. - Sau đó đem phơi hong gió trong mát (tránh ánh nắng) cho khô héo rồi đem sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ khoảng 450C cho khô kiệt. - Tiếp tục đem xay nhuyễn thành bột bằng máy xay. - Ta thu được lượng bột Rau Má khô với số lượng như sau: cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle bonariensis 1,70 kg, cây Rau Má Lá Sen Hydrocotyle vulgaris 1,80 kg. - Cuối cùng cho riêng từng loại bột cây khô vào trong các túi vải và buộc kỹ. 2.2. Điều chế cao Các mẫu cao của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris sẽ được điều chế bằng 2 phương pháp: Phương pháp trích lỏng – lỏng và phương pháp trích rắn – lỏng. 2.2.1. Điều chế cao methanol tổng và cao nước (trích bằng phương pháp ngâm dầm) Cao methanol tổng và cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris sẽ được điều chế theo cùng một qui trình được thể hiện trong sơ đồ sau: Cây tươi 1. Bỏ lá sâu, héo, rửa sạch, phơi gió. 2. Sấy khô trong tủ sấy 450C, xay nhuyễn. Bột cây khô Bã 1. Ngâm dầm với nước cất. 2. Cô quay. 1. Ngâm dầm với Me. 2. Cô quay. Cao Me tổng Cao nước Sơ đồ 6: Điều chế cao methanol tổng và cao nước 2.2.1.1. Điều chế cao methanol tổng - Cao methanol tổng của cây Hydrocotyle bonariensis: Bột cây khô sau khi cho vào trong túi vải, được đem trích kiệt qua nhiều lần ngâm trích với tổng cộng 20 lít methanol ở nhiệt độ phòng. Đem dịch trích methanol, lọc qua giấy lọc và cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất kém, ta thu được cao methanol tổng màu xanh đậm. üKhối lượng cao methanol tổng thu được 125 gam. ü Thu suất điều chế cao methanol tổng của cây Hydrocotyle bonariensis so với bột cây khô (1,70 kg). H = 125 1700  x100% = 7,35% - Cao methanol tổng của cây Hydrocotyle vulgaris: Cao methanol tổng của cây Hydrocotyle vulgaris được điều chế tương tự như cây Hydrocotyle bonariensis, ta thu được cao methanol tổng của cây Hydrocotyle vulgaris có màu xanh đậm. üKhối lượng cao methanol tổng thu được 150 gam. üThu suất điều chế cao methanol tổng của cây Hydrocotyle vulgaris so với bột cây khô (1,80 kg). H = 150 1800  x100% = 8,33% ü Kết quả chấm sắc ký bản mỏng cao methanol tổng của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris với hệ giải ly Me:AcOH = 40:3, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H2SO4 10% trong methanol. Hình 6: Sắc ký bản mỏng cao Me tổng của cây Hydrocotyle bonariensis Hình 7: Sắc ký bản mỏng cao Me tổng của cây Hydrocotyle vulgaris 2.2.1.2. Điều chế cao nước Sau khi bột cây khô được trích kiệt với methanol tổng, bã bột cây được trích tiếp với nước cất (trích nhiều lần, cho tới khi dung dịch trong bình trở nên trong thì ngưng), đem dịch trích lọc qua giấy lọc và cô quay các dịch trích dưới áp suất kém, ta thu được cao nước với số lượng như sau: 73 gam cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis và 110 gam cao nước của cây Hydrocotyle vulgaris. üThu suất điều chế cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis so với bột cây khô (1,7 kg). H = 73 1700  x100% = 4,29% üThu suất điều chế cao nước của cây Hydrocotyle vulgaris so với bột cây khô (1,8 kg). H = 110 1800  x100% = 6,11% ü Kết quả chấm sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis và cây Hydrocotyle vulgaris với hệ giải ly Bu:AcOH:H+ = 4:5:1, nhúng bản mỏng vào thuốc thử H2SO4 10% trong methanol. Hình 8: Sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle bonariensis Hình 9: Sắc ký bản mỏng cao nước của cây Hydrocotyle vulgaris Þ Sau đây