Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

c đĩa petri trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Ủ sau 3 ngày thì đo đường kính khuẩn lạc d (mm) - Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuôi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Ủ trong tủ ấm theo thời gian đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định nhiệt độ sinh enzym tối ưu của từng chủng c. Ảnh hưởng của pH - Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri. Sau đó, cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm). Mẫu đối chứng là có pH 6,5 - Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl 10% để có các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định pH sinh enzym tối ưu của từng chủng. Mẫu đối chứng là có pH 6,5 d. Ảnh hưởng của độ ẩm - Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, bổ sung các lượng nước biển khác nhau để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70%. Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri, cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm) - Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các lượng nước biển khác nhau để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70%. Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ ẩm sinh enzym tối ưu của từng chủng. e. Ảnh hưởng của độ mặn - Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT2 không dùng nước biển, bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 1, 3, 5, 10, 20%. Thanh trùng MT đổ đĩa petri, rồi cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu lên MT với các nồng độ muối. Ủ ấm 3 ngày Đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng chịu mặn. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0% Quy ước: d = 0 mm : Không mọc, d = 1÷ 2 mm: Mọc yếu, d = 2,1 ÷ 5 mm: Mọc trung bình, d = 5,1 ÷ 10 mm: Mọc tốt, d = 11 ÷ 30 mm: Mọc rất tốt - Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 1, 3, 5, 10, 20%. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH, độ ẩm đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ mặn sinh enzym tối ưu của từng chủng. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0% 2.3.4. Phương pháp toán học - Các kết quả thu được là trung bình của ba lần lặp lại thí nghiệm Phương pháp tính giá trị trung bình Trong đó : : Giá trị trung bình kết quả n lần thí nghiệm : Giá trị lần thí nghiệm thứ i n : Số lần lặp lại thí nghiệm Phương pháp tính khoảng ước lượng : Trong đó : tra bảng phân phối Student với n-1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng 2 phía. Là phương sai mẫu - Số liệu được xử lý bằng các hàm Avegare (Giá trị trung bình), Stud (Phương sai), Var (Sai số) trong excel. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng NS có khả năng sinh amylase từ RNM Cần Giờ 3.1.1. Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ Tiến hành lấy mẫu từ lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục, đất mặt và đất sâu 5-10 cm, chúng tôi đã phân lập được 409 chủng NS khác nhau (xem phụ lục1) và trình bày tóm tắt trong bảng 3.1 dưới đây. Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng NS Cơ chất phân lập Số lượng chủng NS Tỷ lệ % Lá: - Lá vàng - Lá mục 152 71 81 37,2% 17,4% 19,8% Cành: - Cành khô - Cành mục 140 59 81 34,2% 14,4% 19,8% Đất: - Đất mặt - Đất sâu 5-10 cm 117 64 53 28,6% 15,6% 13% (Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 1) Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy, hệ NS ở RNM Cần Giờ vô cùng phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, cành, trên đất và có cả trong đất sâu 5-10 cm. Các chủng NS phân lập tập trung nhiều trên nguồn cơ chất lá (152/409 chủng) chiếm 37,2% tổng số chủng NS phân lập được, còn ở cành là (140/409 chủng) chiếm 34,2%, trên đất là (117/409 chủng) chiếm 28,6%. Kết quả này cho thấy, có lẽ hầu hết các chủng NS ở RNM là các chủng du nhập từ đất liền (Nguyễn Hoàng Trí, 1999). Còn các loài nấm biển chủ yếu có trên rễ cây hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn. Đây là những nấm góp phần phân hủy xác thực vật ở RNM Cần Giờ [36]. Đặc biệt, trên cơ chất lá mục, thân cành mục số lượng NS nhiều hơn, vì đây là những nguồn hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ nhất. Kết quả này thống nhất với nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) và Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khảo sát sự phân bố của các chủng NS. Ngoài ra, trên lớp đất mặt số chủng NS chiếm (15,6%) nhiều hơn lớp đất sâu (13%) vì NS là VSV hiếu khí mà lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào (xác lá, cành, động vật, STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 1 L1 17 2 L3 11,5 3 L4 4 4 L5 8,5 5 L6 11,5 6 L8 15 7 L11 15,5 8 L12 13,5 9 L13 11,5 10 L14 16 11 L15 11 12 L16 8 13 L17 16,5 14 L18 16 15 L19 2,5 16 L20 3 17 L21 6 18 L22 16 19 L23 7 vỏ xác tôm cua, giáp xác,…) đang phân hủy. Đồng thời, với điều kiện thủy triều lên xuống hàng ngày nên lớp đất mặt luôn giữ độ ẩm thích hợp cho các chủng NS sinh trưởng phát triển. Có thể thấy MT sống ở RNM Cần Giờ mặc dù rất khắc nghiệt nhưng có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho NS sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ có sẵn để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ô nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. Từ các chủng phân lập được nói trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng NS dựa trên khả năng sinh amylase của chúng. 3.1.2. Tuyển chọn những chủng NS có khả năng sinh amylase  Tuyển chọn lần 1 Kiểm tra khả năng sinh enzym amylase của 409 chủng NS theo phương pháp 2.3.2.6. Kết quả trình bày ở bảng 3.2 Phân tích số liệu từ bảng 3.2 cho thấy: - Tổng số chủng có enzym: 261/409 chủng chiếm 63,81% + Chủng sinh enzym mạnh : 0/261 chiếm 0% + Chủng sinh enzym khá mạnh : 3/261 chiếm 1,15% + Chủng sinh enzym trung bình : 43/ 261 chiếm 16,48% + Chủng sinh enzym yếu : 156/261 chiếm 59,77% Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 71 LM32 11 72 LM33 12 73 LM35 14 74 LM36 7 75 LM37 8 76 LM38 4,5 77 LM39 15,5 78 LM40 4,5 79 LM41 14 80 LM45 13,5 81 LM46 10,5 82 LM47 6 83 LM48 17,5 84 LM50 3,5 85 LM51 8 86 LM52 3 87 LM53 18,5 88 LM54 18 89 LM56 4 90 LM57 6 91 LM58 5,5 92 LM59 5,5 93 LM61 1,5 94 LM62 7,5 95 LM68 4 96 LM78 9 97 CK1 11,5 98 CK2 5 99 CK3 15 100 CK4 13 101 CK6 16 102 CK8 16,5 103 CK11 23 104 CK12 12 105 CK14 5 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 141 CK53 7 142 CK54 2 143 CK55 2,5 144 CK57 8 145 CK58 13 146 CK59 9 147 CM2 3 148 CM3 2 149 CM8 21 150 CM9 16,5 151 CM10 19 152 CM11 15 153 CM13 10 154 CM14 17 155 CM15 3 156 CM16 4 157 CM17 7 158 CM18 12 159 CM20 11 160 CM21 14 161 CM22 5,5 162 CM23 10 163 CM26 18 164 CM28 14,5 165 CM29 6 166 CM31 5 167 CM32 3 168 CM33 16,5 169 CM34 13 170 CM35 6 171 CM36 8 172 CM38 6,5 173 CM39 5 174 CM40 13 175 CM41 17 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 176 CM43 15,5 177 CM44 14 178 CM46 4 179 CM48 4 180 CM52 9 181 CM53 4 182 CM54 17 183 CM63 9 184 CM66 8 185 CM73 2 186 CM76 11 187 CM77 4 188 CM78 7 189 CM79 3 190 CM80 8 191 Đ2 12 192 Đ3 12 193 Đ5 16,5 194 Đ8 4 195 Đ10 20,5 196 Đ12 9 197 Đ13 10 198 Đ14 10 199 Đ16 9 200 Đ17 4 201 Đ18 8 202 Đ19 4 203 Đ20 10 204 Đ21 13 205 Đ22 11 206 Đ23 2 207 Đ24 10 208 Đ25 16,5 209 Đ26 12 210 Đ28 7 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 36 L52 10,5 37 L57 2,5 38 L58 1,5 39 L59 11,5 40 L61 4 41 L62 4 42 L63 10 43 L64 5 44 L65 12 45 L66 4 46 L67 14 47 L69 2 48 L70 10 49 LM1 12 50 LM2 11 51 LM5 16,5 52 LM6 15 53 LM8 5 54 LM9 10 55 LM10 12 56 LM11 7 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 211 Đ29 15 212 Đ31 6 213 Đ33 8,5 214 Đ34 15 215 Đ35 10 216 Đ36 4 217 Đ37 11 218 Đ39 8 219 Đ41 4 220 Đ42 5 221 Đ43 5,5 222 Đ44 3 223 Đ45 2,5 224 Đ46 3 225 Đ47 6 226 Đ48 4 227 Đ51 8 STT Kí hi chủng 106 CK15 107 CK16 108 CK17 109 CK18 110 CK19 111 CK20 112 CK21 113 CK22 114 CK23 115 CK24 116 CK25 117 CK26 118 CK27 119 CK28 120 CK29 121 CK30 122 CK31 123 CK32 124 CK33 125 CK34 126 CK35 127 CK36 128 CK38 129 CK39 130 CK40 131 CK41 132 CK4 133 CK43 134 CK44 135 CK46 136 CK47 137 CK48 138 CK49 139 CK51 140 CK52 Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập (tiếp theo) 57 LM12 9 58 LM13 13 59 LM16 9 60 LM18 17,5 61 LM21 5 62 LM22 16,5 63 LM23 18 64 LM24 9,5 65 LM25 7 66 LM26 4 67 LM28 16,5 68 LM29 1 69 LM30 10 70 LM31 9 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 228 Đ52 9 229 Đ53 4 230 Đ54 4 231 Đ55 7,5 232 Đ56 19 233 Đ58 7 234 Đ61 9 235 Đ64 5 236 ĐS2 13 237 ĐS4 1 238 ĐS5 3 239 ĐS8 2 240 ĐS9 3 241 ĐS14 11 242 ĐS15 9 243 ĐS17 7 244 ĐS18 7,5 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 245 ĐS19 4 246 ĐS20 3 247 ĐS21 3 248 ĐS24 16 249 ĐS25 2 250 ĐS26 13 251 ĐS28 6 252 ĐS29 4 253 ĐS30 5 254 ĐS32 15,5 255 ĐS33 14,5 256 ĐS34 7 257 ĐS36 14 258 ĐS39 9 259 ĐS42 6 260 ĐS43 5 261 ĐS50 3 Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập (tiếp theo) - Trong đó: + Số chủng trên lá là : 96/261 chiếm 36,8% + Số chủng trên cành là : 94/261 chiếm 36% + Số chủng trên đất là : 71/261 chiếm 27,2% Từ bảng 3.2 cho thấy các chủng NS ở RNM cần Giờ có khả năng sinh enzym amylase khá cao (261/409) chiếm 63,81% số chủng NS phân lập được. Phần lớn các chủng này tập trung ở lá chiếm 36,8% và cành chiếm 36% . Do nguồn thức ăn chủ yếu của NS sinh amylase là tinh bột - sản phẩm chuyển hóa của quá trình quang hợp, nên các VSV sinh amylase tập trung ở lá và cành nhiều hơn. Kết quả này cũng cho thấy số lượng chủng NS ở RNM Cần Giờ có hoạt tính amylase mạnh đến khá mạnh chiếm tỉ lệ ít (1,15%), trong khi đó tỉ lệ các chủng có hoạt tính yếu chiếm rất cao (59,77%). Kết quả này trùng hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khả năng sinh amylase các chủng NS phân lập được từ RNM [15]. Sở dĩ như vậy, là vì nguồn cơ chất tinh bột ở RNM chiếm một tỉ lệ rất nhỏ so với lượng chất hữu cơ giàu cellulose và chitine. Đồng thời, quá trình phân giải các hợp chất chứa tinh bột trong tự nhiên diễn ra chậm. Do đó, quá trình phân giải các chất trong MT không chỉ dựa vào hệ NS mà còn có sự tham gia của nhiều VSV khác như VK, xạ khuẩn. Trong 261/409 chủng NS sinh enzym amylase, chúng tôi bước đầu chọn 10 chủng có hiệu số D-d (mm) cao nhất để tiếp tục nghiên cứu (xem bảng 3.3) Bảng 3.3: 10 chủng NS có khả năng sinh amylase cao STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập D-d (mm) 1 L45 Lá vàng 19,5 2 LM23 Lá mục 18 3 LM53 Lá mục 18,5 4 LM54 Lá mục 18 5 CK11 Cành khô 23 6 CM8 Cành mục 21 7 CM10 Cành mục 19 8 CM26 Cành mục 18 9 Đ10 Đất mặt 20,5 10 Đ56 Đất mặt 19 (Số liệu rút ra từ bảng 3.2 và phụ lục 1)  Tuyển chọn lần 2 Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym amylase của 10 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ α – amylase theo phương pháp Heinken trong phần 2.3.3.1 và xác định lượng đường khử trong phần 2.3.3.2 Kết quả trình bày trong bảng 3.4 Bảng 3.4. Hoạt độ α – amylase và lượng đường khử của 10 chủng NS (đơn vị IU/g) STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập D-d (mm) Hoạt độ α- amylase (UI/g) Hoạt độ Glucoamylase (UI/g) 1 L45 Lá vàng 19,5 42.628 273.467 2 LM23 Lá mục 18 49.038 380.800 3 LM53 Lá mục 18,5 79.487 1015.467 4 LM54 Lá mục 18 39.423 866.133 5 CK11 Cành khô 23 34.615 516.133 6 CM8 Cành mục 21 76.282 264.133 7 CM10 Cành mục 19 53.846 418.133 8 CM26 Cành mục 18 73.077 492.800 9 Đ10 Đất mặt 20,5 166.026 1164.800 10 Đ56 Đất mặt 19 268.590 1612.800 Đồ thị 3.1. Hoạt độ α- amylase của 10 chủng NS Qua bảng 3.4 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym amylase của 10 chủng NS thu được có sự khác biệt. Đó là, khi khảo sát khả năng sinh amylase các chủng tập trung nhiều ở lá và thân nhưng chủng có hoạt độ amylase cao lại là chủng ở đất (Chủng Đ10, Đ56). Theo chúng tôi, có thể bào tử của các chủng NS có khả năng sinh amylase từ lá, thân đã phát tán ra MT và rơi xuống đất. Mặc khác, khi nuôi NS trong MT xốp chứa cơ chất cảm ứng, có nguồn gốc tự nhiên dễ làm phát huy khả năng sinh amylase tối đa của một số chủng NS. Cuối cùng, hai chủng NS đều có nguồn gốc từ đất mặt và đều có họat độ α-amylase, glucoamylase cao nhất nên được chúng tôi lựa chọn để nghiên cứu tiếp theo đó là chủng Đ10 và Đ56. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.1 và 3.2 3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại hai chủng NS 3.2.1. Phân loại NS đến chi  Chủng Đ10: Sau 3 ngày nuôi cấy trên MT Czapek Dox cải tiến và môi trường YEA ở nhiệt độ 300C, KL đạt đường kính 9mm. KL có dạng tròn, bột rời, bề mặt KL nhung mịn. Đồ thị 3.2. Hoạt độ glucoamylase của10 chủng NS Chủng Đ10 Mặt trước Mặt sau Hinh 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng Đ10 Sau 5 ngày nuôi cấy đường kính đạt 16,5mm; KL có viền màu trắng, bên trong có màu xanh đậm, không tiết sắc tố vào MT. Bào tử trần hình cầu, có màu trong đến xanh nhạt. Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể và phân loại đến chi của hai chủng NS Đặc điểm hình thái 2 chủng NS nghiên cứu Đặc điểm phân loại tương ứng theo Bùi Xuân Đồng (2004) C h ủ n g Đ 1 0 - Hình thái đại thể: KL tròn, nhung mịn, bột rời. Màu xanh đậm, mép viền trắng, mặt trái có màu trắng. Không có giọt tiết và sắc tố (Hình 3.1) - Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn vách. Cuống sinh bào tử không phân nhánh, khối bào tử trần, hình cầu nhẵn A sp er gi ll u s -Hình thái đại thể: KL tròn, dạng nhung mịn hay bột rời. Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn, phân nhánh, không màu hay màu nhạt. -Hình thái vi thể: Khối C h ủ n g Đ 56 - Hình thái đại thể: KL tròn, bề mặt trơn, nhung mịn, có màu nâu nhạt, mặt trái màu vàng nhạt, tiết sắc tố màu nâu cam vào MT. (Hình 3.2) - Hình thái vi thể: Khối bào tử trần, đỉnh bọng hình hoa cúc, cuống bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, bào tử trần hình cầu nhẵn. bào tử trần, đỉnh bọng có hình cột, giá bào trần hay ráp. Bọng đỉnh giá hình chùy hay chỉ thể bình. Bào từ hình cầu hay elip, nhẵn, ráp hay mịn  Chủng Đ56: Sau 3 ngày nuôi cấy trên MT Czapek Dox cải tiến và môi trường YEA ở nhiệt độ 300C, KL đạt đường kính 16mm. KL có dạng tròn, bột rời, bề mặt KL nhung mịn. sau 5 ngày nuôi cấy đường kính đạt 40,5mm; KL có viền màu trắng, bên trong có màu nâu đỏ, tiết sắc tố màu cam nâu vào MT. Hệ sợi màu trắng, cuống bào tử không phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, đỉnh bọng hình hoa cúc, bào tử trần, hình cầu, nhẵn. 3.2.2. Phân loại NS đến loài bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR) Từ kết quả trên chúng tôi tiến hành định danh đến loài hai chủng nấm tại NK – Biotek (Công ty Nam Khoa)  Kết quả xác định trình tự gen của chủng Đ10 Chủng Đ56 Mặt trước Mặt sau Khuẩn ty Bào tử Hinh 3.2. Hình thái đại thể và vi thể chủng Đ56 Sau khi tiến hành so sánh, đối chiếu với trình tự gen phân loại của loài này trên ngân hàng NCBI, độ trùng khớp là 258/258 (100%). Từ đó kết luận chủng Đ10 có tên loài là Aspergillus protuberus (Phụ lục 19 )  Kết quả xác định trình tự gen của chủng Đ10 Sau khi tiến hành so sánh, đối chiếu với trình tự gen phân loại của loài này trên ngân hàng NCBI, độ trùng khớp là 257/258 (99%). Từ đó kết luận chủng Đ56 có tên loài là Aspergillus terreus (Phụ lục 20). 3.3. Khảo sát một số yếu MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của NS 3.3.1. Khảo sát thời gian sinh trưởng của hai chủng NS Mỗi chủng NS có sự sinh trưởng và phát triển ở những thời gian khác nhau. Chúng tôi tiến hành cấy 2 chủng NS tuyển chọn vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL từ ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Thực hiện theo phương pháp 2.3.3.4 để khảo sát thời gian sinh trưởng của chúng. Kết quả trình bày ở bảng 3.6 và đồ thị 3.3 Bảng 3.6. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS Từ bảng 3.6 cho thấy từ ngày 1-5 hai chủng NS nghiên cứu có KL lớn dần theo thời gian, trong đó chủng A. protuberus có tốc độ sinh trưởng chậm, đến ngày thứ 5 là giai đoạn hình thành bảo tử thì sự sinh trưởng của chủng này chậm lại hẳn và kích thước KL nhỏ. Chủng A. terreus có tốc độ sinh trưởng rất mạnh và nhanh, tạo KL có kích thước lớn song đến ngày thứ 7 thì sự sinh trưởng cũng chậm dần, do thời gian này bắt đầu sinh bào tử. Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi RNM, vì nơi đây điều kiện sống khắc nghiệt đã phần nào hạn chế sự sinh trưởng của NS. Thời gian (ngày) Chủng 1 2 3 4 5 6 7 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 1,4 4,5 8,7 12 16,2 16,8 17 A. terreus 3,2 9,1 15,5 27,5 40,1 40,5 41 Trong khi đó, các chủng NS trên đất liền có thời gian sinh trưởng nhanh hơn, chỉ sau 3 ngày là có khả năng tạo bào tử. Còn các chủng NS ở RNM thì phải sau 5-7 ngày mới bắt đầu sinh bào tử. Điều này cho thấy, điều kiện sống khắc nghiệt ở RNM cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng NS nói riêng và hệ SV tồn tại ở đây nói chung. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.3 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS 3.3.2. Khảo sát nhiệt độ sinh trưởng của hai chủng NS Để xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn, chúng tôi cấy các chủng NS trên MT2, sau khi ủ 3 ngày ở các nhiệt độ khác nhau, chúng tôi thu được kết quả như bảng 3.7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS Qua kết quả trên cho thấy, 2 chủng NS sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dao động trong khoảng 35 – 400C và cao hơn nhiệt độ trung bình ở RNM Cần Giờ (30 - 320C). Có lẽ đây là những chủng NS có khả năng thích nghi khá tốt với điều kiện sống nơi này nên sinh trưởng được với cả giới hạn nhiệt độ cao hơn mức bình thường. Điều đó hoàn toàn phù hợp với nhận định của tác giả Nguyễn Thị Huệ, Từ Thị Hường (1997) [14] và nhiều tác giả khác cho rằng NS có nhiệt độ tối ưu 20 – 390C, và có khả năng sống ở nhiệt độ cao hơn trong giới hạn cho phép. Từ đó, cho thấy 2 chủng NS tuyển chọn có khả năng chịu nhiệt cao và thích nghi tốt với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.4 và hình 3.2 Nhiệt độ Chủng 250C 300C 350C 400C 450C Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 8 14 17 13 9 A.terrus 14 19 29 48 7 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS 3.3.3. Khảo sát pH sinh trưởng của hai chủng NS Để xác định pH thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS, chúng tôi tiến hành nuôi chủng NS theo phương pháp ở phần 2.3.3.3. Sau khi ủ NS 5 ngày trên các MT có pH khác nhau và mẫu đối chứng là MT1 pH 6,5. Kết quả xem ở bảng 3.8 và đồ thị 3.5 Bảng 3.8. Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng của hai chủng NS Từ bảng trên cho thấy, 2 chủng NS có khả năng mọc tốt trong khoảng pH rất rộng từ 3-8, nhưng pH thích hợp nhất cho sinh trưởng của 2 chủng là pH 5-6. So sánh với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH đến một số chủng NS ở RNM Cần Giờ của Khưu Phương Yến Anh (2007) [1] và Nguyễn Thị Lan Hương (2009) [15] thì pH thích hợp nhất cho sinh trưởng đều nằm ở khoảng pH 6-7, nhưng tất cả các chủng NS ở RNM đều có phổ hoạt động pH rất rộng 3-8. 0C pH Chủng NS 3 4 5 6 7 8 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 12 13,5 17 19 15 16,5 A.terrus 19 25 31,5 34 20 18,5 Trong khi đó, pH của RNM Cần Giờ tại thời điểm thu mẫu là pH 7,02. Như vậy ta có thể kết luận 2 chủng nấm A. protuberus và A. terreus thích nghi tốt với điều kiện MT của RNM Cần Giờ. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.5 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hai chủng NS 3.3.4. Khảo sát khả năng chịu mặn của hai chủng NS Một đặc điểm nổi bật ở RNM Cần Giờ là hệ NS phải chịu tác động của nồng độ NaCl khá cao. Để xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng NS nghiên cứu trong các nồng độ muối NaCl khác nhau, chúng tôi nuôi cấy NS trên MT1 theo phương pháp 2.3.3.3 có nồng độ NaCl thay đổi từ 0-20%. Kết quả xem ở bảng 3.9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS Từ bảng 3.9 cho thấy 2 chủng NS tuyển chọn đều có khả năng sinh trưởng tốt (d>10mm) trên MT nước ngọt lẫn nước mặn. Hai chủng này có thể sinh trưởng ở độ mặn 10-20%, tuy nhiên A. protuberus chỉ chịu được độ mặn cao nhất ở 3%, còn A. terreus chịu được độ mặn cao hơn từ 3-5%. Cả 2 chủng đều có nguồn gốc phân lập từ đất. Đây là các chi điển hình thường gặp ở đất liền (Tadayoshi I., Akira N., Tanichatoen and Leka M., 2001). Vì vậy, có thể chúng là các chủng NS du nhập, lâu dần thích ứng với MT nước lợ trong RNM Cần Giờ nên không phải là NS ưa mặn vì các nấm biển ưa mặn thường có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn (Nguyễn Hoàng Trí, 1999) [36] Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với quan điểm của Mai Thị Hằng và cộng sự (2001) [10], [12]; Nguyễn Thị Lan Hương (2009) [15] khi khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng NS, và kết luận hầu hết đây là các chủng du nhập từ đất liền. Độ mặn (%) Chủng NS 0 1 3 5 10 20 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 9 11 17 16 15 5 A. terreus 18 20 26 25 13 4 Khả năng chịu mặn của các chủng NS cho thấy chúng là những VSV thường trú của RNM, thậm chí ngay cả khi triều rút đất bị phơi nắng và trở nên mặn hơn. Chúng là tác nhân không thể thiếu và rất quan trọng của hệ sinh thái RNM. 3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Cacbon đến sự sinh trưởng của hai chủng NS Cacbon có vai trò kích thích hoạt động của VSV và cung cấp môi trường thuận lợi hơn để VSV tổng hợp enzyme rồi tích lũy nó trong đất của RNM (Dinesh et al., 1998). Nuôi cấy 2 chủng NS tuyển chọn lên MT1, thay glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau để khảo sát khả năng đồng hóa cacbon của chúng. Sau thời gian ủ 5 ngày, tiến hành đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm bằng cách đo đường kính KL d (mm). Kết quả trình bày ở bảng 3.10 Bảng 3.10. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của hai chủng NS Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đều có khả năng sinh trưởng trên các nguồn cacbon khác nhau. Tuy nhiên chúng sinh trưởng yếu, chỉ có A. terreus có khả năng sinh trưởng khá tốt trên nguồn cacbon sucrose (d=17,4mm). So với nuôi trên MT1 làm đối chứng có chứa nguồn cacbon là glucose cho thấy chúng sinh trưởng mạnh hơn hẳn. Sở dĩ, có sự khác nhau này do glucose là nguồn cacbon dễ đồng hóa nhất của hầu hết các VSV. Ngoài ra, giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của NS còn phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hóa học của nguồn cacbon, tùy vào từng chủng NS. Nguồn cacbon Chủng NS Lactose Sucrose Maltose Sorbitol Galactose Glucose Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 8,3 9,7 6,9 8,2 10,2 12 A. terreus 7,1 17,4 12,1 11,2 6,2 25 Hình 3.4. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng A. protuberus 3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng NS NS cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Tuy nhiên, mỗi loại NS lại hấp thụ được những nguồn nitơ khác nhau. Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng đồng hóa các nguồn thức ăn nitơ khác nhau của 2 chủng NS tuyển chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3. 11 Bảng 3.11. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của hai chủng NS Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đểu có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ khác nhau. Trong đó, mỗi chủng có sự sinh trưởng khác nhau theo từng loại nitơ. Sở dĩ có sự khác nhau này là do giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của NS phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hóa học của từng loại nitơ và tùy vào từng chủng NS. Với chủng A. protuberus sinh trưởng mạnh ở bột đậu nành (d=13,4mm), còn chủng A. terreus lại sinh trưởng rất mạnh ở nguồn nitơ cao thịt (d=38,5mm). Một điều dễ nhận ra là cả 2 chủng NS đều sử dụng nguồn nitơ hữu cơ dễ hấp thụ. Nguồn nitơ ở đây là các hợp chất protein vừa làm nguồn N và nguồn C, đồng thời còn cũng cấp các chất sinh trưởng cần thiết cho sự tổng hợp các sản phẩm và hệ enzym để tiến hành các phản ứng sinh hóa theo hướng có lợi (Nguyễn Đức Phẩm, 2004) [26]. Nguồn nitơ Chủng NS Bột đậu nành Cao thịt Casein Ure NH4NO3 NaNO3 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 13,4 11,8 10,1 9,1 10,8 12 A. terreus 12,3 38,5 15,7 7,2 12,7 31 Hình 3.5. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của chủng A. terreus Hình 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của 2 chủ