Luận văn Nghiên cứu tổng hợp một số aurone và hoạt tính sinh học của chúng

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 3

1.1. CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID. 3

1.1.1. Hợp chất flavonoid 3

1.1.2. Các hợp chất aurone 5

1.2. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA AURONE 6

1.2.1. Aurone trong hóa học trị liệu ung thư 7

1.2.1.1. Aurone như là chất điều chỉnh sự kháng đa thuốc qua protein Pgp 7

1.2.1.2. Sự ức chế của Cyclin-Dependent Kinases (CDK) 8

1.2.1.3. Tương tác của các aurone với thụ thể adenosine 10

1.2.1.4. Aurone chống ung thư thông qua sự phân chia DNA 10

1.2.1.5. Aurones ức chế hình thành mạch máu khối u 11

1.2.1.6. Aurones như những tác nhân chống oxi hóa 12

1.2.2. Aurones kháng kí sinh trùng 13

1.2.3. Aurone như là tác nhân kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm 15

1.2.4. Aurone như tác nhân chống virus 16

1.2.5. Aurone trong điều trị bệnh về da 18

1.2.6. Aurone trong điều trị bệnh tiểu đường 19

1.3. TỔNG HỢP AURONE 19

1.3.1. Cơ sở phương pháp tổng hợp aurone 20

1.3.1.1. Phản ứng Houben - Hoesch 20

1.3.1.2. Phản ứng theo Friedel - Crafts 21

1.3.1.3. Phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt 21

1.3.2. Tổng hợp aurone từ benzofuranone 22

1.3.2.1. Tổng hợp tiền chất benzofuranone 22

1.3.2.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ benzofuranone 25

1.3.3. Tổng hợp aurone từ chalcone 31

1.3.3.1. Tổng hợp tiền chất chalcone 31

1.3.3.2. Các phương pháp tổng hợp aurone từ chalcone 32

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1.1. Phương pháp phân lập các hợp chất 35

2.1.2. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm 35

2.1.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 36

2.1.4. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của các chất tổng hợp được. 36

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 38

3.1. TỔNG HỢP MỘT SỐ AURONE 38

3.1.1. Tổng hợp chất trung gian chìa khóa 4,6-dihyroxybenzofuran-3(2H)-one (5b) 39

3.1.2. Tổng hợp các hydroxyaurone (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) và (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (76) 42

3.1.3. Tổng hợp các methoxyaurone (Z)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxy-benzofuran-3(2H)-one (55) và (Z)-2-[(4-methoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (77) 44

3.1.4. Tổng hợp các aurone có nhóm thế OMe ở vòng A và nhóm thế hydroxyl ở vòng B. 45

3.1.5. Tổng hợp các aurone có nhóm thế nhóm thế hydroxyl ở vòng A và nhóm thế OMe ở vòng B (chất 78, chất 79). 47

3.2. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO CỦA NHỮNG AURONE ĐÃ TỔNG HỢP ĐƯỢC .48

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51

4.1. PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC AURONE 51

4.1.1. Điều chế chất trung gian chìa khóa benzofuranone 51

4.1.2. Phản ứng methyl hóa tổng hợp methoxybenzofuranone (18) 55

4.1.3. Phản ứng ngưng tụ benzofuranone với các benzaldehyde 56

4.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO 70

 KẾT LUẬN 73

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 90

 

 

doc123 trang | Chia sẻ: mimhthuy20 | Lượt xem: 501 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Luận văn Nghiên cứu tổng hợp một số aurone và hoạt tính sinh học của chúng, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
e (73) được brom hóa chọn lọc tại vị trí α của nhóm carboxyl nhờ xúc tác TBATB với sự có mặt của CaCO3 trong CH2Cl2/MeOH (5/2) kèm theo là sự tấn công của methoxy từ dung môi tại vị trí β sinh ra sản phẩm 74. Xử lý hợp chất này bởi KOH trong EtOH/H2O (4/1), nhóm 2’-acetoxy sẽ bị thủy phân tạo phenolate, thuận lợi cho việc đóng vòng, đồng thời tách loại phân tử methanol tạo liên kết đôi ở vị trí 2-aurone, hình thành aurone 75 tương ứng. CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp phân lập các hợp chất Sắc ký lớp mỏng (TLC) Sắc ký lớp mỏng được thực hiện với bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch ceri sulfat trong acid H2SO4, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu. Sắc ký lớp mỏng điều chế Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đè tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất; sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp. Sắc ký cột (CC) Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Silica gel pha đảo YMC RP-18 (30- 50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 ((Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.). Sắc lý lỏng cao áp (HPLC) Sắc ký lỏng cao áp Agilent technologies 1200 Series của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp tổng hợp và tinh chế sản phẩm - Các phản ứng được thực hiện bằng các phương pháp tổng hợp hữu cơ cơ bản như phương pháp khử, phương pháp oxi hóa, phương pháp ankyl hóa, phương pháp glucosyl hóa ... Ngoài ra còn sử dụng một số phương pháp tổng hợp hữu cơ đặc thù như: phản ứng Houben - Hoesch, phản ứng ngưng tụ Claisen - Schmidt... - Phương pháp sắc ký lớp mỏng được sử dụng để giám sát tiến trình xảy ra của các phản ứng hóa học và phân tích chất lượng sản phẩm của phản ứng. - Các hợp chất sau phản ứng được phân lập và tinh chế bằng các phương pháp chiết, phương pháp sắc ký cột, phương pháp kết tinh,... - Tất cả các hóa chất dùng trong quá trình tổng hợp được mua từ các hãng: Sigma Aldrich, Merck và sử dụng mà không cần tinh chế lại. - Các dung môi sử dụng được cất lại hoặc làm khan theo điều kiện phản ứng. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: Phổ hồng ngoại (FT-IR) được đo bằng máy NICOLET IMPACT-410 FTIR của hãng Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ khối lượng (ESI-MS) được ghi trên máy Agilent 6310 ion trap tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều sử dụng chất nội chuẩn là TMS (δ = 0ppm), dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6 được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ở tần số 500,13 MHz cho phổ 1H-NMR và ở tần số 125,76 MHz cho phổ 13C-NMR. Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ và so sánh tài liệu. Khảo sát hoạt tính độc tế bào của các chất tổng hợp được. Vật liệu nghiên cứu Hoá chất: Các aurone tổng hợp: Chất 55, chất 56, chất 76, chất 77, chất 78, chất 80, chất 81 Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen v.v. Các dòng tế bào ung thư: do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM TỔNG HỢP MỘT SỐ AURONE Các aurone đã được tổng hợp theo phương pháp phổ biến nhất là ngưng tụ giữa các benzofuranone với các benzaldehyde. Chất trung gian chìa khóa 3,4-dihydroxybenzofuranone (5b) không sẵn có trên thương mại đã được nghiên cứu tổng hợp theo 2 phương pháp từ phloroglucinol một hợp chất sẵn có trong thương mại. Các aurone cũng được nghiên cứu tổng hợp theo các phương pháp khác nhau để thu được các hydroxyaurone (chất 56, chất 76); các methoxyaurone (chất 55, chất 77); các aurone với nhóm thế methoxy ở vòng A và nhóm thế hydroxyl ở vòng B (chất 80, chất 81); các aurone với nhóm thế hydroxy ở vòng A và nhóm thế methoxy ở vòng B (chất 78, chất 79) (Hình 43). Sơ đồ phản ứng: Hình 43 : Sơ đồ tổng hợp các aurone có các nhóm thế khác nhau. a. ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b. 1) HCl, hồi lưu; 2) MeONa/MeOH, hồi lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c. H2O, hồi lưu (Hiệu suất a, c: 41%); d. MeI/K2CO3 (69,5% - 77%); e. 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4-hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (52-65%);g. 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4-methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (74 %-72%) ;h. 3,4-dimethoxybenzaldehyde hoặc 4-methoxybenzaldehyde, HCl/MeOH hoặc NaOH/MeOH, (89% - 93%); m. 3,4-dihydrobenzaldehyde hoặc 4-hydroxybenzaldehyde, HCl/MeOH (64%-77%). Tổng hợp chất trung gian chìa khóa 4,6-dihyroxybenzofuran-3(2H)-one (5b) Chất trung gian chìa khóa benzofuranone 5b đã được nghiên cứu tổng hợp theo 2 phương pháp: Phương pháp 1 Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân không và nạp đầy khí N2 cho hỗn hợp của phloroglucinol (25,2 g; 0,2 mol) trong diethyl ether khan (500 mL) được làm lạnh đến 00C. Hỗn hợp chloroacetonitrile (15,1 g; 0,2 mol) và ZnCl2 (2,7 g; 0,02 mol) được nạp thêm vào bình phản ứng. Sục khí HCl vào hỗn hợp phản ứng trong 2 h ở 00C. Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy qua đêm. Sau đó lọc, rửa kết tủa với diethyl ether và sấy khô trong chân không, thu được chất rắn (3). Hợp chất 3 được hòa tan trong nước nóng (500 mL) và đun hồi lưu trong 7 h. Sau đó, hỗn hợp này được làm lạnh xuống nhiệt độ phòng. Các kết tủa trắng được thu thập bằng cách lọc, rửa sạch bằng nước và sấy khô trong chân không thu được 5b (21,2 g, 65%). Phương pháp 2 Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân không và nạp đầy khí N2 cho hỗn hợp của phloroglucinol (25,2 g; 0,2 mol) trong diethyl ether khan (500 mL ) được làm lạnh đến 00C. Hỗn hợp chloroacetonitrile (15,1 g; 0,2 mol) và ZnCl2 (2,7 g; 0,02 mol) được nạp thêm vào bình phản ứng. Sục khí HCl vào hỗn hợp phản ứng trong 2 h ở 00C. Hỗn hợp phản ứng được tiếp tục khuấy qua đêm. Sau đó lọc, rửa kết tủa với diethyl ether và sấy khô trong chân không, thu được 30,6 g muối iminium (3). Muối iminium 3 được hòa tan trong dung dịch HCl 1N (643 mL), khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 h (xuất hiện kết tủa trắng) và sau đó đun hồi lưu trong 2 h. Hỗn hợp này được làm lạnh xuống 6oC qua đêm. Các kết tủa thu được bằng cách lọc, rửa sạch với nước lạnh, sấy khô trong chân không và hòa tan trong dung dịch MeONa/MeOH 1,8 M (195 mL). Dung dịch thu được được đun hồi lưu trong 2 h, sau đó làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và trung hòa với dung dịch HCl 1N (22 mL). Cất loại methanol, phần còn lại được chiết với ethyl acetate (40 mL). Dịch chiết được rửa lại bằng nước và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung môi thu được 5b (15,5 g) trong 46,5% sản lượng qua 2 bước. Chất 3 T0n/c: 239-232 oC 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 12,60 , 11,02 , 9,86 (3H, br s, 2 × s, 3 × OH), 6,33 , 6,08 (2H, 2 × d, J = 1,5 Hz, H-3, H-5), 5,44 (2H, s, CH2). 13C-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 175,9, 173,6, 173,0, 160,6 (Ph C-2, C-4, C-6, C=NH2+), 99,41 (Ph C-1), 97,13 , 90,14, (Ph C-3, C-5), 75,35 (CH2). Chất 5b T0n/c: 252-254oC; 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 10,54 (2H, br s, OH), 5,91(2H, s, H-5, H-7), 4,55 (2H, s, C-2). 13C-NMR(125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 194,0 (C=O), 175,6 , 167,6 , 157,5 (C-4, C-6, C-8), 102,7 , 96,2 , 90,1(C-5, C-7, C-9), 74,8 (C-2). Tổng hợp 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18) Trong bình cầu 3 cổ được lắp sinh hàn, bơm hút chân không và nạp đầy khí N2 cho hỗn hợp 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 10 mmol) trong DMF (30 mL) và K2CO3 (20 mmol), cho tiếp từ từ methyl iodide (30 mmol) vào hỗn hợp và được đun ở 80oC trong 1 giờ. Nước đá đã được thêm vào hỗn hợp phản ứng. Dung dịch được chiết với EtOAc. Dịch chiết EtOAc được làm khan bởi Na2SO4 sau đó cất dưới áp suất giảm loại dung môi. Cặn chiết được kết tinh trong hỗn hợp của n-hexane / EtOAc thu được dimethoxybenzofuranone 18 với hiệu suất 77%, sản phẩm là một chất rắn màu trắng, T0n/c: 132-134oC. 1H-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 6,35 và 6,16 (2H, 2 × d, J = 1,8 Hz, H-5 và H-7), 4,64 (2H, s, H-2), 3,85 (3H, s, OCH3), 3,82 (3H, s, OCH3). 13C-NMR (DMSO-d6): δ (ppm) 193,9 (C=O), 176,2 , 169,1 , 158,2 (C-8, C-6, C-4), 104,0 (C-9), 92,8 , 89,3 (C-5, C-7), 75,2 (C-2), 55,8 và 56,2 (2 × OCH3). Tổng hợp các hydroxyaurone (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) và (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (76) Các hydroxyaurone đã được nghiên cứu tổng hợp bằng phản ứng ngưng tụ trực tiếp giữa các hydroxybenzofuranone với các hydroxybenzaldehyde sử dụng xúc tác HCl/MeOH ở nhiệt độ phòng . Tổng hợp (Z)-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (56) Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho hỗn hợp 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 1,0 mmol) và 3,4-dihydroxybenzaldehyde (1,0 mmol) trong methanol (14 mL), HCl 36,0% (2,4 eq) được thêm vào ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 h cho đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đó cất loại bỏ methanol, phần còn lại được chiết với EtOAc (3 × 10 mL). Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thô. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột trên silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất 56 với hiệu suất 52%. Hợp chất 56 là một chất rắn màu vàng. T0n/c: 282-283°C FT-IR: νKBr (cm-1): 3469, 3357, 3120, 3039, 2896, 2852, 1654, 1562, 1527, 1449, 1340, 1293, 1245, 1155, 1063, 846, 805, 675, 548, 505, 460. ESI-MS (negative): m/z = 285 [M-H]-. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 10,81, 9,53, 9,19 (4H, 3 × brs, 4 × OH); 7,38 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 7,17 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6′), 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5′), 6,44 (1H, s, H-10), 6,17 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 6,06 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5). 13C NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 179,0 (C=O), 167,5 (C-8), 166,9 (C-6), 158,1 (C-4), 147,4 (C-4’), 145,9 (C-2), 145,4 (C-3’), 123,9 (C-6’), 123,6 (C-1’), 117,6 (C-2’), 115,9 (C-5’), 109,6 (C-10), 102,9 (C-9), 97,6 (C-5), 90,3(C-7). Tổng hợp (Z)-2-[(4-hydroxyphenyl)methylene]-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (76) Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ trực tiếp giữa (5b, 1,0 mmol) với 4-dihydroxybenzaldehyde (1,0 mmol) thu được chất 76 với hiệu suất 65 %. Chất 76 là một chất rắn màu vàng. T0n/c: 292-294°C FT-IR: νKBr (cm-1): 3349, 2922, 1682, 1610, 1462, 1358, 1251, 1154, 1071, 819, 704, 618, 565. ESI-MS (negative): m/z = 269 [M-H]-. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 7,74 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-2′, H-6′), 6,85 (2H, d, J = 8,7 Hz, H-3′, H-5′), 6,54 (1H, s, H-10), 6,20 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-5), 6,06 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-7). 13C -NMR (125 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 179,2 (C=O), 167,6 , 167,2 , 158,8 , 158,3 (C-8, C-6, C-4, C-4’), 146,1 (C-2), 132,8 ( C-2’, C-6’), 123,4 (C-1’), 116,0 (C-3’, C-5’), 109,2 (C-10), 102,9 , 97,7 , 90,5 (C-5, 7, 9). Tổng hợp các methoxyaurone (Z)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxy-benzofuran-3(2H)-one (55) và (Z)-2-[(4-methoxyphenyl)methylene]-4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (77) Các methoxyaurone có các nhóm thế hydroxyl đã được methyl hóa (chất 55, chất 77) được ngưng tụ từ các methoxybenzofuranoen với các methoxybenzaldehyde có thể được tiến hành theo 2 phương pháp sử dụng xúc tác acid hoặc xúc tác base. Phương pháp 1: Ngưng tụ trong môi trường kiềm Trong bình cầu 3 cổ 50 mL, hỗn hợp dung dịch của 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one (18, 10 mmol) và 3,4-dimethoxybenzandehyde (10 mmol) trong MeOH (10 mL), được cho thêm dung dịch của KOH/MeOH (7,5 mg/15 mL). Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở 60oC trong 30 phút, sau đó giảm xuống nhiệt độ phòng và trung hòa bằng HCl 10% cho đến pH = 3. Kết tủa màu vàng hình thành được lọc, rửa bằng hỗn hợp MeOH / H2O (1/1) và kết tinh trong MeOH / H2O (10/1) thu được tinh thể hình kim màu vàng 55 (89%). Phương pháp 2: ngưng tụ trong môi trường acid Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho 4,6-dimethoxybenzofuran-3(2H)-one 18 (10 mmol) trong methanol (140 mL), 3,4-dimetoxylbenzandehyde (10 mmol) và HCl (24 mmol). Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng 24 h cho đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đó cất loại bỏ methanol, phần còn lại đã được chiết với EtOAc (3 × 10 mL). Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thô. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột ngắn trên silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất rắn màu vàng (91%) Chất 55, tinh thể hình kim màu vàng , T0n/c= 169-170oC FT-IR: νKBr (cm-1): 3010, 2946, 2840, 1690, 1603, 1514, 1421, 1250, 1099, 813, 469. ESI-MS: m/z = 343 [M + H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 7,54 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2'), 7,51 (1H, dd, J = 8,5, 1,5 Hz, H-6 '), 7,05 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5'), 6,68 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-5), 6,67 (1H, s, H-10), 6,31 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-7), 3,90, 3,88, 3,83 và 3,82 (12H, s, 4 × OCH3), . 13C-NMR (125 MH, DMSO-d6): δ (ppm) 178,8 (C=O), 168,7, 168,0 , 158,8,(C-8, C-6, C-4), 150,2 , 148,7, 146,1(C-2, C-3 ', C-4' ), 124,9 (C-1'), 124,8 (C-6 '), 114,0 , 111,9, 110,2 (C-10, C-2 ', C-5'),104,2 (C-9), 94,3 , 89,8 (C-5, C-7), 56,5 , 56,1 và 55,6 (4 × OCH3). Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ chất 18 với 4-methoxylbenzaldehyde thu được aurone 77 ngưng tụ trong môi trường kiềm với hiệu suất 90% và ngưng tụ trong môi trường acid với hiệu suất 93% . Chất 77 là chất lỏng dạng dầu màu vàng. FT-IR: νKBr (cm-1): 2933, 2833, 1690, 1604, 1500, 1453, 1343, 1251, 1083, 1012, 822, 641, 550, 431. 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,80 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, H-6’), 6,93 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, H-5’), 6,72(1H, s, H-10), 6,34 và 6,08 (2H, 2 × d, J = 1,7 Hz, H-5 và H-7), 3,93, 3,88, 3,84 (9H, 3 × s, 3 × OCH3). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 180,5 (C=O), 168,7, 168,6 (C-8, 6), 160,5 , 159,3 (C-4, 4’), 146,7 (C-2), 132,8 (C-2’, 6’), 125,3 (C-1'), 114,3 (C-3’, 5’), 110,9 (C-10), 105,4 (C-9), 93,9 , 89,1 (C -5, C-7), 56,1 , 56,0 và 55,2 (3 × OCH3). Tổng hợp các aurone có nhóm thế OMe ở vòng A và nhóm thế hydroxyl ở vòng B. Tổng hợp Z-2-[(3,4-dihydroxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxy-3(2H)-benzofuranone (80) Hệ phản ứng gồm bình cầu 50 ml, được lắp sinh hàn, con khuấy từ, được hút chân không và nạp đầy N2. Hợp chất 18 ( 196 mg, 1 mmol) được hòa tan trong MeOH( 30ml). Hợp chất 3,4 dihydroxybenzandehyde ( 138 mg, 1mmol) được bổ sung thêm vào hỗn hợp phản ứng. Nhỏ từ từ hỗn hợp HCl/ MeOH ( 0.1 ml/ 5 ml) vào phản ứng, hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12 giờ, sau khi phản ứng kết thúc thấy xuất hiện tinh thể màu vàng. Lọc, rửa tinh thể bằng MeOH, phần dịch lọc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm,được chiết với EtOAc và được chạy qua cột silica gel pha thường, hệ dung môi rửa giải n-hexan/ EtOAc ( 3/1 v/v) thu được 201,6 g chất 80 chất rắn màu vàng với hiệu suất 64%. Chất 80 là tinh thể màu vàng FT-IR (KBr) νmax cm-1: 3420, 2941, 1671, 1595, 1524, 1434, 1347, 1262, 1214, 1104, 904, 817, 690, 523, 456. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,87, 3,91 (6H, 2 × s, 2 × CH3), 6,32 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,54 (1H, s, CH), 6,61 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 6,81 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,2(1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,4 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2’), 9,17, 9,64 ( br s, 2 H, 2 × OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 49,1, 56,7 (2 ×CH3), 90,2, 94,8 (C -5, C-7), 104,9 (C-3a), 111,5, 116,5, 118,5 (CH, C-2’, C-5’), 124,0 (C-6’), 124,8 (C-1’), 146,0, 146,1, 148,4( C-2, C-3’, C-4’), 159,4, 168,4, 169,1 (C-4, C-6, C-7a), 179,4(CO). Tổng hợp Z-2-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-4,6-dimethoxy-3(2H)-benzofuranone (81). Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ chất 18 với 4-hydroxylbenzaldehyde thu được aurone 81 với hiệu suất 77%. Hợp chất 81 dạng tinh thể màu vàng chanh. FT-IR (KBr) νmax cm-1: 3305, 3015, 1682, 1616, 1583, 1517, 1443, 1264, 1215, 1152, 1099, 811, 676, 558, 481. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,87, 3,90 (6H, 2 × s, 2 × CH3), 6,31(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,63 (1H, s, CH), 6,66 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 6,86 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,2 (1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,7 (1H, d, J = 1,8 Hz, H-2’), 10,1 ( br s, 1H, 1× OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 56,07, 56,43 (2× CH3), 89,7, 94,2 (C -5, C-7), 104,2 (C-3a), 110,4, 115,9, 123,08 (CH, C-2’, C-5’), 133,02 (C-6’), 124,8 (C-1’), 145,64, 158,76( C-2, C-3’, C-4’), 159,09, 167,91, 168,56 (C-4, C-6, C-7a), 178,87(CO). Tổng hợp các aurone có nhóm thế hydroxyl ở vòng A và nhóm thế OMe ở vòng B (chất 78, chất 79). Tổng hợp Z-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-4,6-dihydroxy-3(2H)-benzofuranone (78). Trong bình cầu 3 cổ 50 mL đã nạp đầy khí nitơ cho hỗn hợp 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 1,0 mmol) và 3,4-dimethoxylbenzaldehyde (1,0 mmol) trong methanol (14 mL), HCl 36,0% (2,4 eq) được thêm vào ở nhiệt độ phòng. Hỗn hợp phản ứng được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 24 h cho đến khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM). Sau đó cất loại bỏ methanol, phần còn lại được chiết với EtOAc (3 × 10 mL). Dịch chiết được rửa sạch bằng 10% dung dịch NaCl và làm khan bằng Na2SO4. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được sản phẩm thô. Tinh chế sản phẩm bằng cách chạy qua cột trên silica gel, hệ dung môi rửa giải n-hexane / EtOAc (1/1) thu được chất 78 với hiệu suất 74% . Hợp chất 78 là một chất rắn màu vàng. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,11, 3,16 (6H, 2 × s, 2× CH3), 6,07(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,22 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 6,58 (1H, s, CH), 7,05 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,5 (1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,5 (1H, d, J=1,7 Hz, H-2’), 10,8 ( br s, 2 H, 2× OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 55,5 (2 × CH3), 90,5, 97,6 (C -5, C-7), 102,7 (C-3a), 108,8, 111,9, 113,9 (CH, C-2’, C-5’), 124,4 (C-6’), 125,0 (C-1’), 146,5, 148.6, 149,9 ( C-2, C-3’, C-4’), 158,2, 167,1, 167,5 (C-4, C-6, C-7a), 178,9 (CO). Tổng hợp Z-2-[(4-methoxylphenyl)methyl]-4,6-dihydroxyl-3(2H)-benzofuranone (79) Tiến hành tương tự phản ứng ngưng tụ giữa 4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one (5b, 1,0 mmol) với 4-dimethoxylbenzaldehyde (1,0 mmol) thu được hợp chất 79 là một chất rắn màu vàng, hiệu suất 72 %. Hợp chất 79 là một chất rắn màu vàng. 1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6): δ ( ppm) 3,82 (3H, s, CH3), 6,07(1H, d, J = 1,7 Hz, H-5), 6,59 (1H, s, CH), 6,21 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-7), 7,03(1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’), 7,05(1H, dd, J = 8,4, 1,8 Hz, H-6’), 7,87 (1H, d, J=1,7 Hz, H-2’), 10,87( br s, 2 H, 2× OH) 13C-NMR ( DMSO-d6): δ (ppm) 55,2 (CH3), 90,4 , 97,6(C -5, C-7), 102,7 (C-3a), 108,4, 114,5, 124,8 (CH, C-2’, C-5’), 132,4 (C-6’), 124,8 (C-1’), 132,4, 146,4, 158,2( C-2, C-3’, C-4’), 160,0, 167,1, 167,6 (C-4, C-6, C-7a), 178,9(CO). KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ĐỘC TẾ BÀO CỦA NHỮNG AURONE ĐÃ TỔNG HỢP ĐƯỢC. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: Chất thử (10 ml) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ nồng độ 100mg/ml, 20 mg/ml; 4 mg/ml; 0.8 mg/ml; 0.16 mg/ml. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 ml môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 2 ngày. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180ml) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: [OD(chất thử) - OD(ngày 0)] x 100 % sống sót = OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) % ức chế = 100% - % sống sót Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 mg/ml; 2 mg/ml; 0,4 mg/ml; 0,08 mg/ml. DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve. Chất thử nào có IC50 < 20 mg/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 £ 4 mg/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP CÁC AURONE Các aurone có thể được tổng hợp theo nhiều phương pháp như ngưng tụ các benzofuranone với các benzaldehyde hoặc từ đóng vòng các chalcone hoặc sử dụng xúc tác cho sự đóng vòng ketone... Trong đó, phương pháp ngưng tụ giữa các benzofuranone với các benzaldehyde là phương pháp phổ biến, vì vậy chúng tôi đã nghiên cứu tổng hợp các aurone theo phương pháp này đi từ các nguyên liệu sẵn có thương mại. Điều chế chất trung gian chìa khóa benzofuranone Chất trung gian chìa khóa được tổng hợp qua 2 giai đoạn như trong hình 44 Hình 44 Sơ đồ tổng hợp chất trung gian 5b a. ClCH2CN, Et2O, ZnCl2, HCl 0°C, 24 h; b. 1) HCl, hồi lưu; 2) MeONa/MeOH, hồi lưu (Hiệu suất a, b: 46%); c. H2O, hồi lưu (Hiệu suất a, c: 41%). Hợp chất benzofuranone 5b, là chất chìa khóa trung gian quan trọng trong tổng hợp aurone, được tổng hợp qua 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên là phản ứng ngưng tụ giữa phloroglucinol và chloroacetonitrile trong sự có mặt của ZnCl2, sau đó hỗn hợp phản ứng được sục khí HCl tạo nên muối iminium (3) (42%). Muối 3 sau đó được thủy phân đóng vòng để tạo 5b. Hợp chất 2-(2-chloro-1-iminoethyl)-1,3,5-benzenetriol hydrochloride (3) Phản ứng ngưng tụ của phloroglucinol với chloroacetonitrile là phản ứng acyl hóa Fridel-Crafts các hợp chất phenol nói chung với các hợp chất nitrile, được phát hiện ra một cách độc lập bởi 2 nhà khoa học Hoesch (1927) và Houben (1926). Vì vậy, nó còn được gọi là phản ứng Hoesch hay phản ứng Houben - Hoesch. Phản ứng được thực hiện giữa hợp chất phenol hay dẫn xuất của nó với nitrile và HCl trong sự có mặt của xúc tác axit Lewis trong ether khan. Cơ chế phản ứng xảy ra như Hình 45 Hình 45 Sơ đồ cơ chế hình thành muối 3 Xúc tác Lewis ZnCl2 hoạt hóa tác nhân nitrile hình thành carbocation ái electrophile, tạo điều kiện thuận lợi cho các electrone thơm của nhân phenol tấn công hình thành hợp chất imine đồng thời giải phóng ZnCl2. Trong môi trường acid hợp chất imine tạo muối iminium kết tủa. Chất 3 là chất : 2-(2-chloro-1-iminoethyl)-1,3,5-benzenetriol hydrochloride Cấu trúc phân tử của hợp chất muối imine này đã được khẳng định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H, 13C-NMR . Trên phổ 1H-NMR ta thấy xuất hiện các tín hiệu singlet của nhóm methylene (CH2) ở δH 5,44. Ở vùng trường thơm xuất hiện 2 doublet của 2 proton tương tác meta với J = 1,5 Hz ở δH 6,33 và δH 6,08. Ở trường thấp hơn là 3 tín hiệu singlet của 3 nhóm OH ở δH 12,06, 11,02, 9,86. Phổ 13C-NMR của hợp chất này cũng cho 8 tín hiệu của 8 carbon phù hợp với số carbon và cấu trúc phân tử gồm tín hiệu carbon của nhóm methylene ở δC 75,35; 3 tín hiệu của 3 carbon hệ thơm ở δC 99,41 (Ph C-1), δC 97,13 và 90,14

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • docluanvanthacsi_dinhdangword_184_1985_1869858.doc
Tài liệu liên quan