Luận văn Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillussinh enzim protease từ đất vườn

chế phẩm.  Hoặc cho kết tủa enzim bằng muối trung tính hoặc cồn, ly tâm lấy cặn, rồi cho thêm chất ổn định, đem sấy khô, nghiền mịn và thu chế phẩm. 1.3.7.3. Thu chế phẩm enzim tinh khiết Việc tinh chế enzim có thể tiến hành qua nhiếu phương pháp. Đầu tiên loại các protein không hoạt động khỏi dịch enzim bằng phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH và nhiệt và tách chúng ra bằng cách ly tâm hoặc lọc bỏ kết tủa. Có thể phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ, muối, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion để thu những phần có hoạt lực enzim cao nhất. Sau đó cần làm sạch và sấy khô ( chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa) các chế phẩm enzim để có thể sử dụng lâu dài. Việc thu chể phẩm enzim tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể thường rất khó khăn và tốn kém nên chỉ dùng trong y học hoặc trong nghiên cứu. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tượng Các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được từ đất vườn. 2.1.2. Vật liệu 2.1.2.1. Thiết bị Tủ cấy và vô trùng Cân điện tử Máy ly tâm Kính hiển vi quang học Tủ khử trùng khô Nồi hấp thanh trùng Tủ ấm Bếp điện Máy lắc Máy đo so màu Ống nghiệm Đĩa petri Bình định mức Pipet 2.1.2.2. Hóa chất (NH4)2SO4 Aceton CaCO3 Cao nấm men Cao thịt Cazein CuSO4.5H2O Dung dịch Albumin HCl TCA Ethanol 960 FeSO4 Gelatin Glucose K2HPO4 KH2PO4 MnSO4 Na2CO3 Na2HPO4 NaCl NaOH Pepton Thạch Thuốc nhuộm fucsin Thuốc nhuộm tím Gentian Thuốc thử folin Tyrosin 2.2. Môi trường 2.2.1. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy (Môi trường MPA) [15] Cao thịt 3g/l Pepton 5g/l NaCl 5g/l Thạch 20g/l Nước cất 1000ml Khử trùng 1atm/30 phút 2.2.2. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [12],[17] Pepton 0.2 g Casein 4g Glucoza 0.05g MnSO4.4H2O 0,1g/l NaCl 3g K2HPO4 1.5g KH2PO4 1,5g Agar 15g Nước cất 1000ml Khử trùng 1atm/15 phút 2.2.3. Môi trường thử hoạt tính của enzym protease [15] Môi trường cơ sở Pepton 5g/l Cao nấm men 2,5g/l Glucose 10g/l Nước 1000ml 32 pH 5,5 – 7,8 2.3. Các dung dịch 2.3.1 Dung dich xanh metylen Loeffler Rượu etylic 300ml Xanh metylen 20g Hòa tan hổn hợp trên rồi lọc trong (1) Dịch lọc (1) 30ml KOH 1% 1ml Nước cất 1000ml 2.3.2 Đỏ trung tính 0.5% Đỏ trung tính 0.5g Nước cất 100ml Lọc trong trước khi dùng 2.4. Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp phân lập Trước khi lấy mẫu các dụng cụ lấy mẫu được thanh trùnh bằng cồn. Mẫu được lấy từ năm địa điểm khác nhau và trộn đều trước khi xác định (lấy khoảng 10g đất và 90 ml nước đã vô trùng cho vào bình tam giác 250 ml). Đun dung dịch đất cách thủy 10 -15 phút ở 800C để các vi khuẩn không sinh bào tử sẽ chết, số có bào tử còn lại sẽ sống. Do vậy Bacillus sẽ có chủ yếu trong dịch đun nóng. Đổ một lượng dung dịch đất vào hai đĩa petri : Một đĩa để một vài lát khoai tây, một đĩa để cỏ khô đã được cắt ngắn thành đoạn. Sau đó đưa đi nuôi cấy ở 370 C trong 24 đến 48g thấy xuất hiện trên bề mặt khoai tây váng màu xám nhạt và ở cỏ khô xuất hiện váng màu trắng đục. 33 2.4.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyền Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm là môi trường giữ giống. Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng và cấy zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 370C, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống. Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống. 2.4.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Chủng được quan sát trong môi trường rắn MPA bằng mắt thường và kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc. 2.4.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường rắn MPA  Khả năng phát triển của khuẩn lạc.  Bề mặt khuẩn lạc.  Màu sắc khuẩn lạc. 2.4.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống Được sử dụng để xác định hình dáng, sự sắp xếp của các tế bào cũng như khả năng di động của chúng Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đở, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật trên môi trường đặc, đặt vào chổ phiến kính, hòa nhẹ để tạo dịch huyền phù. Đậy nhẹ lá kính lên giọt dịch để tránh tạo bọt khí. Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô. Mọi thao tác cần tiến hành bằng các dụng cụ sạch, vô trùng và phải cạnh ngọn lữa đèn cồn. Đặt tiêu bản lên bàn kính quan sát với vật kính x40. 34 2.4.3.3. Phương pháp nhuộm gram [10] Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng rất phổ biến để theo dõi các đặc điểm hình thái, đếm số lượng vi khuẩn. Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magiê của axit riboleic. Khi nhuộm phức tạp, muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatinviolet, oryatanviolet, metylviolet) chịu được dưới tác dụng của cồn (không bị mất màu dưới tác dụng của cồn). Những vi khuẩn không bị mất màu là những vi khuẩn gram(+), ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu là vi khuẩn Gram (-) Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường đặc hoà vào giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính. Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất. Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, sau đó đổ thuốc đi và tráng bằng nước cất. Sau đó rửa bằng cồn 96o trong thời gian khoảng 30-40 giây. Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi. Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm. Chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram (+) để tiếp tục nghiên cứu. 35 2.4.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử [10] Để xác định sự hình thành bào tử ta sử dụng phương pháp sốc nhiệt: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh khối tế bào được hòa vào nước muối sinh lý. Sốc nhiệt ở 80-850C trong 15 phút. Sau khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm 370C khoảng 24g. Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử. Ta cũng có thể tiến hành nhuộm bào tử theo phương pháp sau: Cố định mẩu trên phiến kính sau đó nhỏ lên mẩu thuốc nhuộm xanh metylen hơ nóng trong 3 phút ( chú ý không để mẩu bị khô nếu khô phải nhỏ thêm). Rữa kỹ bằng nước, nhỏ tiếp thuốc nhuộm đỏ trung tính trong 1 phút rồi rữa kỹ. Hong khô phiến kính. Quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại x 1000 lần. Tế bào chất có màu hồng, bào tử bắt màu xanh. 2.4.4. Phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật độ quang Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang học được sử dụng rộng rãi. Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lững. Để đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical density). Tất cả các thí nghiệm được tiến hành đo ở bước sóng 620 nm (OD620) Cách tiến hành: chủng giống được nuôi ở 370C rồi cấy vào môi trường MPA lỏng. Đặt các bình trụ này vào máy lắc với nhiệt độ như trên với tốc độ 200 vòng /phút trong 24h. Sau đó lấy dịch vi khuẩn nuôi trong bình này để đo OD bằng máy so màu ở bước sóng 620 nm với kính lọc màu đỏ. Chú ý các thao tác lấy dịch để đo OD phải được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. 2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính catalase Nguyên tắc: catalase xúc tác phản ứng thuỷ phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và phóng thích phân tử ôxy (có hiện tượng sủi bọt). Hầu hết các 36 VSV hiếu khí đều có enzym catalase giúp loại trừ sự tích tụ chất độc đối với tế bào là H2O2 được tạo ra trong chuỗi hô hấp. Cách tiến hành: nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên khuẩn lạc, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dung dịch H2O2 3%. Dựa vào hiện tượng có sủi bọt (+) hay không (-) kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng, từ đó cho biết mỗi chủng có phải là vi khuẩn hiếu khí hay không. Chọn các chủng có hoạt tính catalase (+) hiếu khí để tiếp tục nghiên cứu. 2.4.6. Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng Chuẩn bị môi trường MPA có nồng độ muối khác nhau 5g, 10g, 15g... cấy vi sinh vật vào nuôi các bình này trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 24h. Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng. 2.4.7. Xác định khả năng thủy phân protein [10] Phương pháp này dùng để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn thu được. Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có chứa cơ chất cảm ứng là casein ở 370C trong khoảng 24 đến 48h trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau 24 giờ lấy dịch nuôi đem li tâm 5000 vòng/phút lấy dịch loại bỏ cặn. Đổ môi trường đặc có chứa casein với nồng độ tương tự vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lổ để đục lổ trên môi trường tạo thành giếng. Dùng pipetMan hút dịch li tâm cho vào giếng. Để đĩa trong tủ lạnh 3 - 4 tiếng để dịch khuyếch tán 370C. Sau 24giờ dùng thuốc thử HgCl2 đổ lên bề mặt thạch. Nếu có enzim nó sẽ tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa bị phân giải sẽ có màu trắng đục. 37 Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều. 2.4.8. Chạy PCR để xác định danh chủng vi khuẩn được chọn Trong 3 chủng chọn 1 chủng có khả năng sinh enzym và có tốc độ sinh trưởng tốt nhất cho chạy PCR để định danh. Phương pháp thực hiện: giải trình tự gen 16S rARN và tra cứu trên Blast search. Thành phần của phản ứng PCR: 10X PCR buffer (Invitrogen) : 12μl 20 mM dNTPs : 2μl Primer 1 (20mM) (mồi xuôi) : 1.25 μl Primer 2 (20mM) (mồi ngược) : 1.25 μl 50 mM MgCl2 (invitrogen) : 4μl Taq : 0.5 μl ADN khuôn mẩu : 0.5μl H2O đến 100μl :80.5 μl Nguyên tắc: khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác vi khuẩn. Cách thực hiện: Bước 1: lấy một ít khuẩn lạc được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch huyền phù tiến hành tách chiết AND bằng cách: đun sôi 5phút, để lạnh 5phút, ly tâm 5phút lấy dịch nổi. 38 Bước 2: cho dịch nổi thu được, primer, tad,dNTP, Mg2+ vào PCR mix để khuyếch đại gen 16s rARN. Phản ứng PCR gồm 3 bước:  Biến tính: trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94-950C trong vòng 30s-1phút.  Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30s-1phút.  Tổng hợp: nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút. Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR. Bước 4: Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II của Qiagen. Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16S. Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc:  Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide.  Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotide. Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. 39 Bước 6: tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự, điện di mao quản trên CEQ8000. Xuất kết quả giải trình tự để phân tích. Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH xác định tên vi khuẩn cần định danh. 2.4.9. Phương pháp thu chế phẩm enzym thô [16] Sau 40h nuôi cấy tiến hành chiết tách protease ngoại bào ở vi khuẩn bằng cách: Ly tâm dịch môi trường ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới). 2.4.10. Xác định hoạt độ của enzym protease theo phương pháp Anson[8] Nguyên tắc: Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic (TCA) và một số các axit amin. Các peptid và sản phẩm tạo thành có chứa Tyrosin, triptophan khi cho tác dụng với thuốc thử Folin tạo dung dịch có màu. Cường độ màu tăng cùng với nồng độ chất đem phản ứng, cường độ màu được ghi nhận bằng giá trị mật độ quang OD ở λ = 660nm. xác định lượng tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin. Hóa chất : Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6 : trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH cho đúng Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thủy 1g Casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml. Dung dịch TCA 10% : hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N : Hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 :2) 40 Dung dịch HCl 0,2N : trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml. Dung dịch tyrosin 20 mM/l : khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N : pha loãng 5ml dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml. Cách tiến hành : Dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 Dung dịch NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và ΔOD ( ΔOD = ODTN-OD KC).  Xác định hoạt tính enzym : Ống nghiệm thật là ống thí nghiệm, ống nghiệm không là ống kiểm chứng Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thật Không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 5 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,5 0C trong 30 phút 41 Dung dịch TCA 5% (ml) 5 0 Dung dịch enzym mẫu (ml) 0 1 Để yên lọc lấy dịch bên dưới Dung dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 Thuốc thử Folin 0.6 0.6 Lắc đều, để yên sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm. Tính ΔOD = ODTN-ODKC. dựa vào đồ thị chuẩn suy ra M tyrosine  Cách tính Hoạt tính protease: HT (UI) = vt KVX . .. (UI/ml) hoặc HT (UI) = mvt KVX .. .. (UI/g) X: là số M Tyrosine suy ra từ đường chuẩn V: Tổng thể tích hổn hợp phản ứng enzym (11ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml) K: độ pha loãng của mẫu. t: thời gian thủy phân (phút) m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g) 1UI = 1 micromol Tyrosine/ml/phút hoặc UI/g 2.4.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp protease của vi khuẩn. Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau:  Bổ sung Casein vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%. 42  Bổ sung bột đậu nành vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Bổ sung bột cá vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Trong 3 loại môi trường trên chọn loại cơ chất có nồng độ thích hợp cho hoạt tính enzim cao nhất. Sau đó bổ sung thêm CaCO3 ở các nồng độ khác nhau 0.3, 0.5, 1, 1.5% Cho 50ml môi trường vào bình tam giác khữ trùng ở 1atm/30 phút, để nguội sau đó cấy vi khuẩn vào với tỷ lệ 1-2%. Sau đó lắc ở 200 vòng/phút trong 40h ở 370C. Đo pH, đo độ sinh trưởng và hoạt độ protein chọn môi trường tốt nhất. 2.4.12. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn 2.4.12.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường thích hợp. Ly trích enzym thô có trong canh trường. Xác định hoạt tính của protease của môi trường bằng phương pháp Anson theo các khoảng thời gian nuôi cấy 28, 32, 36, 40, 44, 48. Dựa vào kết quả thu được xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men. 2.4.12.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Các chủng giống được nuôi ở 370C, sau đó cấy vào môi trường thích hợp trong bình trụ miệng nhỏ có chứa 50ml dịch với tỷ lệ 1-2%. Nuôi các bình này trong máy lắc ở các nhiệt độ 270C, 320C, 370C, 420C, 470C... với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian thích hợp. Đo OD, đo pH, hoạt độ protein để chọn nhiệt độ thích hợp. 43 2.4.12.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp. Tiến hành ly trích dịch enzym thô. Xác định hoạt tính của protease có trong canh trường ở mỗi pH môi trường khác nhau: 6,5; 7; 7,5; 8; 8.5 ... dựa vào kết quả thu được ta chọn pH môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease 2.4.12.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Đổ vào các bình tam giác có thể tích 250ml, 500ml dung địch lên men có thể tích khác nhau 50, 75, 100ml.. để ở nhiệt độ thích hợp trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian thích hợp. Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng. Đo pH, hoạt độ protein để chọn độ hiếu khí thích hợp 2.4.13. Phương pháp tách và thu nhận enzym protease bằng dung môi hữu cơ Tiến hành tủa với các tác nhân tủa: ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa, ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.  Đối với tác nhân tủa là aceton và ethanol 960 Cơ chế: Khi cho dung môi vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm giảm khả năng tan của nước bao quanh protein. Nguyên nhân cơ bản của sự tạo quần thể protein có thể do các lực tỉnh điện , lực VanderWaals. Người ta thấy rằng, ở gần điểm đẳng điện của protein, sự lắng diễn ra ở nồng độ dung môi hữu cơ thấp hơn. Khi cho dung môi hữu cơ vào để kết tủa có thể xãy ra hiện tượng biến tướng không thuận nghịch protein. Các phân tử protein chỉ thể hiện hoạt độ enzim khi nó tồn tại trong cấu trúc không 44 gian nhất định, sao cho các gốc phân cực phân bố trên bề mặt của phân tử protein , còn các gốc kỵ nước không phân cực thì nằm trong phân tử . Khi hằng số điện ly của môi trường giảm, phân tử protein có thể tự tháo gở và tạo thành dạng không hoạt động, trong đó các gốc kị nước lại tiếp xúc với dung môi. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình này. Do đó, thực hiện quá trình này phải ở trong điều kiện nhiệt độ thấp, thường ở 4 – 10 0C. Tiến hành: Bước 1: Thu dịch enzim từ canh trường ( mục ) giữ lạnh dịch enzim và dung môi hữu cơ ( aceton, ethanol 960) sao cho nhiệt độ đạt từ 0 – 40C. Khảo sát với tỷ lệ Ethanol: tỉ lệ 1:3 ( dung dịch enzim: cồn) Aceton: tỉ lệ 1:2 ( dung dịch enzim : aceton) Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ dung môi hữu cơ vào dung dịch enzim và khuất đều, giữ ở nhiệt độ lạnh 30 – 45 phút, ly tâm 4500 vòng / phút trong 15 phút thu tủa, sấy khô ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh.  Đối với tác nhân tủa là muối sulfate amon (NH4)2SO4 Cơ chế: Khi ta muối trung hòa ở nồng độ cao vào dung dịch có chứa protein thì protein sẽ tạo ra kết tủa. Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa. Các muối sunfat, trong đó (NH4)2SO4 được dùng nhiều nhất vì chúng rất dễ tan trong nước ngay ở nhiệt độ thường, giá thành lại rất rẻ, nhưng gặp khó khăn khi thu hồi, vì chúng có khả năng lẩn trong tủa protein. Tiến hành: Bước 1: Thu dung dịch enzim từ dịch nuôi cấy ( mục) 45 Bước 2: Tiền hành tủa: Cho g muối vào dung dịch enzim rồi khuấy đều, giữ ở nhiệt độ phòng 45 – 60 phút, ly tâm 4500vòng/ phút trong 15 phút, thu tủa. Bước 3: Chế phẩm enzim thô thu được còn lẫn nhiều muối. Thẩm tích qua màng thẩm tích là phương pháp dùng để tách các phân tử muối ra khỏi protein. Màng này chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ ( muối, đường...) khuyếch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzim). Màng thẩm tích thường làm bằng collodion hay celophan. Bước 4: Sấy khô chế phẩm enzim ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh. Hiệu suất thu nhận H = m/v Trong đó: m là khối lượng enzim thu được sau khi tủa V là thể tích dung dịch có chứa enzim trước tủa tính bằng ml. 2.4.14. Phương pháp xác định protease kiềm Lấy chế phẩm protease thu được cho tác động với cơ chất casein được pha trong các dung dịch đệm có độ pH khác nhau 6, 6.5, 7, 7,5 , 8....Xác định hoạt tính protease của chế phẩm theo phương pháp Anson.  pH 6,5 – 8: sử dụng đệm sorensen. pH 8.5 – 9.5: sử dụng đệm glyxin - NaOH [13] 2.4.15. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở những nhiệt độ khác nhau trong dãy nhiệt độ 350C, ...., 800C. Chon nhiệt độ tối ưu cho enzim phân giải cơ chất. 2.4.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở nhiệt độ và pH thích hợp nhưng thay đổi thời gian protease tác động lên cơ chất casein: 30- 100 phút. Chọn thời gian thủy phân thích hợp cho enzim. 46 2.4.17. Phương pháp nghiên cứu động học Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn có khả năng sinh trưởng tốt nhất và sinh enzym protease có hoạt tính cao nhất trong bình tam giác lên men 1l. Tiến hành nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, sinh trưởng và hoạt lực của enzym. 2.4.18. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Sử dụng toán xác suất thống kê để xử lý các số liệu thu được cho ra kết quả.  Xác định giá trị trung bình Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo: n x x n i  Trong đó: : giá trị của một lần đo ix x : giá trị trung bình n : số lần đo Nếu thực hiện sự đo đạc lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì chúng ta có thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật. Để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, ta phải dùng phương pháp thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo.  Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn  Độ lệch mẫu (Sample deviation): Là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. Độ lệch mẫu = xi - x Trong đó: 47 xi : giá trị của một lần đo. x : giá trị trung bình.  Độ lệch chuẩn (Standard deviation): Là sai số có thể có trong một lần đo. S  2i 1n xx    Với S : độ lệch chuẩn : giá trị của một lần đo ix x : giá trị trung bình n : số lần đo Vậy