Luận văn Nghiên cứu sinh sản nhân tạo và ương ấu trùng sá sùng Sipunculus nudus (Linnaeus, 1767) tại Quảng Ninh

t quả phân loại DNA sá sùng Vân Đồn Sipunculus nudus khác với sá sùng Nha Trang, Cần Giờ Sipunculus polymyotus và bông thùa Sóc Trăng. Sản phẩm sá sùng Vân Đồn bao gồm sản phẩm có nguồn gốc xuât xứ từ 2 xã đảo Quan Lạn và Minh Châu và đã được đăng ký chỉ dẫn địa lý tại Cục sở hữu trí tuệ - Bộ Khoa học và Công nghệ [1]. Năm 2015, Trại thực nghiệm nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ Quảng Ninh thuộc Trường cao đẳng kinh tế kinh tế kỹ thuật và Thủy sản triển khai đề tài cấp 16 tỉnh Nghiên cứu xây dựng quy trình sinh sản nhân tạo giống sá sùng (Sipunculus nudus Linnaeus, 1767) tại Quảng Ninh. Kết quả thu được ban đầu (Tháng 11/2016) Sở Khoa học và Công nghệ, Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Quảng Ninh ghi nhận đã cho sinh sản và ương nuôi thành công 21.900 con sá sùng giống kích cỡ 3 - 4 cm, số sá sùng trên được ương nuôi trong bể xi măng. Tháng 12/2016, số sá sùng giống trên đã được chuyển ra thả tại các bãi nuôi của huyện Vân Đồn (Quan Lạn, Minh Châu và vườn Quốc gia Bái Tử Long). Đề tài này đang tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện công nghệ sản xuất giống cũng như việc kiểm chứng quy trình tại các cơ sở sản xuất giống khác trên địa bàn tỉnh Quảng Ninh [12]. 17 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: - Tên khoa học: Sipunculus nudus (Linnaeus, 1767). - Tên tiếng Việt: Sá sùng. - Tên tiếng Anh: Peanut worm. - Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 4 đến tháng 12 năm 2016. Địa điểm nghiên cứu: Trạm thực nghiệm nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ Quảng Ninh thuộc Trường cao đẳng Thủy sản. Hình 2.1: Sá sùng Sipunculus nudus (Linnaeus, 1767) 2.2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu sinh sản nhân tạo sá sùng (phương pháp kích thích cho sá sùng đẻ, tỷ lệ thụ tinh, tỷ lệ nở); - Nghiên cứu kỹ thuật ương, nuôi sá sùng (xác định thức ăn và mật độ ương thích hợp ở giai đoạn ấu trùng giai đoạn nổi và giai đoạn xuống đáy); - Theo dõi biến động của các yếu tố môi trường trong ương, nuôi sá sùng (nhiệt độ, ôxy, độ mặn, pH, NH3 và H2S). 18 Theo dõi các chỉ tiêu: - Thời gian sá sùng đẻ trứng; - Hiệu quả của từng phương pháp. Hình 2.2: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Kỹ thuật kích thích sinh sản sá sùng bố mẹ Nguồn sá sùng bố mẹ được tuyển chọn và thu mua trực tiếp từ người dân khai thác ngoài tự nhiên tại huyện Vân Đồn và huyện Đầm Hà, tỉnh Quảng Ninh. Chiều dài sá sùng bố mẹ từ 08 - 20 cm/con, trọng lượng cơ thể sá sùng bố mẹ 09 - 22 g/con, không dị hình, dị dạng và hoàn toàn khỏe mạnh. Sá sùng được vận chuyển bằng ô tô Kích thích Sá sùng sinh sản Kích thích nhiệt khô Kích thích nhiệt kết hợp Thu trứng và ấp nở trứng Nghiên cứu kỹ thuật ương nuôi ấu trùng sá sùng Ấu trùng trôi nổi Ấu trùng xuống đáy Xác định loại thức ăn thích hợp Xác định mật độ ương thích hợp Xác định loại thức ăn thích hợp Xác định mật độ ương thích hợp Đánh giá các chỉ tiêu: - Tốc độ tăng trưởng về chiều dài của ấu trùng - Tỷ lệ sống của ấu trùng Theo dõi các chỉ tiêu: - Thời gian phát triển phôi; - Tỷ lệ trứng thụ tinh, tỷ lệ trứng nở; - Tỷ lệ sống ấu trùng. Phân tích và kết luận Kích thích nhiệt ướt 19 về địa điểm nghiên cứu bằng phương pháp vận chuyển khô, sử dụng thùng xốp có bổ sung lớp cát ở đáy có độ dày 5 cm hạ nhiệt độ của thùng xốp xuống khoảng 24 - 250C. Thời gian vận chuyển về đến Trạm thực nghiệm Nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ Quảng Ninh trong khoảng 3 - 5 giờ. Mức độ thành thục của sá sùng bố mẹ có sản phẩm sinh dục phát triển ở giai đoạn IV trở lên đối với sá sùng cái, giai đoạn III đối với sá sùng đực [12]. Sá sùng ngay khi về tiến hành rửa sạch và thả vào chậu có thể tích 50 lít, nguồn nước biển cấp được lọc sạch, sục khí nhẹ. Ngày hôm sau tiến hành kích thích sinh sản. Sử dụng 3 phương pháp sốc nhiệt độ để kích thích sá sùng sinh sản: - Sốc nhiệt độ bằng cách phơi sá sùng (nhiệt khô): Sá sùng bố mẹ được phơi trong bóng râm trong khoảng 60 phút trong bóng râm, sau đó cho sá sùng vào chậu đẻ có nhiệt độ nước 26 - 280C để kích thích sá sùng sinh sản. - Sốc nhiệt độ bằng thay đổi nhiệt độ nước (nhiệt ướt): Sử dụng cây nâng nhiệt để nâng nhiệt độ nước từ từ khoảng 60 phút trong bể lên 34 - 350C, sau đó chuyển sá sùng vào chậu đẻ, dùng đá lạnh nhằm mục đích hạ nhiệt độ nước của chậu đẻ xuống còn 26 - 280C để kích thích sá sùng sinh sản. - Sốc nhiệt độ bằng cách nâng nhiệt (kết hợp) cả nhiệt khô và nhiệt ướt: Sá sùng bố mẹ được phơi trong bóng râm trong khoảng 60 phút, sau đó cho sá sùng vào chậu đẻ có nhiệt độ nước 280C, tiếp tục phơi bể đẻ ngoài trời nắng (có xục khí) nhằm nâng nhiệt độ nước lên 340C để kích thích sá sùng sinh sản. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 06 lần, các thông số đánh giá: thời gian sinh sản (bắt đầu tính khi cho sá sùng bố mẹ vào chậu đẻ), tỷ lệ thụ tinh (dùng ống đong 150 ml định lượng theo thể tích để xác định tổng số trứng, tiếp theo soi trên kính hiển vi để xác định số trứng được thụ tinh), tỷ lệ nở (số trứng thu tinh sau khi đưa vào bể ấp khoảng 4-5 giờ tiến hành xác định tỷ lệ nở, bằng cách dung ống đong 150 ml để định lượng và tính ra tỷ lệ nở trên tổng số trứng được thụ tinh). 2.3.2. Kỹ thuật ương nuôi ấu trùng sá sùng giai đoạn trôi nổi 2.3.2.1. Ảnh hưởng của thức ăn đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng trôi nổi Ấu trùng sá sùng giai đoạn Pelagosphera 01 ngày tuổi được bố trí ngẫu nhiên vào trong các xô nhựa có dung tích 30 lít, mật độ 300 con/lít. Thí nghiệm đã sử dụng 03 nghiệm thức với 03 loại thức ăn khác nhau: - Nghiệm thức 1: Hỗn hợp tảo tươi (Isochrysis sp, Chaetoceras sp, Nannochloropsis oculata,) mật độ tảo 10.000tb/mL. 20 - Nghiệm thức 2: Thức ăn công nghiệp, liều lượng 2g/ngày. (loại thức ăn cho ấu trùng tôm he Nhật P. Japonicus, có độ đạm > 40%, chất béo > 8% do hãng HIGASHIMARU Co. LTD-JAPAN) sản xuất. - Nghiệm thức 3: Hỗn hợp tảo tươi (như ở nghiệm thức 1), kết hợp với thức ăn công nghiệp tỷ lệ cho ăn 1:1 (loại thức ăn công nghiệp như ở nghiệm thức 2). Ấu trùng được cho ăn 4 lần/ngày vào 7h, 11h, 17h và 22h. Ở nghiệm thức 3, tỷ lệ phối trộn khẩu phần thức ăn như sau: tảo tươi được cho ăn 2 lần/ngày vào lúc 7h và 17h, thức ăn công nghiệp được cho ăn vào thời điểm 11h và 22h. Hàng ngày, thay 20% lượng nước trong bể nuôi kết hợp si phông đáy. Theo dõi các yếu tố môi trường trong bể ương như: nhiệt độ, độ mặn, pH, NH3, H2S, oxy hòa tan. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 03 lần và kết thúc khi ấu trùng đã chuyển hết sang giai đoạn xuống đáy. Xác định các chỉ tiêu: sinh trưởng về chiều dài và tỷ lệ sống của ấu trùng. Việc xác định chiều dài của ấu trùng được thực hiện trên 30 mẫu ở mỗi nghiệm thức, soi trên kính hiển vi có thức đo để xác định. 2.3.2.2. Ảnh hưởng của mật độ đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng trôi nổi Ấu trùng sá sùng giai đoạn Pelagosphera 01 ngày tuổi được bố trí ngẫu nhiên vào trong các thùng xốp có dung tích 30 lít. Sử dụng 04 nghiệm thức thí nghiệm tương ứng với 04 mật độ ương khác nhau: 400; 600; 800; 1000 con/lít. Ấu trùng được cho ăn 04 lần/ngày vào 7h, 11h, 17h và 22h với thức ăn thích hợp nhất từ kết quả của thí nghiệm mục 2.3.2.1. Hàng ngày thay 20% lượng nước trong bể nuôi kết hợp si phông đáy để duy trì chất lượng nước trong xô thí nghiệm. Thường xuyên theo dõi các yếu tố môi trường trong bể ương như: nhiệt độ, độ mặn, pH, NH3, H2S, oxy hòa tan. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 03 lần và kết thúc khi ấu trùng đã chuyển hết sang giai đoạn xuống đáy. Xác định các chỉ tiêu: sinh trưởng về chiều dài và tỷ lệ sống của ấu trùng. Việc xác định chiều dài của ấu trùng được thực hiện trên 30 mẫu ở mỗi nghiệm thức, soi trên kính hiển vi có thức đo để xác định. 2.3.3. Kỹ thuật ương nuôi ấu trùng sá sùng giai đoạn sống đáy 2.3.3.1. Ảnh hưởng của thức ăn đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng sống đáy Ấu trùng sá sùng mới xuống đáy (1 ngày tuổi) được bố trí ngẫu nhiên vào các thùng xốp có diện tích 0,6 m2, đáy cát dày 3-5 cm, mật độ 800 con/m2. Sử dụng 4 nghiệm thức thí nghiệm tương ứng với 4 loại thức ăn khác nhau: 21 - Nghiệm thức 1: Hỗn hợp tảo tươi (tảo Isochrysis sp, Chaetoceros sp + tảo đáy Platymonas sp) mật độ tế bào 10.000 tb/ml. - Nghiệm thức 2: Thức ăn công nghiệp, liều lượng 2g/ngày. (loại thức ăn cho ấu trùng tôm he Nhật P. Japonicus, có độ đạm > 40%, chất béo > 8% do hãng HIGASHIMARU Co. LTD-JAPAN) sản xuất. - Nghiệm thức 3: Thức ăn chế biến (cá tạp, bột cá, cám gạo) hấp chín. - Nghiệm thức 4: Hỗn hợp tảo tươi (tảo Isochrysis sp, Chaetoceros sp + tảo đáy Platymonas sp) kết hợp với thức ăn chế biến với tỷ lệ cho ăn là 1:1. Ấu trùng được cho ăn 4 lần/ngày vào 7h, 11h, 17h và 22h. Ở nghiệm thức 4, tỷ lệ phối trộn khẩu phần thức ăn như sau: tảo tươi được cho ăn 2 lần/ngày vào lúc 7h và 17h, trong khi thức ăn công nghiệp được cho ăn vào thời điểm 11h và 22h. Hàng ngày thay 20% lượng nước trong bể nuôi. Theo dõi các yếu tố môi trường trong bể ương như: nhiệt độ, độ mặn, pH, NH3, H2S, oxy hòa tan. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết thúc khi ấu trùng đạt cỡ giống (1 – 2 cm). Xác định các chỉ tiêu: sinh trưởng về chiều dài và tỷ lệ sống của ấu trùng. Việc xác định chiều dài của ấu trùng được thực hiện trên 30 mẫu ở mỗi nghiệm thức, dùng thước đo có phân vạch tới mimimet để xác định. 2.3.3.2. Ảnh hưởng của mật độ đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của ấu trùng xuống đáy Ấu trùng sá sùng mới xuống đáy (1 ngày tuổi) được bố trí ngẫu nhiên vào các thùng xốp có diện tích 0,6 m2, đáy cát dày 3-5 cm, với 4 mật độ khác nhau: 1.000, 2.000, 3.000, 4.000 con/m2. Ấu trùng được cho ăn 4 lần/ngày vào 7h, 11h, 17h và 22h bằng thức ăn thích hợp nhất từ kết quả của thí nghiệm mục 2.3.3.1. Hàng ngày, thay 20% nước trong bể ương, theo dõi các yếu tố môi trường trong bể ương như: nhiệt độ, độ mặn, pH, oxy hòa tan. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lặp lại 3 lần và kết thúc khi ấu trùng đạt cỡ giống (1 – 2 cm). Xác định các chỉ tiêu: sinh trưởng về chiều dài và tỷ lệ sống của ấu trùng. Việc xác định chiều dài của ấu trùng được thực hiện trên 30 mẫu ở mỗi nghiệm thức, dùng thước đo có phân vạch tới mimimet để xác định. 2.3.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 2.3.4.1. Phương pháp xác định các thông số môi trường - Nhiệt độ: Đo bằng nhiệt kế bách phân, chính xác đến 1oC. - Độ pH: Độ pH đo bằng máy Hanna HI98701 chính xác đến 0,1. 22 - Độ mặn: Đo bằng Salimeter, chính xác đến 1%o. - Oxy hòa tan: Đo bằng máy Hanwei BX616 chính xác đến 0,01 mg/l. - Nồng độ NH3: Đo bằng máy Hanna HI715 chính xác đến 0,01 mg/l. - Nồng độ H2S: Đo bằng máy Hanwei BX616 chính xác đến 0,01 mg/l. 2.3.4.2. Các công thức tính toán N1 -Tỷ lệ thành thục của sá sùng bố mẹ (M%): M% = — x 100% N2 Trong đó: N1 là số cá thể thành thục; N2 là tổng số cá thể kiểm tra. N - Tỷ lệ thụ tinh (Tt%): Tt (%) = — x 100% M Trong đó: N là tổng số trứng thụ tinh; M là tổng số trứng sinh sản. X - Tỷ lê nở (Tn%): Tn (%) = — x 100% N Trong đó: X là tổng số ấu trùng Trochophora; N là tổng số trứng thụ tinh. Nt -Tỷ lệ sống của ấu trùng (S%): S% = — x 100% N0 Trong đó: Nt là số ấu trùng sau t ngày ương nuôi; N0 là số ấu trùng thả ban đầu -Tốc độ tăng trưởng tuyệt đối về chiều dài (DLG) DLG (mm/ngày) = (L2 – L1)/(t2 – t1) Trong đó: L1, L2 lần lượt là chiều dài sá sùng ở thời điểm kiểm tra t1 và t2. 2.3.4.3. Phương pháp xử lý số liệu Các số liêu được thu thập, tính toán và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (MEAN±SE) trên phần mềm Microsoft Office Excel, 2010 và SPSS phiên bản 22,0. Sử dụng phép phân tích phương sai một yếu tố (one-way ANOVA) để kiểm định sự khác nhau của các giá trị trung bình giữa các nghiêm thức. Đánh giá sự sai khác của các giá trị trung bình sau phân tích phương sai (Post Hoc Test) bằng kiểm định Duncan. Khác nhau giữa các giá trị được xác định ở mức ý nghĩa p < 0,05. 23 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kỹ thuật lựa chọn sá sùng bố mẹ thành thục 3.1.1. Lựa chọn sá sùng bố mẹ thành thục tại các bãi tự nhiên Sá sùng bố mẹ được lựa chọn trực tiếp thông qua các tài liệu khoa học, kết hợp với kinh nghiệm thực tế của các hộ dân khai thác tự nhiên tại bãi triều xã Minh Châu, xã Quan Lạn thuộc huyện Vân Đồn và bãi triều Chương Cả huyện Đầm Hà tỉnh Quảng Ninh. Thời gian lựa chọn sá sùng bố mẹ thành thục ngoài bãi tự hiên được thực hiện từ tháng 5 đến tháng 7/2016. Hình 3.1: Sá sùng bố mẹ thành thục mới chuyển về Trong thời gian nghiên cứu, đã tổ chức 06 lần (02 lần/tháng x 03 tháng) lựa chọn sá sùng bố mẹ thành thục ngoài tự nhiên. Sá sùng bố mẹ thành thục được lựa chọn để sinh sản đảm bảo các tiêu chí về chiều dài, khối lượng, đặc biệt sản phẩm sinh dục phát triển có mầu hồng nhạt và trắng bạc. Sá sùng bố mẹ có sản phẩm sinh dục phát triển ở giai đoạn IV trở lên đối với sá sùng cái, giai đoạn III đối với sá sùng đực [12]. 3.1.2. Kết quả lựa chọn sá sùng bố mẹ thành thục Tổng số sá sùng bố mẹ được lựa chọn là 2.628 con (khoảng 36,1 kg) với chiều dài trung bình là 12,3 ± 2,3 cm và trọng lượng trung bình là 13,8 ± 3,0 g. Việc thu mua gom sá sùng tiến hành trong thời gian dài, nhiều đợt nên ít nhiều ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu. Vì theo thời gian tháng trong năm, độ thành thục của sá sùng bố mẹ có sự khác nhau. Sá sùng khi về tới địa điểm nghiên cứu sẽ tiến hành ngay việc rửa bằng 24 nước mặn đã được lọc sạch, nước có độ mặn 280/00, tiếp theo cho sá sùng vào chậu 50 lít, mỗi chậu chứa khoảng 100-120 con, xục khí nhẹ. Sau đó theo dõi, loại bỏ những con chết, kiểm tra độ thành thục của sá sùng. Kết quả cụ thể tại Bảng 3.1 Bảng 3.1: Số lượng, tỷ lệ sống và tỷ lệ thành thục của sá sùng bố mẹ Stt Tháng Số lượng (con) Trọng lượng (kg) Tỷ lệ sống (%) Tỷ lệ thành thục (%) 1 517 7,5 95,0 53,3 2 5 286 3,2 96,0 66,7 3 262 2,3 93,7 86,7 4 6 528 7,3 92,5 90,0 5 530 8,2 72,9 93,3 6 7 505 7,6 86,7 96,7 Kết quả lựa chọn sá sùng bố mẹ thành thục ở Bảng 3.1 cho thấy, tỷ lệ thành thục của sá sùng bố mẹ đạt khá cao, đạt trung bình 81,1%, đạt cao nhất vào tháng 7 với 96,7%, thấp nhất vào tháng 5 với 53,3% và có xu hướng tăng dần độ thành thục từ tháng 5 đến tháng 7. Tỷ lệ sống trung bình của sá sùng bố mẹ khi chuyển về đạt trung bình 89,5%, trong đó, tỷ lệ sống của sá sùng đạt cao nhất vào tháng 5 với 96,0% và thấp nhất là vào tháng 7 với 72,9%. Hai tỷ lệ trên đối nghịch nhau theo thời gian tháng, điều này có thể là do kích cỡ sá sùng tháng 7 to hơn, tuyến sinh dục cũng to hơn nên trong quá trình vận chuyển làm ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của sá sùng bố mẹ. Mặt khác khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 7 là mùa mưa nên sá sùng thường chui sâu xuống nền đáy, vì vậy người dân khó khai thác hơn, sá sùng dễ bị tổn thương nên ảnh hưởng tới