Luận văn Nghiên cứu quá trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine

e lớn hơn nhiều so với chủng bố mẹ [12]. Như vậy, để tăng khả năng sản xuất L-lysine của vi sinh vật, đa số tác giả chọn giải pháp can thiệp vào hệ gen. Tuy nhiên, chủng đột biến có nhược điểm là dễ thoái hóa, sản lượng không ổn định, gen đột biến dễ phát tán. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men và kỹ thuật lên men fed-batch để nâng cao năng suất thu nhận L-lysine. 1.3.5. Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum 1.3.5.1. Thiết kế môi trường lên men Thiết kế môi trường lên men là bước rất quan trọng quyết định sự thành công trong lên men vi sinh vật. Thành phần môi trường phải đảm bảo đủ lượng để phục vụ cho việc tăng sinh khối, tạo các chất trao đổi và cung cấp đủ năng lượng cho việc duy trì mật độ tế bào cũng như sinh tổng hợp. Môi trường lên men được thiết kế tùy thuộc vào yêu cầu của chủng vi sinh vật, phương pháp lên men và sản phẩm mục tiêu. Phương trình cân bằng vật chất trong lên men được thể hiện như sau: C + N + O2 + các yếu tố khác = sinh khối + sản phẩm + CO2 + H2O + nhiệt Thành phần môi trường bao gồm các yếu tố đa lượng (C, N) và các yếu tố vi lượng (muối khoáng, vitamine, chất kiểm soát). Dựa vào thành phần và hàm lượng các chất trong tế bào vi sinh vật để thiết kế thành phần môi trường lên men. Trong tế bào vi sinh vật, C chiếm khoảng 50% trọng lượng khô của tế bào. Các nguyên tố C, N, H, O chiếm tổng cộng khoảng 92%, còn lại là các yếu tố vi lượng [2]. Những yếu tố có hàm lượng cao là những yếu tố ảnh hưởng 24 lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Vì vậy trong môi trường lên men, hàm lượng C, N thường cao hơn rất nhiều so với các nguyên tố vi lượng. 1.3.5.2. Ảnh hưởng của các thành phần môi trường lên men Nước: tế bào vi sinh vật chứa 70% là nước [2], mọi hoạt động sống của vi sinh vật như đồng hóa, dị hóa đều diễn ra trong môi trường nước. Do vậy, nước là yếu tố quan trọng không thể thiếu trong các quá trình lên men. Ngoài ra, nước còn cần thiết cho những hoạt động khác trong quá trình lên men như: gia nhiệt, giải nhiệtNước sử dụng trong môi trường lên men phải là nước đã được loại bỏ hoàn toàn các ion khoáng để không làm thay đổi hàm lượng khoáng trong môi trường lên men. Nguồn carbon: carbon có ảnh hưởng đến sự hình thành sinh khối, các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp của vi sinh vật. Sản xuất L-lysine bởi Corynebacterium glutamicum ở quy mô phòng thí nghiệm, nguồn carbon được chọn thường tinh khiết (glucose), nhưng trong sản xuất công nghiệp thường dùng nguồn carbon rẻ tiền có nguồn gốc tự nhiên như: bột ngô, bột ngũ cốc, mật rỉ đường mía hoặc củ cải. Những nguồn carbon này chứa nhiều tạp chất nên cần chế biến loại bỏ các thành phần tạp chất có ảnh hưởng không tốt đến vi sinh vật trước khi đưa vào sử dụng. Khi khử trùng môi trường lên men cần tách riêng nguồn đường khử và nguồn nitơ hữu cơ vì phân tử đường glucose sẽ dễ dàng phản ứng với gốc –NH2 trong amino acid (phản ứng caramen hóa) tạo ra hợp chất có màu nâu đen, gây ức chế sinh trưởng tế bào. Nguồn nitơ: nitơ có vai trò quan trọng trong giai đoạn hình thành sinh khối, tham gia vào nhiều cấu trúc tế bào. Ở quy mô phòng thí nghiệm, nguồn nitơ vô cơ được lấy từ các muối ammonium, muối nitrate, nitrite, nitơ hữu cơ được lấy từ cao nấm men, peptone, dịch chiết bắpTrong đó, dịch bắp là nguồn cung cấp carbon, nitơ và các amino acid nên thường được dùng trong công nghiệp. Đối với chủng Corynebacterium glutamicum mang đột biến khuyết dưỡng methionine và threonine, người ta sử dụng dịch thủy phân đậu nành để bổ sung methionine và threonine thay vì nguyên liệu tinh khiết, đắt tiền. Các nguyên tố vi lượng: các nguyên tố vi lượng được sử dụng với hàm lượng vô cùng ít trong môi trường lên men nhưng lại có vai trò quan trọng đối với vi sinh vật, vì tham gia vào cấu trúc một số enzyme hô hấp (Cu, Fe), hoạt hóa nhiều enzyme (Mn). Zn 25 tham gia vào cấu trúc của nhiều enzyme như DNA polymerase, RNA polymerase, nối các tiểu đơn vị protein trong việc hình thành cấu trúc đặc biệt cho hoạt động của enzyme. Photpho là một trong những nguyên tố khoáng quan trọng vì tham gia vào liên kết cao năng lượng và vận chuyển glucose qua màng tế bào [4]. pH: ion H+ trong môi trường lên men có thể làm thay đổi trạng thái điện tích của tế bào, làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với một số ion nhất định và gây ức chế các enzyme có mặt trên màng tế bào. pH 7,0 là điều kiện tối ưu nhất để Corynebacterium glutamicum sản sinh L-lysine [7], vì thế, môi trường nuôi cấy cần được duy trì ở mức pH này. Việc bổ sung CaCO3 sẽ giúp pH môi trường ổn định. Khi pH giảm, gốc -CO3 bị phân hủy để hiệu chỉnh pH ổn định. Ngoài ra, việc bổ sung CaCO3 vào môi trường lên men còn có vai trò đối với khả năng thẩm thấu của tế bào. Lượng oxy: oxy là chất nhận H+ cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Oxy có thể được cung cấp bằng cách lắc đảo bình lên men, khuấy trộn hoặc dẫn khí vô trùng vào bình lên men. Corynebacterium glutamicum là vi khuẩn hiếu khí, vì vậy, việc cung cấp oxy với nồng độ thích hợp là yếu tố quan trọng quyết định năng suất L-lysine. 1.3.5.3. Những yếu tố cần kiểm soát trong lên men fed-batch Kiểm soát pH: trong quá trình lên men, pH môi trường có thể giảm do sự có mặt của các sản phẩm trao đổi chất được sinh ra. Vi sinh vật rất nhạy cảm với sự thay đổi pH môi trường nên cần phải kiểm soát pH trong suốt quá trinh lên men để đảm bảo mọi hoạt động sinh lý trong tế bào diễn ra bình thường. pH tối thích của môi trường là pH tối thích cho hệ enzyme của chủng nuôi cấy. Trong lên men fed-batch sản xuất amino acid, dung dịch ammoniac NH3 thường được chọn để hiệu chỉnh pH vì khi bổ sung vào canh trường không những đưa pH về mức ban đầu mà còn là nguồn cung cấp nitơ cho vi khuẩn. Trong lên men công nghiệp, người ta sử dụng hệ thống kiểm soát pH tự động. Kiểm soát lượng oxy hòa tan: đối với lên men thu nhận amino acid, nếu sự thiếu oxy xảy ra trong pha log sẽ hình thành nên các sản phẩm phụ như acid lactic gây ảnh hưởng đến hiệu suất lên men, đồng thời gây ức chế, ảnh hưởng đến hoạt tính của chủng. Vì vậy cần phải sục khí, khuấy trộn để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho hô hấp của chủng nghiên cứu. 26 Kiểm soát tốc độ bổ sung cơ chất: nồng độ cơ chất là yếu tố quan trọng trong lên men fed-batch. Vì vậy cần phải kiểm soát nồng độ cơ chất trong nồi lên men không quá cao cũng không quá thấp. Có thể bổ sung cơ chất theo kiểu liên tục hoặc gián đoạn. Kiểm soát sự tạo bọt: trong điều kiện lên men có sục khí, lắc đảo hoặc sử dụng mật rỉ đường thường gây hiện tượng tạo bọt. Bọt tách tế bào vi khuẩn ra khỏi dịch lên men làm giảm sinh khối, tế bào không được tiếp xúc với điều kiện dinh dưỡng nên giảm hoạt tính ảnh hưởng đến năng suất lên men. Để kiểm soát bọt, có thể dùng phương pháp hóa học hoặc cơ học. Nghiên cứu này sử dụng Tween 20 để kiểm soát sự tạo bọt trong bình lên men. 1.4. Những nghiên cứu trong và ngoài nước liên quan đến hướng của đề tài Những nghiên cứu về lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine chưa được nghiên cứu nhiều trong nước. Vì vậy, chúng tôi chỉ đề cập đến những nghiên cứu của các tác giả nước ngoài. Tác giả Jianzhong Xu (2014) tiến hành lên men fed-batch chủng Corynebacterium glutamicum Lys5-8 trong môi trường có nguồn cơ chất là glucose, rỉ đường củ cải và dịch bắp. Sau 36 giờ nuôi cấy, lượng L-lysine thu được đạt 896 ± 33,41mM, tương đương 131 ± 4,8g/L. Dung dịch bổ sung trong quá trình lên men fed-batch bao gồm: glucose 800g/L, (NH4)2SO4 400g/L. Nồng độ glucose duy trì trong dịch lên men khoảng 20-30g/L. Điều chỉnh pH ở mức 7,0 bởi dung dịch NH4OH [34]. Cùng tác giả Jianzhong Xu (2013), quá trình lên men fed-batch được thực hiện trong fermentor 7L chứa 3L môi trường lên men. Tốc độ dòng không khí đi vào được cài đặt với tốc độ 2,5L/phút. Điều chỉnh pH tự động, sử dụng dung dịch NH4OH 25% để duy trì pH 6.9. Tốc độ hòa tan oxy trên 10%/phút. Dịch fed-batch gồm: 800g/L glucose và 400g/L (NH4)2SO4 vô trùng. Tốc độ nạp được điều chỉnh sao cho nồng độ glucose trong dịch lên men ở khoảng 20-30g/L bằng cách kiểm tra mỗi 4 giờ. Trong thí nghiệm này, tác giả thu được L-lysine với năng suất 2,6g/L/giờ, tương đương 96,8g/L sau 36 giờ nuôi cấy [33]. Nghiên cứu lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu L-lysine của Judith Becker (2011) sử dụng hệ thống Biostat với bình lên men 5L, thể tích môi trường lên men 1L. Tốc độ dòng không khí đi vào được cài đặt với tốc độ 2,5L/phút. Điều 27 chỉnh pH tự động, sử dụng dung dịch NH4OH 25% để duy trì pH 6.9. Tốc độ hòa tan oxy trên 10%/phút. Dịch bổ sung bao gồm: 200g rỉ đường và 800g glucose được hòa tan trong 1,8L nước, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. 200mL (NH4)2SO4 (40%) được hấp riêng. 0,8 mL dịch vitamine và 2mL antifoam được bổ sung sau. Dịch vitamine bao gồm: 300mg/L biotin, 500mg/L thiamin.HCl, 2g/L pantothenic acid và 600mg/L nicotinamide. Năng suất L-lysine thu được 4g/L/giờ, tương đương 120g/L sau 30 giờ nuôi cấy [8]. Zhen Chen và cộng sự (2011) tiến hành lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 và Corynebacterium glutamicum LC 198 trong fermentor 2L ở 340C. Dung dịch bổ sung bao gồm: 50% (w/v) glucose, 4,5% (w/v) NH4Cl và 0,5mg/L biotin. Việc bổ sung dinh dưỡng bắt đầu sau khi lượng đường ban đầu được sử dụng hết. Tốc độ nạp được điều khiển sao cho nồng độ glucose dưới 10g/L. Tốc độ khuấy được thay đổi trong suốt quá trình lên men để đảm bảo cung cấp lượng oxy đầy đủ. pH được duy trì ở 7,3 bằng dung dịch NH4OH. Kết quả thu được 58g/L L-lysine sau 30 giờ lên men [10]. Tateno và cộng sự (2007) đã khảo sát khả năng hình thành L-lysine của Corynebacterium glutamicum trên nguồn cơ chất là tinh bột bắp thô. Với hình thức lên men liên tục và lên men fed-batch, lượng L-lysine đã tăng gấp 2,5 lần ở nhiệt độ 340C, 72 giờ lên men so với lên men theo mẻ [32]. Tác giả Ohnishi và cộng sự (2006) đã tiến hành lên men fed-batch sáu chủng Corynebacterium glutamicum mang đột biến đồng gen lysC. Môi trường lên men sử dụng là LPG1. Glucose được chọn là nguồn cơ chất bổ sung trong quá trình lên men fed-batch. Kết quả, lượng L-lysine thu được thấp nhất là 33g/L, cao nhất là 59g/L sau 35 giờ lên men [25]. Tác giả Ohnishi (2002) đã khảo sát khả năng sinh L-lysine của 4 chủng Corynebacterium glutamicum: HD1, AK1, AHD2 và AHP3. Đây là những chủng đã được gây đột biến để tăng khả năng sinh tổng hợp L-lysine. Quá trình lên men được thực hiện theo hình thức fed-batch trong môi trường LPG có nồng độ glucose 50g/L ở quy mô 5L. Kết quả, các chủng đều cho sản lượng L-lysine trên 80g/L chỉ sau 27 giờ nuôi cấy [24]. 28 Có thể thấy rằng, ở nước ngoài, các nghiên cứu về sản xuất L-lysine khá phong phú. Ở quy mô phòng thí nghiệm, glucose là nguồn cơ chất được sử dụng nhiều và cho năng suất L-lysine cao. Những nghiên cứu trên cho thấy, dịch bổ sung có thể là nguồn carbon, nguồn nitơ hay vitamine hoặc hỗn hợp cả ba nguồn. Nồng độ glucose bổ sung khoảng 400-800g/L. Tốc độ nạp tuy không nói rõ nhưng đều duy trì nồng độ glucose trong môi trường lên men khoảng 10-20%. Qua tổng quan tài liệu, chúng tôi rút ra một số các vấn đề chính như sau: - L-lysine là một trong những amino acid quan trọng đối với người và động vật, thuộc nhóm amino acid không thay thế. - Corynebacterium glutamicum là chủng vi khuẩn được sử dụng nhiều trong nghiên cứu sản xuất L-lysine. Những chủng cho năng suất cao thường là những chủng đột biến. - Kỹ thuật lên men fed-batch thể hiện nhiều ưu điểm trong việc nghiên cứu thu nhận L-lysine. Tuy nhiên, trước khi lên men fed-batch cần tối ưu hóa môi trường lên men, đồng thời xác định thời điểm bổ sung cơ chất, tốc độ bổ sung cũng như nồng độ cơ chất bổ sung để duy trì nồng độ đường tối ưu trong canh trường. Đây là tiền đề cho phần thực nghiệm của chúng tôi. 29 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Giống vi sinh vật Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống vi sinh vật Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.1.2. Các loại hóa chất và thiết bị • Hóa chất sử dụng cho môi trường nuôi cấy Nguồn gốc Trung Quốc: glucose, sucrose, fructose, maltose, ethanol, (NH4)2SO4, KH2PO4, urê (NH2)2CO, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4, CuSO4, tween 20. Nguồn gốc Mỹ: biotine, thiamine dạng ống. Nguồn gốc Việt Nam: rỉ đường, dịch bắp (nguồn bắp Mỹ). • Hóa chất phân tích Các hóa chất sử dụng trong đề tài được thống kê trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích Mục đích Hóa chất Nguồn gốc Định lượng L-lysine Ninhydrin Ấn Độ FeCl Trung Quốc HCl Trung Quốc KCl Trung Quốc DMSO (Demethyl Sulfoxide) Merk Methyl cellosolve Merk Định lượng đường sót DNS (3,5 dinitrosalicylic acid) Merk Nhuộm Gram Crystal Merk Iot Merk Fuchin Merk 30 • Thiết bị Ngoài những thiết bị cơ bản (que cấy, đèn cồn), đề tài còn sử dụng các thiết khác được thống kê ở bảng 2.2. Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong đề tài Tên thiết bị Nhà sản xuất Tủ cấy vô trùng Tủ ấm Tủ sấy Nồi hấp Máy lắc tròn Tủ lạnh Bếp điện Kính hiển vi Cân kỹ thuật pH kế Máy ly tâm Máy UV-vis Máy đo độ ẩm Trung Quốc Shellab, Đức Trung Quốc Hirayama, Nhật DO6-DAVS, Đức Toshiba, Nhật Trung Quốc Trung Quốc CP22025 Sartorias, Nhật Eutech pH 510, Singapore Hermle Z 233M-2, Đức Geresys, Mỹ Đức 2.1.3. Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài bao gồm môi trường giữ giống và môi trường nhân giống nhằm bảo quản và hoạt hóa giống trước khi lên men. Các môi trường nuôi cấy được thể hiện ở bảng 2.3. 31 Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng trong đề tài Ký hiệu Môi trường Thành phần M1 Giữ giống Peptone Cao nấm men Glucose NaCl Agar pH 10g/L 5g/L 5g/L 5g/L 18g/L 7,2 M2 Nhân giống Dịch chiết bắp Glucose Peptone Cao nấm men NaCl pH 50g/L 20g/L 10g/L 5g/L 5g/L 7,2 Chủng giống trước khi đưa vào lên men được nhân giống cấp 2 cấp. Một khuẩn lạc thuần được đưa vào ống nghiệm chứa 10mL môi trường nhân giống cấp 1. Sau 24 giờ, toàn bộ sinh khối được đưa vào bình chứa 100mL môi trường nhân giống cấp 2. Sau 24 giờ, lượng giống này được đưa vào bình lên men với tỷ lệ 7%, chất lượng giống là 2,4 tỷ tế bào/mL. 32 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU TỔNG QUÁT Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát Sau khi nhận giống từ trung tâm lưu trữ giống, chúng tôi tiến hành hoạt hóa giống, kiểm tra độ thuần, kiểm tra các đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Với chủng giống đã thuần, chúng tôi thực hiện tối ưu hóa môi trường lên men bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Thu được các thông số tối ưu của môi trường lên men, tiến hành lên men batch, phân tích động học quá trình lên men batch, từ đó xác định thời điểm bổ sung cơ chất và nồng độ cơ chất bổ sung. Tiến hành khảo sát ngưỡng ức chế cơ chất đối với khả năng hình thành L-lysine của chủng giống. Cuối cùng, thử nghiệm lên men fed-batch thu nhận L-lysine. Tối ưu hóa môi trường lên men Thử nghiệm lên men fed-batch thu nhận L-lysine Kiểm tra vi thể, đại thể, sinh lý, sinh hóa Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 Kiểm tra khả năng đồng hóa một số nguồn carbon và nguồn nitơ Thí nghiệm khởi đầu Thí nghiệm sàng lọc Thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay (RSM-CCD) Xác định thời điểm bổ sung cơ chất Xác định ngưỡng ức chế cơ chất Thử nghiệm lên men fed-batch 33 2.2. Bố trí thí nghiệm 2.2.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống Kiểm tra đại thể: quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa. Kiểm tra vi thể: quan sát hình dạng và cách sắp xếp tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 100X. Kiểm tra vi sinh vật có enzyme catalase giúp xác định vi sinh vật thuộc nhóm hiếu khí hay kỵ khí: dùng H2O2 3% và quan sát sự sủi bọt khí. Kiểm tra khả năng đồng hóa một số nguồn carbon và nguồn nitơ: chúng tôi chọn những nguồn carbon và nitơ sau để khảo sát: glucose (5% w/v), sucrose (5% w/v), maltose (5% w/v), fructose (5% w/v), ethanol (2,5% v/v), acid acetic (2,5% v/v), dịch bắp (5% w/v), rỉ đường (5% v/v), (NH4)2SO4 (1% w/v), urê (1% w/v) và peptone (1% w/v). Thí nghiệm sử dụng môi trường lên men trong nghiên cứu của tác giả Trần Thị Minh Tâm, Nguyễn Thúy Hương (2009) [7]. Đối với thí nghiệm khảo sát khả năng đồng hóa nguồn carbon, thành phần dịch bắp và glucose trong môi trường lên men được thay thế bằng những nguồn carbon khảo sát. Đối với thí nghiệm khảo sát khả năng đồng hóa nitơ, thành phần urê và dịch bắp trong môi trường lên men được thay thế bằng những nguồn nitơ khảo sát. Sau 48 giờ, đo OD 470nm kiểm tra sự hình thành L-lysine. 2.2.2. Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm 2.2.2.1. Thực nghiệm sàng lọc Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men chủng thu nhận L-lysine được thiết kế theo ma trận Plackett-Burman với 8 yếu tố [3]. Chỉ tiêu theo dõi (Y) là lượng L-lysine (g/L). Qua tổng quan tài liệu, chúng tôi chọn thời điểm ngừng lên men thu mẫu là 48 giờ [35], đồng thời xác định các mức thí nghiệm cho từng yếu tố. Các mức thí nghiệm và ma trận được thể hiện ở bảng 2.4 và 2.5. Thí nghiệm sàng lọc được bố trí với 2 mức: mức dưới (-1) và mức trên (+1) đối với các yếu tố khảo sát. 34 Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc Yếu tố khảo sát Ký hiệu Các mức Dưới (-1) Trung tâm (0) Trên (+1) Glucose g/L X1 20 50 80 (NH4)2SO4 g/L X2 20 30 40 KH2PO4 g/L X3 0,5 1 1,5 Hỗn hợp muối khoáng mL/L X4 2 5 8 Biotin µg/L X5 10 20 30 Thiamin µg/L X6 100 150 200 Tween 20 mL/L X7 2 5 8 Dịch bắp mL/L X8 50 100 150 Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu TN X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 Y (L-lysine ) 1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 2 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 3 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 4 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 5 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 6 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 7 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 8 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 9 -1 -1 -1 1 -1 -1 -1 -1 10 1 -1 -1 1 1 1 1 -1 11 1 -1 1 1 -1 -1 1 1 12 -1 -1 -1 -1 1 1 -1 1 35 2.2.2.2. Thí nghiệm khởi đầu Thí nghiệm khởi đầu được bố trí với 2 mức: mức dưới (-1) và mức trên (+1) đối với các biến có ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu. Các biến còn lại được bố trí ở mức trung tâm. Bổ sung thêm 5 thí nghiệm mức trung tâm. 2.2.2.3. Thiết kế thí nghiệm bề mặt đáp ứng Từ những số liệu thu được, chúng tôi tiến hành thiết kế thí nghiệm bề mặt đáp ứng để mô tả chính xác mối quan hệ giữa hàm mục tiêu và các thông số thí nghiệm. Ở đây, chúng tôi chọn dạng thiết kế hỗn hợp tâm xoay (CCD-Central Composite Design). Từ kết quả hàm mục tiêu của thí nghiệm RSM-CCD, chúng tôi xây dựng được phương trình hồi quy bậc cao của hàm mục tiêu. Phân tích phương sai đánh giá mức độ phù hợp của hàm mục tiêu với các thông số thí nghiệm. Xác định cực trị hàm mục tiêu và thành phần môi trường lên men tối ưu. 2.2.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 2.2.3.1. Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất Nguyên tắc: thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất là thời điểm mà tại đó lượng cơ chất trong môi trường bị thiếu hụt. Xác định thời điểm bổ sung cơ chất giúp duy trì ổn định lượng cơ chất trong môi lên men. Bố trí thí nghiệm: trên môi trường tối ưu, tiến hành lên men dạng batch trong bình 500mL với thể tích môi trường 250mL. Điều kiện lên men: nhiệt độ phòng, pH ban đầu dao động 7-7,2, chế độ lắc vòng 150 vòng/phút. Lấy mẫu tại các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48 giờ. Phân tích các chỉ tiêu: mật độ tế bào (log CFU/mL), lượng đường sót trong canh trường (g/L) và lượng L-lysine (g/L). Kết quả dự kiến: xác định biến động sinh trưởng, khả năng sử dụng cơ chất và khả năng sinh L-lysine theo thời gian. Từ đó, xác định được thời điểm bắt đầu bổ sung cơ chất. 2.2.3.2. Xác định ngưỡng ức chế cơ chất Nguyên tắc: ngưỡng ức chế cơ chất là ngưỡng mà tại đó nồng độ cơ chất ức chế sự hình thành L-lysine. Trong môi trường lên men, nồng độ cơ chất có ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine của chủng. Nồng độ cơ chất quá cao trong dịch lên 36 men sẽ ức chế sự sinh trưởng của chủng giống, làm giảm khả năng hình thành sản phẩm. Nhưng nồng độ cơ chất quá thấp sẽ không đủ cho chủng sử dụng, dẫn đến hạn chế sinh trưởng, từ đó hạn chế lượng sản phẩm tạo thành. Bố trí thí nghiệm: lên men chủng trong bình 250mL, thể tích môi trường 100mL. Điều kiện lên men: nhiệt độ phòng, pH ban đầu dao động 7-7,2, chế độ lắc vòng 150 vòng/phút. Các nồng độ carbon khảo sát là: 10g/L, 75g/L và 100g/L. Mẫu đối chứng: 50g/L. Các chỉ tiêu theo dõi: lượng L-lysine, mật độ tế bào và đường sót. Kết quả dự kiến: xác định mức giới hạn trên và dưới, là cơ sở để duy trì nồng độ cơ chất phù hợp trong môi trường lên men. 2.2.3.3. Thử nghiệm lên men fed-batch Nguyên tắc: việc bổ sung cơ chất trong suốt quá trình lên men sẽ duy trì nồng độ cơ chất trong canh trường ổn định, tạo điều kiện thuận lợi cho chủng giống sinh trưởng và sinh tổng hợp sản phẩm. Bố trí thí nghiệm: lên men fed-batch ban đầu được bố trí giống lên men batch, thể tích môi trường nuôi cấy 250mL. Dựa vào khả năng sử dụng đường của chủng và ngưỡng ức chế cơ chất để đưa ra chế độ fed-batch hợp lý. Cuối mỗi thời điểm, lấy 5mL mẫu phân tích các chỉ tiêu: lượng L-lysine, mật độ tế bào và lượng đường sót trong canh trường. 2.3. Phương pháp phân tích thí nghiệm 2.3.1. Phương pháp vi sinh 2.3.1.1. Kiểm tra hình thái vi sinh vật Quan sát đại thể: cấy trang, cấy ria vi khuẩn trên thạch đĩa để quan sát đặc điểm hình thái và màu sắc khuẩn lạc. Quan sát vi thể: nhuộm Gram để quan sát hình dạng tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 100x. Dùng que cấy ria lấy một lượng giống vừa đủ đặt lên lam kính đã nhỏ sẵn một giọt nước cất, hơ nhẹ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn đến khi khô. Phủ hoàn toàn lên mẫu bằng thuốc nhuộm crystal violet (tím), để 30 giây, rửa nhẹ nhàng bằng nước cất. Tiếp theo, phủ lên mẫu dung dịch Iot, để 30 giây, rửa lại bằng nước cất. Rửa mẫu với cồn 700, tuy nhiên, không nên để cồn tiếp xúc với mẫu quá 5 giây vì cồn có thể khử toàn bộ màu. Rửa lại mẫu với nước cất rồi phủ lên mẫu thuốc nhuộm fuchsin (hồng), để 37 trong 30 giây. Rửa mẫu bằng nước cất một lần nữa. Dùng giấy thấm khô lam kính, nhỏ một giọt dầu soi kính lên mẫu và quan sát ở vật kính 100X. 2.3.1.2. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch Nguyên tắc: mỗi tế bào vi khuẩn phân chia hình thành một khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa tương đương với lượng tế bào vi khuẩn sống trong dịch lên men. Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở các nồng độ khác nhau (10-1 – 10-7), hút 0,1mL ở 3 nồng độ: 10-5, 10-6, 10-7 cấy trang lên thạch đĩa (lặp lại 3 lần). Ủ ở nhiệt độ 300C trong 24h, đếm khuẩn lạc. Tính số tế bào vi khuẩn/mL theo công thức: Số khuẩn lạc/mL = Trong đó: a là số khuẩn lạc ở đĩa thứ nhất b là số khuẩn lạc ở đĩa thứ 2 c là số khuẩn lạc ở đĩa thứ 3 10-n là nồng độ pha loãng huyền phù tế bào (số khuẩn lạc chấp nhận được phải nằm trong khoảng 50-150 khuẩn lạc/đĩa). 2.3.1.3. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang Dựa vào đường chuẩn sinh khối và độ đục huyền phù tế bào để xác định mật độ tế bào/mL. Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở những nồng độ thích hợp sao cho chỉ số OD nằm trong giới hạn OD đường chuẩn. Thế giá trị OD của từng mẫu dịch huyền phù vào phương trình đường chuẩn sinh khối. Ghi nhận kết quả. 2.3.1.4. Xác định Gram bằng phản ứng String Test Nguyên tắc: phản ứng string test dựa trên sự khác nhau về cấu trúc hóa học của vách tế bào. Vách tế bào vi khuẩn Gram (-) dễ bị vỡ khi tiếp xúc với dung dịch kiềm do vách peptidoglycan mỏng. Phản ứng string test bước đầu giúp phân biệt vi khuẩn Gram (-) và Gram (+). x 10 10-n 3 a+b+c 38 Tiến hành: nhỏ một giọt KOH 3% lên lam kính. Dùng que cấy ria chấm khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum khuấy đều lên giọt KOH. Quan sát sự kéo sợi trong 60 giây. Phản ứng dương tính thì kết luận là Gram (+), phản ứng âm tính thì kết luận là Gram (-). 2.3.1.5. Xác định vi khuẩn hiếu khí nhờ H2O2 Nguyên tắc: hầu hết các vi sinh vật hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý chứa chuỗi điện tử có cytochrome đều có enzyme catalase, nhờ đó bảo vệ tế bào khỏi các hợp chất có độc tính cao của phân tử oxy. Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi điện tử tạo H2O2. Enzyme catalase thủy phân H2O2 (hydroxygen peroxide) thành H2O và O2 gây hiện tượng sủi bọt khí. Tiến hành: nhỏ một giọt H2O2 lên lam kính. Dùng que cấy chấm khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum lên giọt H2O2. Quan sát sự sủi bọt khí, phản ứng