Luận văn Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều – merrf ở người Việt Nam

nƣớc tiểu là 18%, cũng định lƣợng đột biến tƣơng tự trên mẹ và em gái cho thấy, ở mẹ có 16% gen đột biến trong máu và 18% trong nƣớc tiểu, kết quả của em gái là 3% gen đột biến trong máu và 4% trong nƣớc tiểu. Định lƣợng đƣợc tỷ lệ gen đột biến nhằm xác định mức độ ảnh hƣởng của bệnh đến cá thể mang đột biến. Tỷ lệ đột biến A8344G có tƣơng quan với sự giảm tổng hợp protein, giảm tiêu thụ oxy và thiếu cytochrome c oxidase, cũng nhƣ các polypeptid lớn và giàu lysine bị ảnh hƣởng nặng nề gợi ý rằng các đột biến MERRF trực tiếp hạn chế quá trình tổng hợp protein của ty thể. Hơn thế nữa, stress oxy hóa và oxy hóa trên các mô bị ảnh hƣởng bởi thiếu chuỗi hô hấp dẫn đến sự tiến triển các triệu chứng của bệnh ty thể [30]. Mặc dù đƣợc mô tả với các triệu chứng lâm sàng cơ bản của hội chứng MERRF bao gồm rung giật cơ, mất điều hoà, động kinh và sợi cơ màu đỏ rách nham nhở nhƣng đột biến A8344G có những biểu hiện kiểu hình không đồng nhất. Một nghiên cứu ở ngƣời phụ nữ 42 tuổi, ngoài các tính năng chính của hội chứng MERRF còn có nhiều triệu chứng khác nhƣ suy hô hấp và loạn dƣỡng cơ. Một số trƣờng hợp biểu hiện tầm vóc ngắn, mất thính lực, bệnh thần kinh ngoại biên, bệnh 26 cơ tim hoặc rối loạn chức năng ống thận. Kết quả nghiên cứu mối tƣơng quan giữa kiểu gen đột biến A8344G với kiểu hình MERRF cho thấy rằng đột biến này có thể biểu hiện kiểu hình khác, bao gồm cả triệu chứng lâm sàng của hội chứng Leigh, rung giật cơ kết hợp với u mỡ đối xứng và các bệnh đầu múi cơ [30]. 1.3.1.2. Đột biến T8356C Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc biết đến với đột biến A8344G, nhƣng không quan sát thấy trong khoảng 10 - 20% số bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tiêu biểu của hội chứng MERRF. Một nghiên cứu giải trình tự gen tRNAlys của năm bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng đƣợc xác định là rung giật cơ (hoặc động kinh), mất điều hòa và sợi cơ đỏ bị rách nham nhở, tiền s gia đình tƣơng thích với sự kế thừa bệnh từ mẹ, nghiên cứu tiền lâm sàng thấy nhiễm toan acid lactic, sinh thiết cơ cho thấy nhiều sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy có sự thay đổi nucleotide tại vị trí 8356 từ T chuyển thành C, làm gián đoạn một cặp base đƣợc bảo tồn trong phân t mtDNA gốc [51]. Mở rộng nghiên cứu về mức độ biểu hiện của bệnh cho thấy đột biến T8356C cũng tồn tại ở dạng không đồng nhất nhƣng sự phân bố của gen đột biến cũng rất khác nhau, kết quả phân tích trên 1 bệnh nhân mang đột biến trong cơ là 100% còn trong máu là 47%. Triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến này cũng khá phức tạp, có bệnh nhân xuất hiện triệu chứng rung giật cơ, động kinh, điếc và đột quỵ giả tai biến giống nhƣ hội chứng MELAS [6]. 1.3.1.3. Đột biến G8363A Năm 1996, nhóm nghiên cứu Filippo M. Santorelli và cộng sự [45] đã s dụng phƣơng pháp phân tích đa dạng cấu hình DNA sợi đơn (SSCP) và giải trình tự trực tiếp của tất cả 22 gen tRNA mã hóa mtDNA để phát hiện tình trạng đột biến trong 9 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng tƣơng tự nhƣ hội chứng MERRF bao gồm tăng acid lactic và pyruvic trong máu, rối loạn thần kinh ngoại biên, thất điều não, giảm thính lực, sinh thiết cơ cho thấy các sợi cơ đỏ bị xé rách. Kết quả cho thấy cả 9 bệnh nhân trong 2 gia đình đều mang đột biến thay đổi 27 nucleotide A bằng G tại vị trí 8363 trên mtDNA. Phân tích RFLP cho thấy rằng đột biến tồn tại ở dạng không đồng nhất và có mức độ phân bố ở các mô khác nhau nhƣ ở cơ là 95%, ở máu là 59 - 94% [49]. Sự khiếm khuyết một hay nhiều phần của chuỗi phản ứng phosphoryl hóa (OXPHOS) trong quá trình trao đổi chất ở tế bào cơ của bệnh nhân mang đột biến G8363A gây ra sự suy giảm tổng hợp protein của ty thể, do đột biến nằm trên gen tRNA lys. Sự thiếu hụt lysine sẽ ảnh hƣởng đến các tiểu đơn vị trong chuỗi hô hấp của tế bào, ảnh hƣởng trực tiếp đến phức hợp I và phức hợp IV của chuỗi hô hấp. Nghiên cứu sâu hơn cho thấy sự hiện diện của các peptid bất thƣờng trong nguyên bào sợi da của một bệnh nhân mang đột biến G8363A [45, 49, 57]. Những biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân mang đột biến A8363G cũng không đồng nhất, ở một số bệnh nhân có triệu chứng tâm thần chậm phát triển, mất thính giác, nhiều u mỡ,... đƣợc chẩn đoán giống hội chứng Leigh. 1.3.2. Những tác động của hội chứng MERRF trên ngƣời bệnh Ty thể là bào quan s dụng oxy để chuyển hóa các sản phẩm trung gian của thức ăn thành năng lƣợng thông qua một quá trình phosphoryl oxy hóa. Những đột biến gây MERRF làm suy giảm khả năng của ty thể trong việc tạo ra các protein, s dụng oxy và sản xuất năng lƣợng. Những đột biến này ảnh hƣởng đến các cơ quan và các mô với nhu cầu năng lƣợng cao nhƣ não và cơ. Bệnh thƣờng biểu hiện trong các mô và dễ dàng phát hiện trong mtDNA từ bạch cầu trong máu [37]. Tuy nhiên, sự xuất hiện của dạng không đồng nhất có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện ở các mô mang đột biến. Do đó những ngƣời có triệu chứng ít phù hợp với MERRF có thể không đƣợc phát hiện từ bạch cầu mà chỉ phát hiện ở các mô khác nhƣ nguyên bào sợi da nuôi cấy, niêm mạc miệng,... nhƣng đáng tin cậy nhất là phát hiện từ các tế bào cơ xƣơng [38]. Hội chứng MERRF thƣờng đƣợc chẩn đoán lâm sàng dựa trên các triệu chứng bao gồm: tăng nồng độ lactate, pyruvate trong máu và trong dịch não tủy. Protein dịch não tủy có thể tăng lên trong hội chứng MERRF. Kỹ thuật chụp ảnh não nhƣ 28 hình ảnh cộng hƣởng từ có thể tìm thấy các tổn thƣơng nhƣ đột quỵ. Điện tâm đồ có thể đƣợc s dụng để chẩn đoán bất thƣờng về tim. Bảng 1.1 liệt kê các triệu chứng và dấu hiệu thấy đƣợc trong 62 bệnh nhân mang đột biến MERRF [70]. Các đặc điểm lâm sàng thƣờng gặp nhất có tỷ lệ tƣơng ứng là: giật cơ, yếu cơ, mất điều hòa (35 - 45%); động kinh tổng quát, mất thính lực (25,0 - 34,9%); suy giảm nhận thức, nhiều u mỡ, bệnh thần kinh, không dung nạp tập thể dục (15,0 - 24,9%); tăng CK, teo dây thần kinh thị giác, teo cơ, suy hô hấp, tiểu đƣờng, đau cơ, run, và chứng đau n a đầu (5,0 - 14,9%) [70]. 29 Bảng 1.1: Các biểu hiện và triệu chứng lâm sàng của 62 bệnh nhân MERRF [70] Biểu hiện lâm sàng Tần số xuất hiện Tỷ lệ % Giật cơ 62/62 100% Động kinh 62/62 100% Phát triển ban đầu bình thƣờng 17/17 100% Sợi cơ đỏ rách nham nhở 47/51 92% Giảm thính lực 41/45 91% Tăng acid lactic máu 24/29 83% Tính kế thừa theo dòng mẹ 34/42 81% Không dung nạp tập thể dục 8/10 80% Mất trí 39/52 75% Bệnh thần kinh 17/27 63% Ngƣời thấp bé 4/7 57% Giảm cảm giác 9/18 50% Liệt dây thần kinh thị giác 14/36 39% Bệnh cơ tim 2/6 33% Hội chứng Wolff- Parkinson-White 2/9 22% Bệnh võng mạc sắc tố 4/26 15% U mỡ 2/60 3% Những tác động của hội chứng MERRF lên bệnh nhân là khá đa dạng, phức tạp và không đồng nhất. Các rối loạn của hội chứng MERRF ảnh hƣởng đến nhiều 30 bộ phận của cơ thể, đặc biệt cơ bắp và hệ thần kinh, triệu chứng xuất hiện từ thời thơ ấu hay tuổi vị thành niên. Vì vậy việc phân tích mtDNA là quan trọng ở nhiều trƣờng hợp có sự rối loạn hệ thống không rõ ràng. 1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện đột biến MERRF 1.3.3.1. Phát hiện đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng PCR kết hợp với RFLP [25, 30, 45] Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA đƣợc phân cắt giới hạn. Phƣơng pháp này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme giới hạn (restriction enzyme) phân cắt đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA. Sự thay đổi về trình tự nucleotide của DNA dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn DNA bị phân cắt có kích thƣớc khác nhau, có thể nhận biết đƣợc dựa trên phổ băng khi điện di. Theo đó, khi đột biến xuất hiện trong trình tự của DNA tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn DNA khi đƣợc cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tƣợng này đã tạo ra sự khác biệt trong chiều dài của các đoạn DNA mà khi điện di chúng trên gel thì có thể phát hiện đƣợc các đột biến. Kỹ thuật RFLP đã trở nên đơn giản hơn nhờ có sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reation). PCR là kỹ thuật phối hợp khả năng lai đặc hiệu của DNA và khả năng kéo dài chuỗi của DNA polymerase để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên gấp nhiều lần so với ban đầu. DNA polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khuôn - mồi, trong môi trƣờng thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khuôn. Vì vậy, để nhân bản đƣợc đoạn DNA đích, ngƣời ta cần thiết kế các cặp mồi (primers) đặc hiệu. Đây là một kỹ thuật rất nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA khuôn (ng hoặc thấp hơn) phản ứng cũng có thể diễn ra. Việc kết hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho phát hiện các đột biến di truyền, trong đó có đột biến điểm trên gen ty thể. PCR-RFLP là công cụ chẩn đoán sớm đƣợc s dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong 31 mtDNA. Phƣơng pháp này bao gồm các bƣớc chính sau: (1) đoạn mtDNA chứa vị trí đột biến đƣợc khuếch đại nhờ các đoạn mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu; (2) sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn DNA cắt đƣợc điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide không biến tính, nhuộm ethidium bromide (EtBr) và đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Việc lựa chọn enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện đột biến điểm trong mtDNA. Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn DNA chứa đột biến hoặc đƣợc chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định đƣợc đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt với enzyme. Trong hầu hết các phòng thí nghiệm lâm sàng, PCR-RFLP là phƣơng pháp phổ biến nhất đƣợc s dụng để phát hiện nhanh các đột biến điểm gen ty thể. Đây là phƣơng pháp đơn giản và hiệu quả để phát hiện đột biến mtDNA khi sàng lọc với số lƣợng mẫu lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có độ nhạy tƣơng đối, đôi khi đột biến khó đƣợc phát hiện vì sự có mặt của các băng DNA mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ mtDNA đột biến trong mẫu thấp [26]. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide là 5-10% [8]. 1.3.3.2. Phân tích đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng xác định trình tự gen [10] Kỹ thuật giải trình tự đƣợc s dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến trong hệ gen ty thể. Xác định trình tự nucleotide có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn loại đột biến trên DNA ty thể. Tuy vậy kỹ thuật này tốn nhiều thời gian và chi phí cao, vì vậy nó thƣờng đƣợc s dụng để khẳng định chắc chắn sự có mặt của các đột biến trong đó có đột biến điểm mtDNA. 1.3.3.3. Kỹ thuật đa dạng cấu hình sợi đơn SSCP (single-stranded conformational polymorphism)[12] Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Các cấu hình khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Vì vậy, khi xuất hiện 32 đột biến trong phân t mtDNA sẽ làm thay đổi cấu trúc bậc hai, cho phép phân tách sợi DNA đột biến và không đột biến. Phƣơng pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chƣa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rối loạn mtDNA. 1.3.3.4. Định lượng đột biến MERRF bằng phương pháp real-time PCR [19, 52] Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở đo tín hiệu huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau. Dựa vào đặc điểm này có thể xác định số bản sao DNA đích có trong mẫu nghiên cứu dựa trên mối quan hệ của mẫu chuẩn đã biết rõ số lƣợng DNA đích ban đầu và mẫu nghiên cứu với giá trị chu kỳ ngƣỡng [5, 8]. Ƣu điểm chính của real-time PCR là cho phép xác định số bản sao ban đầu của mẫu DNA ở tỷ lệ thấp với độ chính xác và độ nhạy cao. Kết quả real-time PCR có thể tính sự có mặt hay vắng mặt của alen hoặc định lƣợng số bản sao. Ngoài ra, lƣợng sản phẩm DNA đích có thể theo dõi đƣợc sau mỗi chu kỳ mà không cần kiểm tra bằng phƣơng pháp điện đi [5, 8]. 1.3.3.5. Phát hiện đột biến DNA ty thể bằng hệ thống cảm biến sinh học [71] Biochip là một kỹ thuật mới, đƣợc s dụng trong sàng lọc phát hiện các đột biến mtDNA, với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng vi tính. Để sản xuất các chip DNA, các cặp mẫu dò đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng loại đột biến, bao gồm mẫu dò cho trình tự bình thƣờng và mẫu dò cho trình tự đột biến. Mẫu dò đƣợc cài trên phiến kính một cách tự động, mỗi phiến kính với diện tích khoảng 1 cm2 có thể chứa hàng trăm đến hàng ngàn mẫu dò khác nhau. DNA khuôn đƣợc đánh dấu và lai với các mẫu dò. Các phƣơng pháp đánh dấu bao gồm 33 gắn trực tiếp chất đánh dấu vào DNA khuôn, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Ở Việt Nam, một bệnh nhân MELAS mang đột biến A3243G đã đƣợc phát hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và tập thể [4] bằng phƣơng pháp PCR-RFLP và giải trình tự nucleotide. Năm 2014, Trƣơng và tập thể [55] đã s dụng phƣơng pháp PCR-RFLP sàng lọc 106 bệnh nhân cơ não tuy nhiên các tác giả không phát hiện đƣợc trƣờng hợp nào mang đột biến thuộc hội chứng MERRF. Nhƣ vậy đột biến MERRF ở bệnh nhân Việt Nam đã đƣợc nghiên cứu tuy nhiên các thông tin có đƣợc còn hạn chế. Vì thế, việc mở rộng nghiên cứu phát hiện đột biến này ở ngƣời Việt Nam, đặc biệt là việc định lƣợng mức độ không đồng nhất về kiểu gen đột biến để đƣa ra mối tƣơng quan giữa tỷ lệ đột biến và biểu hiện lâm sàng của bệnh là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. 34 CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm Mẫu máu ngoại vi của 312 bệnh nhân ngƣời Việt Nam nghi bị bệnh ty thể (Phụ lục 1) đƣợc lấy từ Bệnh viện Nhi Trung ƣơng. Các mẫu máu đƣợc bảo quản ở -80 o C. Trong nghiên cứu này, các bệnh nhân đƣợc nghi ngờ mắc hội chứng MERRF dựa trên sự có mặt của ít nhất hai trong ba đặc điểm sau: - Tác động lâm sàng liên quan đến các cơ quan: hệ thần kinh trung ƣơng, cơ xƣơng và cơ tim, tuyến nội tiết, mắt và hệ tiêu hóa. - Tăng acid lactic trong máu hoặc dịch não tủy. - Hình ảnh chụp cộng hƣởng từ não không bình thƣờng. 2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có và không mang đột biến A8344G là sản phẩm của đề tài KC.04.10/11-15 Các kit tách chiết DNA tổng số đƣợc mua từ hãng Qiagen; các cặp mồi và mẫu dò đƣợc mua từ hãng Integrated DNA Technologies; thang chuẩn DNA, hỗn hợp dNTP; (Enzynomics, Hàn Quốc); enzyme giới hạn đƣợc mua từ hãng Thermoscientifics, Kapa probe fast qPCR, Master Mix đƣợc mua của hãng Kapabiosystems. Các hóa chất còn lại đều đƣợc mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân t . 2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ Các máy móc chính dùng trong nghiên cứu bao gồm: máy NanoDropTM 8000, máy PCR gradient (Eppendorff), máy real-time PCR iQTM 5 cycler (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) và hệ thống chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad). 35 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số đƣợc tách và tinh sạch từ máu ngoại vi của các bệnh nhân theo QIAamp DNA Mini Kit của Qiagen. Quy trình thực hiện nhƣ sau: Hỗn hợp tách DNA chứa 20 µl protease Qiagen, 200 µl mẫu máu, 200 µl đệm AL và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp đƣợc trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây để thu đƣợc một dung dịch đồng nhất và đƣợc ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau đó hỗn hợp đƣợc ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp đƣợc bổ sung 200 µl ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống đƣợc chuyển vào cột Qiagen, ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc bổ sung 500 µl AW1 và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột tiếp tục đƣợc cho thêm 500 µl AW2, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột đƣợc loại bỏ. Cột đƣợc chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và đƣợc bổ sung 150 µl nƣớc cất vô trùng và để yên trong 1 phút, sau đó đƣợc ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là DNA tổng số. Mẫu đƣợc bảo quản ở -20oC cho đến khi s dụng. 2.3.2. Kiểm tra và định lƣợng DNA tách chiết Sự có mặt của DNA đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. 5 µl DNA đƣợc trộn với 1 µl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 µg/ml), tra lên giếng gel agarose 1% trong đệm TAE 1X. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel, các băng DNA đƣợc phát hiện dƣới ánh sáng t ngoại. Nồng độ của DNA tách chiết đƣợc định lƣợng bằng cách đo mật độ hấp thụ ánh sáng t ngoại của các acid nucleic ở bƣớc sóng 260 nm (A260) trên máy Nano- Drop. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng t ngoại ở bƣớc sóng 260 nm (A260) của các phân t DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 260 nm của các phân t DNA, với hệ số A260 = 1 tƣơng đƣơng với hàm lƣợng DNA sợi đôi là 50 μg/ml, s dụng công thức C = A260 x 50 x n (trong đó n là số lần pha loãng) để định lƣợng DNA có trong mẫu tách chiết. 36 Phƣơng pháp này đơn giản, nhanh, nhƣng có hạn chế là giá trị đọc đƣợc về độ hấp thụ có thể bị ảnh hƣởng khi trong mẫu chứa RNA và protein. Vì vậy, trong thực tế phƣơng pháp này thƣờng đƣợc dùng để định lƣợng các mẫu DNA tinh khiết, tỉ số A260/A280 đƣợc s dụng để đánh giá độ sạch DNA của chế phẩm. DNA đƣợc cho là sạch khi giá trị A260/A280 nằm trong khoảng 1,8 - 2,0. 2.3.3. Nhân bản đoạn gen ty thể bằng kỹ thuật PCR Đoạn gen ty thể mang đột biến MERRF đƣợc khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với các cặp mồi đặc hiệu đã đƣợc thiết kế và chế độ nhiệt thích hợp. Khuôn cho phản ứng PCR là DNA tổng số đƣợc tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân. Theo tính toán lý thuyết, các đoạn gen chứa đột biến sẽ đƣợc nhân lên bằng kĩ thuật PCR với kích thƣớc 212 bp (đột biến A8344G), 220 bp (đột biến T8356C), 241 bp (đột biến G8363A). Thành phần của phản ứng PCR bao gồm: 2,5 µl đệm Taq DNA polymerase 10X; 1 µl Taq DNA polymerase (5 đơn vị/ µl); 2,5 µl dNTPs 2 mM; 1 µl mồi xuôi 10 pmol; 1 µl mồi ngƣợc 10 pmol; 2 µl DNA khuôn (40 - 45 ng/µl) và 15 µl ddH2O cho tổng thể tích 25 µl. Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, đặt vào máy PCR và tiến hành chạy với 3 bƣớc chính: biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Chu trình nhiệt đƣợc thiết lập nhƣ bảng 2.1. Bảng 2.1: Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR các đoạn gen mang đột biến MERRF Chu trình nhiệt oC Thời gian Biến tính khởi động 95 4 phút 35 chu kỳ Biến tính 94 30 giây Gắn mồi * 30 giây Kéo dài 72 30 giây Kéo dài hoàn tất 72 5 phút Bảo quản mẫu 4 + ∞ (* là nhiệt độ gắn mồi, MRAG là 58oC, MRTC là 60oC, MRGA là 53oC) 37 Mẫu đối chứng âm tính (không chứa DNA) đƣợc đặt cùng thí nghiệm để kiểm tra khả năng nhân bản không đặc hiệu. Sản phẩm phản ứng sau đó đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 2%. Sau khi PCR kết thúc, 5 µl sản phẩm đƣợc trộn đều với 1 µl dung dịch đệm tra mẫu có chứa ethidium bromide ở nồng độ 50 µg/ml, tra lên giếng gel đã chuẩn bị trong đệm TAE 1X. Thang chuẩn DNA 100 bp đƣợc điện di song song cùng với mẫu. Điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho đến khi vạch màu cách mép bản gel khoảng 2 cm. Bản gel chứa các băng DNA đƣợc quan sát trên máy soi và chụp ảnh bằng hệ thống Geldoc (Biorad). 2.3.4. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP) Đoạn gen chứa đột biến đƣợc nhân bản bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR sau khi đã kiểm tra trên gel agarose 2% đƣợc cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn trong đệm tƣơng ứng (reaction buffer). Phản ứng cắt đƣợc thực hiện với thành phần nhƣ sau: 1 µl đệm enzyme giới hạn 10X; 0,5 µl enzyme giới hạn (50 đơn vị/µl); 7,5 µl sản phẩm PCR và 6,25 µl ddH2O cho tổng thể tích 15 µl, hỗn hợp phản ứng đƣợc giữ ở 37ºC, từ 12-16 giờ. Sau đó, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 12% và đột biến đƣợc phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dƣới ánh sáng t ngoại. 2.2.5. Điện di trên gel agarose Kỹ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trƣờng tác động vào các phân t tích điện và kích thƣớc lỗ của thể nền (gel). Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân t (polymer) đƣợc liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lƣới với kích thƣớc các mắt lƣới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân t (agarose, polyacrylamide) và phản ứng tạo liên kết chéo. Các phân t đƣợc phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trƣờng tác động lên chúng, kích thƣớc của phân t so với kích thƣớc lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân t . 38 Gel agarose 2% đƣợc chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Sản phẩm PCR DNA đƣợc trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di đƣợc thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại (kích thƣớc bản gel agarose 2% chiều dài và chiều rộng là 5x6 cm) Sau khi kết thúc điện di, bản gel đƣợc lấy ra ngâm dƣới ethidium bromide ở nồng độ 50 μg/µl 5-7 phút và soi dƣới ánh sáng t ngoại của máy soi chụp ảnh Geldoc (Biorad). Để phƣơng pháp quan sát DNA trong gel agarose thuận lợi nhất, dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr để nhuộm gel. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dƣới tia UV, cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhƣng khả năng xác định gel trực tiếp dƣới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ƣu thế rõ rệt. 2.2.6. Điện di trên gel polyacrylamide Trong nghiên cứu này, gel polyacrylamide 12% đƣợc s dụng với các thành phần nhƣ trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Thành phần bản gel polyacrylamide 12% STT Thành phần Thể tích 1 Dung dịch acrylamide 30% 2 ml 2 TAE 5X 1 ml 3 APS 10% 35 μl 4 TEMED 3,5 µl 5 Nƣớc cất kh trùng 1.965 µl Tổng thể tích 5 ml Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn đƣợc trộn với đệm mẫu và tra vào đƣờng chạy điện di trong đệm TAE 0,5X với 39 hiệu điện thế ổn định 10 volt/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 3 cm thì dừng lại (kích thƣớc bản gel polyacrylamide chiều dài và chiều rộng là 10x8 cm). Gel đƣợc nhuộm bằng EtBr hòa trong nƣớc, sau khoảng 5 phút, bản gel đƣợc lấy ra, r a dƣới vòi nƣớc và soi dƣới ánh sáng t ngoại của máy soi chụp gel IQ5 (Biorad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dƣới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen. 2.2.7. Kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh quang dạng khóa cầu acid nucleic (LNA - locked nucleic acid) Trong thí nghiệm này, đột biến A8344G đƣợc định lƣợng bằng phƣơng pháp real-time PCR s dụng mẫu dò huỳnh quang có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu trên DNA đích, đầu 5’ của mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang (reporter) FAM (495/520 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự không đột biến và HEX (535/556 nm) cho mẫu dò đặc hiệu với trình tự đột biến, còn đầu 3’của mẫu dò có gắn chất hấp phụ tƣơng ứng (quencher) là IBFQ (Iowa black fluorescence quencher). Ngoài ra, để tăng nhiệt độ tách chuỗi (Tm) và tính đặc hiệu của mẫu dò, trong trình tự của mẫu dò còn có cải biến bằng nucleotide dạng khóa (locked nucleic acid) (Hình 2.1). Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide cải biến dạng LNA Nguyên tắc của phƣơng pháp: Mẫu dò huỳnh quang bao gồm một đoạn nucleotide bắt cặp đặc hiệu với trình tự đích. Khi chƣa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì mẫu dò Taqman vẫn còn nguyên vẹn, 40 huỳnh quang phát ra từ reporter sẽ bị quencher hấp phụ do nguyên lý cộng hƣởng năng lƣợng huỳnh quang (nguyên lý FRET), ống phản ứng sẽ không phát đƣợc huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu có sự xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì mẫu dò huỳnh quang sẽ bắt cặp với khuôn và bị hoạt tính 5’-exonuclease của enzyme Taq DNA polymerase cắt bỏ để kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung, do vậy reporter sẽ rời xa quencher và phát huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích (Hình 2.2). Sự phân cắt của mẫu dò trong quá trình PCR đã giải phóng reporter làm tăng mật độ huỳnh quang. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lƣợng reporter tự do càng nhiều và cƣờng độ huỳnh quang phát ra càng lớn và máy sẽ ghi nhận đƣợc. Hình 2.2. Nguyên lý hoạt