Luận văn Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình

hạy trong thực nghiệm khác nhau dao động từ 1 đến 10 thể cơ bản (EB) mỗi phản ứng. Để tìm những điều kiện tốt nhất cho các xét nghiệm, thử nghiệm nồng độ khác nhau cho các thành phần của phản ứng, khối lượng và số chu kỳ khuếch đại. Kết quả tối ưu đạt được với phản ứng PCR đầu tiên trong 30 µl thể tích cuối cùng, có chứa 2.5 nmol dNTP mỗi loại, KL5/KL6 6 pmol mỗi mồi và 25 chu kỳ, tiếp theo với 50 µl của hỗn hợp phản ứng thứ hai và 35 chu kỳ. Cuối cùng, để xác định xem phản ứng có là một thử nghiệm chung xác định C.trachomatis hay không, các thí nghiệm tiến hành bằng cách sử dụng các mẫu khác để xét nghiệm. Kiểm tra cho thấy độ nhạy tương tự đối với mẫu nước tiểu, dịch niệu đạo, dịch nhày mũi họng, và bệnh phẩm từ mắt. Kết quả cho thấy nested PCR đối với phát hiện của C.trachomatis trong các mẫu lâm sàng là rất nhạy, có thể phát hiện ít hơn 10 EB mỗi phản ứng trong các mẫu sinh học khác nhau; loại bỏ đến mức thấp nhất việc phát hiện các kết quả âm tính giả bằng cách sử dụng một kiểm soát nội bộ khuếch đại; đủ mạnh để đối phó với các điều kiện thay đổi trong các phòng thí nghiệm khác nhau. 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước Tại Thành phố Hồ Chí Minh, một số nghiên cứu trong cộng đồng cho thấy tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ thay đổi từ 18% đến 32.5%, trong đó một số yếu tố nguy cơ được nhận diện như số bạn tình, độ tuổi bắt đầu quan hệ tình dục, tiền căn bệnh phụ khoa. Năm 1995, khảo sát tỷ lệ hiện mắc bệnh lây truyền qua đường tình dục được Vụ Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đình của Bộ Y Tế thực hiện ở Việt Nam [29]. Đối tượng là các phụ nữ đến khám tại Trung Tâm Sức Khỏe Bà Mẹ Trẻ Em và Kế Hoạch Hóa Gia Đình thành phố Hồ Chí Minh trong 10 tuần gồm 812 phụ nữ ở độ tuổi 15 đến 39. Chẩn đoán bệnh lậu dựa trên nuôi cấy và xác nhận bằng một xét nghiệm kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho N.gonorrhoea. Sự hiện diện của C.trachomatis được xác định bằng kỹ thuật ELISA phát hiện kháng nguyên (IDEIA) trong bệnh phẩm nội mạc cổ tử cung. TPHA được thực hiện cho tất cả các mẫu máu để tìm bệnh giang mai. Tỷ lệ bệnh lây truyền qua đường tình dục phát hiện được ở giang mai 0.5%, lậu 0.7% và C.trachomatis 2.5%. Một nghiên cứu cắt ngang về nhiễm HIV và các yếu tố nguy cơ ở phụ nữ mại dâm tại phía nam Việt Nam đã được Nguyễn Thị Thanh Thủy, Võ Tuyết Nhung, Nguyễn Văn Thục, Trương Xuân Liên và Hạ Bá Khiêm thực hiện vào 1995-1996 [24]. Tổng cộng 968 phụ nữ mại dâm ở thành phố Hồ Chí Minh, Cần Thơ và An Giang được làm xét nghiệm. Các xét nghiệm bệnh lây truyền qua đường tình dục được thực hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoeae, ELISA (Sanofi, Organon) để phát hiện nhiễm HIV được xác nhận bằng Western Blot, TPHA cho giang mai, DIF cho C.trachomatis và ELISA HBsAg cho HBV. Tỷ lệ hiện mắc của các bệnh lây truyền qua đường tình dục được phát hiện là 40.4% cho giang mai, 3.3% cho lậu, 5.8% cho C.trachomatis, 5.2% cho HIV và 9% cho HBV. Trong thời gian từ tháng 2/1998 đến 3/1999, các tác giả đã khảo sát 415 phụ nữ từ 15-49 tuổi có gia đình đang sống tại huyện Hóc Môn thành phố Hồ Chí Minh [3]. Các đối tượng được chọn một cách ngẫu nhiên, nếu có đủ điều kiện nghiên cứu thì lập danh sách theo phương pháp ngẫu nhiên đơn, sau đó gửi thư mời đối tượng đến trạm y tế xã khám phụ khoa và lấy mẫu. Cách xử lý bệnh phẩm cũng như cách đọc kết quả được tuân theo quy trình hướng dẫn của bộ xét nghiệm do Bio Merieux cung cấp. Kết luận dương tính với C.trachomatis khi có hơn 10 thể phát huỳnh quang trên quang trường với vật kính 40; bệnh phẩm âm tính khi không có thể C.trachomatis phát huỳnh quang và ít nhất phải có hơn 50 tế bào thượng bì trên bề mặt của giếng. Kết quả 75 nguời có hiện diện của C.trachomatis trên bệnh phẩm phết cổ tử cung, như vậy tần suất lưu hành của viêm cổ tử cung do C.trachomatis là 18.07%. Tỷ lệ viêm cổ tử cung do C.trachomatis ở phụ nữ đi khám phụ khoa là 32.5% của Trần Thị Lợi tiến hành năm 1999 [8]. Năm 2001-2002, Huỳnh Thị Trọng, Nguyễn Quốc Chinh và Nguyễn Văn Tú đã thực hiện một nghiên cứu cắt ngang với phương pháp chọn mẫu xác suất với cỡ mẫu để xác định tỷ lệ hiện mắc các nhiễm khuẩn đường sinh sản dưới của 2234 phụ nữ đã kết hôn, ở lứa tuổi mang thai, sống tại thành phố Hồ Chí Minh [25]. Các xét nghiệm được thực hiện là: nuôi cấy để phân lập N.gonorrhoea, Smart Check Chlamydia cho C.trachomatis. Tỷ lệ hiện mắc lậu là 0.2%, C.trachomatis là 0.6%, Năm 2002-2003, Ủy Ban Dân Số, Gia Đình và Trẻ Em Việt Nam – Cục Phòng Chống AIDS Bộ Y Tế và Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu bệnh lây truyền qua đường tình dục ở phụ nữ mãi dâm tại 5 tỉnh biên giới Lai Châu, Quảng Trị, Đồng Tháp, An Giang và Kiên Giang [26]. Có tất cả 703 phụ nữ mãi dâm của 5 tỉnh tham gia vào nghiên cứu cắt ngang này. Xét nghiệm bệnh lậu và C.trachomatis qua mẫu nước tiểu bằng kỹ thuật Roch Amplicor. Tỷ lệ mắc lậu, C.trachomatis, lậu/C.trachomatis tại Lai Châu 2.0%, 1.0%, 27.3%; Quảng Trị 1.0%, 12.9%, 32.7%; Đồng Tháp 4.7%, 11.4%, 16.0%; An Giang 7.0%, 10.7%, 11.3% và Kiên Giang 4.0%, 13.4%, 24.4%. Năm 2003, Trung tâm phòng chống bệnh tật Hoa Kỳ (CDC) cùng Viện Da Liễu trung ương tiến hành một cuộc điều tra về tỷ lệ lưu hành STI/HIV của các nhóm quần thể dân cư khác nhau tại 5 tỉnh của Việt Nam [29]. Nhiễm C.trachomatis được phát hiện bằng phản ứng PCR và tỷ lệ mắc là 9% trong nhóm tân binh tại Hà Nội và 0.5-5% trong nhóm bệnh nhân đến phòng khám bệnh lây truyền qua đường tình dục. Trong nhóm phụ nữ có thai, tỷ lệ mắc C.trachomatis từ 1.5% đến 5.8%. Năm 2003, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh và Văn Phòng Phòng Chống AIDS cùng Trung Tâm Phòng Chống Bệnh Xã Hội Sóc Trăng nghiên cứu về bệnh lây truyền qua đường tình dục ở 395 phụ nữ mại dâm của tỉnh Sóc Trăng [29]. Các kỹ thuật được sử dụng để xét nghiệm lây truyền qua đường tình dục là PCR (Amplicor CT/NG, Roch, 2002) để tìm N.gonorrhoea và C.trachomatis trong nước tiểu. Tỷ lệ hiện mắc lậu, C.trachomatis, lậu/C.trachomatis là 14.9%, 48.4%, 54.9%. Tần suất nhiễm C.trachomatis ở phụ nữ đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và đã có một số số liệu ban đầu ghi nhận tỉ lệ nhiễm C.trachomatis ở một số đối tượng trong cộng đồng như phụ nữ đang mang thai, phụ nữ lứa tuổi sinh đẻ, cũng như ở những đối tượng nguy cơ cao như phụ nữ đến khám phụ khoa và phụ nữ vô sinh do tắc ống dẫn trứng. Tần suất nhiễm C.trachomatis thay đổi theo từng tác giả, từng nhóm đối tượng, tuy vậy đều thống nhất trong khoảng 20 – 40% ở đối tượng trong cộng đồng [1]. Điểm chung của các nghiên cứu trên là sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp để tìm kháng nguyên, xác định tình trạng hiện đang nhiễm C.trachomatis. Lần đầu tiên tại Việt Nam, xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis được sử dụng như một xét nghiệm sàng lọc. Đối tượng nghiên cứu là tất cả các trường hợp điều trị vô sinh có chỉ định thực hiện thủ thuật thụ tinh nhân tạo (TTNT) tại khoa Hiếm muộn, bệnh viện Từ Dũ trong thời gian từ 20/2/2004 đến 20/7/2004 [31]. Bệnh nhân được tư vấn về tình hình nhiễm C.trachomatis trong cộng đồng, khả năng nhiễm bệnh của bản thân và ảnh hưởng của nhiễm C.trachomatis lên hiệu quả điều trị. Bệnh nhân cũng được tư vấn về xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis và đồng ý tham gia nghiên cứu. Khi được nhận vào nghiên cứu, bệnh nhân đã được ghi nhận về bệnh sử, thăm khám lâm sàng, thực hiện những xét nghiệm cơ bản. Vào ngày thứ 2 hoặc 3 của kỳ kinh, bệnh nhân được lấy máu thử kháng thể kháng C.trachomatis loại IgG và được bắt đầu dùng toa thuốc kích thích phát triển nang noãn theo phác đồ chuẩn tại khoa. Quy trình thực hiện thủ thuật TTNT được tiến hành theo phác đồ chuẩn tại khoa Hiếm muộn, bệnh viện Từ Dũ. Xét nghiệm Platelia® Chlamydia IgG được thực hiện tại khoa xét nghiệm bệnh viện Từ Dũ, sử dụng máy và bộ xét nghiệm của hãng Bio-Rad bằng kỹ thuật ELISA. Trong thời gian từ 1/3 đến 20/7/2004 có 425 bệnh nhân điều trị vô sinh bằng thủ thuật TTNT được nhận vào nghiên cứu. Tuổi trung bình của bệnh nhân là 28.3 (từ 19 đến 35), thời gian vô sinh trung bình là 3.7 năm (từ 1 đến 6 năm). Có 99 bệnh nhân cho kết quả dương tính với xét nghiệm kháng thể kháng C.trachomatis (nhóm Ct IgG+), chiếm tỷ lệ 23.3%. Mặc dù không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về kết quả điều trị (tỷ lệ beta-hCG dương tính và tỷ lệ thai lâm sàng) giữa hai nhóm bệnh nhân, vẫn có thể ghi nhận tỷ lệ có thai trong nhóm xét nghiệm âm tính với C.trachomatis (nhóm Ct IgG-) cao hơn hẳn (gấp 8 lần) so với kết quả của nhóm xét nghiệm dương tính với C.trachomatis (nhóm Ct IgG+). Từ tháng 8 đến tháng 12 năm 2006, một nghiên cứu áp dụng kỹ thuật PCR xét nghiệm chẩn đoán C.trachomatis được thực hiện tại Viện da liễu quốc gia trên 555 bệnh nhân [7]. Bệnh nhân là đối tượng trên 15 tuổi đến khám có biểu hiện tiết dịch niệu đạo và tiết dịch âm đạo. Bệnh phẩm là dịch tiết niệu đạo (đối với bệnh nhân nam) và dịch tiết cổ tử cung (đối với bệnh nhân nữ). Tiến hành tách chiết DNA bằng Qiamp DNA Mini Kit của hãng Qiagen, chẩn đoán nhiễm C.trachomatis bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi KL1/KL2 (nhân đoạn 241 bp trên plasmid của C.trachomatis) và T1/T2 (nhân đoạn 200 bp trên plasmid của C.trachomatis). Bệnh nhân được khẳng định kết quả dương tính khi cả hai cặp mồi đều cho kết quả dương tính. Kết quả có 90 bệnh nhân dương tính với cả hai cặp mồi, chiếm tỷ lệ 16.2%. Trong đó tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở nữ giới là 21/205, chiếm 10.2%. So sánh PCR sử dụng cặp mồi T1/T2, phương pháp PCR sử dụng cặp mồi KL1/KL2 có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu là 99.8%. Độ nhạy và độ đặc hiệu này cao tương đương với các kết quả đã công bố. Tỷ lệ nhiễm C.trachomatis ở Việt Nam năm 2007 khoảng 5897 ca. Tại Viện Da liễu quốc gia, bằng phương pháp miễn dịch sắc ký phát hiện tỷ lệ nhiễm khoảng 10% số bệnh nhân STI, bằng kỹ thuật PCR phát hiện 16.2%. Trong đó các yếu tố nguy cơ bao gồm bệnh nhân nữ nhỏ hơn 25 tuổi; bệnh nhân nam có viêm đỏ quy đầu hoặc tiết dịch đục, bệnh nhân độc thân [10]. Lấy mẫu kiểu ngẫu nhiên các đối tượng hút thai ba tháng đầu thai kỳ trong giờ hành chính, tại khoa kế hoạch hóa gia đình Bệnh viện Từ Dũ từ 01/08/2007 đến 30/01/2008, thu thập bệnh phẩm tại kênh cổ tử cung làm xét nghiệm PCR (Amplicor® của hãng Roche) được thực hiện tại viện Pasteur, Phạm Văn Đức và cộng sự đã thu được kết quả: trong 1.003 trường hợp nghiên cứu tỷ lệ nhiễm C.trachomatis là 9.2%, phần lớn rơi vào các đối tượng trẻ dưới 30 tuổi, kinh tế trung bình [4]. Tại bệnh viện Phong-Da liễu Trung ương Quy Hoà, tác giả Nguyễn Phúc Như Hà và cộng sự [5,30] đã sử dụng phản ứng multiplex PCR phát hiện vi khuẩn C.trachomatis. Mẫu thử là DNA tách chiết từ các huyền dịch vi khuẩn C.trachomatis và mẫu bệnh phẩm lâm sàng như dịch niệu đạo, nước tiểu nam giới, dịch phết cổ tử cung. Sử dụng mồi đặc hiệu (đặt TaKaRa tổng hợp) cho đoạn DNA dài 241 bp trên cryptic plasmid của C.trachomatis trong thể tích phản ứng là 25 ml. Kết quả nghiên cứu cho thấy, Multiplex PCR có khả năng phát hiện rất cao, có thể nói là lý tưởng đạt mức phát hiện tối thiểu chỉ cần 1 DNA bộ gen của vi khuẩn đích có mặt trong mẫu thử là có thể phát hiện được. Kết quả xét nghiệm bệnh nhân thu được 12.1% trường hợp dương tính trên các tổng số các trường hợp được chẩn đoán viêm cổ tử cung. Trong một nghiên cứu khác, bệnh nhân tiết dịch âm đạo đến khám tại bệnh viện da liễu thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 6 năm 2007 đến tháng 6 năm 2008 được xét nghiệm quick test và PCR [6]. 245 bệnh nhân trên 18 tuổi, chia 3 nhóm bị tiết dịch niệu đạo (95), tiết dịch âm đạo (70), bệnh nhân nữ không triệu chứng nhưng có yếu tố nguy cơ (80). Kết quả xét nghiệm bằng PCR: tỷ lệ dương tính với C. Trachomatis ở nhóm bị tiết dịch niệu đạo là 26/95 (27.4%), bệnh nhân có triệu chứng tiết dịch âm đạo là 25/70 (35.7%), bệnh nhân không triệu chứng là 21/80 (26.3%). Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Mẫu DNA vi khuẩn Chlamydia trachomatis do Viện Công nghệ sinh học- Viện Khoa học Việt Nam cung cấp. - Các bệnh nhân nữ trong độ tuổi sinh sản (15-49 tuổi) có biểu hiện viêm âm đạo, cổ tử cung đến khám tại phòng khám Sản phụ khoa - Bệnh viện Đại học Y Thái Bình trong thời gian từ 01/04/2011 đến 10/2011. 2.1.2. Thời gian nghiên cứu: từ 01/04/2011. 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu + Lấy mẫu dịch phết cổ tử cung tại phòng khám Sản phụ khoa - Bệnh viện Đại học Y Thái Bình. + Chuẩn quy trình kỹ thuật, xử lý mẫu, tách chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp chọn mẫu và cỡ mẫu Phương pháp chọn mẫu Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: Bệnh nhân trong độ tuổi sinh sản, đã từng quan hệ tình dục. Được khám và chẩn đoán là viêm âm đạo, cổ tử cung. Đồng ý tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ: Bệnh nhân đang trong giai đoạn kinh nguyệt, bị rong kinh, rong huyết. Bệnh nhân đã từng điều trị kháng sinh trong vòng 1 tháng trước đó. Không đồng ý tham gia nghiên cứu. Những bệnh nhân được lựa chọn vào nghiên cứu sẽ được lấy mẫu dịch phết cổ tử cung để tiến hành làm xét nghiệm PCR phát hiện Chlamydia trachomatis tại Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình. Cỡ mẫu: Để xác định cỡ mẫu cho việc ước tính tỷ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở những phụ nữ viêm cổ tử cung chúng tôi sử dụng công thức: Trong đó: n là cỡ mẫu, m là độ sai số, p là tỉ lệ nhiễm Chlamydia trachomatis ở phụ nữ viêm cổ tử cung. Với p = 17% (theo nghiên cứu của Farhad B. Hashemi và cộng sự [16]) và lựa chọn giá trị độ sai số m = 0,05 thì cỡ mẫu n tối thiểu là 217 bệnh nhân. 2.2.2. Kỹ thuật xét nghiệm 2.2.2.1. Phương pháp lấy mẫu Những bệnh nhân được lựa chọn tham gia nghiên cứu đều được thăm khám bởi các bác sĩ Sản phụ khoa để xác định tình trạng viêm âm đạo, cổ tử cung trước khi lấy mẫu. Dùng tăm bông lau sạch dịch tiết cổ tử cung. Dùng tăm bông tiếp theo đưa sâu vào ống cổ tử cung 2 cm, xoay tăm bông và miết tăm bông vào thành ống cổ tử cung từ 15 đến 30 giây. Khi kéo tăm bông ra không chạm vào vách âm đạo. Mẫu phết cổ tử cung được giữ trong tuýp Falcol 15 ml có chứa 2 ml dung dịch 2SP (2-sucrose-phosphate transport medium), bảo quản ở 4oC và đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2- 3 giờ và thực hiện phản ứng PCR trong vòng 24 giờ. Tại phòng thí nghiệm, bệnh phẩm được chia nhỏ vào hai tuýp eppendorf 1.5 ml (1ml/tuýp), một tuýp được sử dụng để tách chiết DNA, tuýp còn lại được bảo quản ở -70oC. 2.2.2.2. Xử lý mẫu - Lấy 500 µl bệnh phẩm cho vào tuýp eppendorf 1.5 ml, bổ sung 500 µl dung dịch TTE, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy. - Bổ sung 500 µl dung dịch PBS, vortex, ly tâm 13.000 rmp/3 phút, loại dịch nổi, giữ lại khoảng 200 µl dịch đáy. 2.2.2.3. Tách chiết ADN Tuýp trên được sử dụng để tách chiết theo phương pháp Boom [14]. Bước 1: Phá tế bào giải phóng DNA - Bổ sung 1000 µl dung dịch L6, vortex, bổ sung 30 µl SiO2, vortex đều, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn.          Bước 2: Tinh sạch DNA - Bổ sung 1000 µl dung dịch L2, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. - Làm lại bước trên. - Bổ sung 1000 µl dung dịch ethanol 70% lạnh, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. - Làm lại bước trên. - Bổ sung 1000 µl dung dịch acetone 100%, vortex tan cặn, ly tâm 13.000 rmp/30s, loại dịch nổi, thu cặn. - Làm khô cặn bằng cách sấy ở 60oC trong 10 phút, mở nắp eppendorf.            Bước 3: Thu hồi DNA - Bổ sung 50 µl TE, ủ ở 60oC trong 10 phút, đóng nắp eppendorf. Ly tâm 13.000rmp/30s. Hút dịch nổi sang một eppendorf mới, ghi tên dán nhãn. - Làm lại bước trên. Dịch nổi chứa DNA thu được bảo quản ở -20oC sử dụng chạy PCR. 2.2.2.4. Tối ưu hóa phản ứng PCR Tại các phòng thí nghiệm khác nhau, phản ứng PCR được thực hiện trên các máy luân nhiệt của các hãng khác nhau, đội ngũ cán bộ có trình độ khác nhau và sử dụng hoá chất của nhiều hãng. Vì vậy việc tối ưu hoá phản ứng trong từng phòng thí nghiệm là điều cần thiết để có một kết quả PCR chính xác, giảm thiểu sai sót và tránh lãng phí hoá chất không cần thiết. Tại Lab sinh học phân tử - Trung tâm KHKT Y Dược - Đại học Y Thái Bình, phản ứng PCR được thực hiện trên máy luân nhiệt PCR Mastercycler C1000 của Biorad. Thành phần phản ứng gồm: Master Mix (MgCl2, Taq polymerase, buffer), primer(reverse và foward), DNA khuôn. Chúng tôi sử dụng hai cặp mồi (theo khuyến cáo của CDC) để cho kết quả có độ chính xác cao. Primer cho phản ứng PCR đầu tiên chúng tôi dùng cặp mồi KL5 và KL6 khuếch đại đoạn có kích thước 288 bp trên cryptic plasmid của vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Primer này có công thức như sau: Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thước KL5 TTTGCCTTAACCCCACCATT 288bp KL6 CGTCCTTCCTAAAAGAGCTA Primer cho phản ứng PCR thứ 2 chúng tôi dùng cặp mồi KL1 và KL2 khuếch đại đoạn có kích thước 241 bp trên cryptic plasmid của vi khuẩn Chlamydia trachomatis, nằm trong đoạn 288 bp trên, với công thức như sau: Tên mồi Trình tự 5’-3’ Kích thước KL1 TCCGGAGCGAGTTACTAAGA 241bp KL2 AATCAATGCCCGGGATTGGT Để tối ưu hóa phản ứng chúng tôi tiến hành thử nghiệm PCR trong các nồng độ mồi khác nhau, nhiệt độ và thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2, số chu kỳ thích hợp trong mỗi phản ứng. Trong mỗi phản ứng chúng tôi sử dụng enzyme UNG để khử các amplicon ngoại nhiễm. Nồng độ MgCl2 Trong các thành phần buffer của phản ứng PCR, có lẽ ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nhất là nồng độ MgCl2. Việc tăng nồng độ MgCl2 quá cao làm xuất hiện các sản phẩm không đặc hiệu nhưng nếu thiếu lại dẫn tới tình trạng lượng sản phẩm PCR thấp. Hơn nữa hóa chất do các hãng khác nhau cung cấp sẽ cho nồng độ MgCl2 thích hợp khác nhau, ở đây chúng tôi dùng MgCl2 nồng độ gốc 25 mM của Fermentas. Với cặp mồi KL1/KL2, phản ứng PCR được thực hiện ở các nồng độ MgCl2 khác nhau để lựa chọn ra nồng độ thích hợp nhất nhằm làm tăng hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi loại mồi KL1 (5-TCCGGAGCGAG-TTACTAAGA-3) và KL2 (5-ATCAATGCCCGGGATTGGT- 3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 0.7 mM; 0.9 mM; 1.1 mM; 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Tiếp đó chúng tôi tiến hành tối ưu hóa nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 16 pmol mỗi loại mồi KL5 (5-TTGCCTTAACCCCACCATT-3) và KL6 (5-CGT-CCTTCCTAAAAGAGCTA-3), 0.05 U UNG và nồng độ MgCl2 thay đổi từ 1.3 mM; 1.5 mM; 1.7 mM; 1.9 mM; 2.0 mM; 2.1 mM; 2.3 mM; 2.5 mM. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Nồng độ mồi Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Trong phản ứng PCR, đoạn mồi có hai vai trò chính : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu của phản ứng, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sản phẩm PCR càng đặc hiệu và phản ứng PCR càng đặc hiệu. (2) Khởi động enzyme polymerase vì enzyme polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là đầu mà nó xúc tác cho một dNTP được gắn vào) đang ở tình trạng sợi đôi. Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng được chuẩn bị trong các nồng độ mồi khác nhau từ 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 và 1 pmol/µl. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C.Với cặp mồi KL1/KL2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nồng độ mồi khác nhau: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 pmol/µl, trong mỗi phản ứng có chứa 1 µl sản phẩm PCR lần 1. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút là 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Nhiệt độ gắn mồi Đối với primer dài hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thường hoạt động ở Tm thấp nhất + 3°C. Đối với primer nhỏ hơn 22 nucleotide, nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn Tm thấp nhất, có thể dùng grandient nhiệt độ (touchdown PCR) để tìm nhiệt độ bắt mồi tối ưu (khoảng cách nhiệt ở mỗi chu kỳ thường là 0.5- 1°C). Đối với các primer có Tm cao hoặc tự bắt cặp, có cấu trúc vòng thì có thể khắc phục bằng PCR 2 bước (95°C và 68°C). Với cặp mồi KL1/LK2, chúng tôi thực hiện phản ứng PCR ở các nhiệt độ khác nhau từ 50 đến 63ºC. Trong thể tích phản ứng 25 µl có 0.05 U UNG, các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 50-63ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 50-63ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Với cặp mồi KL5/LK6, phản ứng PCR cũng được thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 54 đến 610C. Trong thể tích phản ứng 25 µl, các loại mồi xuôi và mồi ngược, 0.05 U UNG, các phản ứng PCR được tiến hành với gradient nhiệt độ nằm trong khoảng 54-61ºC. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 54-610C, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Thời gian gắn mồi: Tùy theo kích thước và tỷ lệ GC có trong mồi, thời gian gắn mồi thích hợp có thể khác nhau. Với hai cặp mồi KL1/KL2 và KL5/KL6 chúng tôi tiến hành phản ứng PCR ở các thời gian gắn mồi khác nhau là: 20s, 30s, 40s, 50s và 60s. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; 0.05 U UNG, các mồi xuôi và mồi ngược với thời gian gắn mồi thay đổi từ 20s, 30s, 40s, 50s và 60s. Chu trình nhiệt: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 20s, 30s, 40s, 50s hoặc 60s ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Số chu kỳ Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, trong đó số chu kỳ của từng phản ứng được thay đổi. Phản ứng được chuẩn bị trong thể tích cuối cùng 25 µl có chứa Master mix 2X; các loại mồi. Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 20, 25, 30 chu kỳ, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Số chu kỳ của từng phản ứng thể hiện trong bảng dưới đây: KL5/KL6 KL1/KL2 20 25 30 20 25 30 2.2.2.5. Xác định độ nhạy của phản ứng PCR Sử dụng mẫu DNA vi khuẩn C.trachomatis được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi KL5/KL6, đoạn DNA được khuếch đại có kích thước 288 bp thuộc trình tự plasmid của vi khuẩn C.trachomatis. Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được chèn vào vector pJet1.2/blunt (CloneJETTM PCR Cloning kit - Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp. Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis được biến nạp vào vi khuẩn E.coli chủng Top 10F’nuôi qua đêm. Sau đó plasmid tái tổ hợp được tinh sạch bằng từ vi khuẩn E.coli bằng bộ kít GeneJETTM plasmid miniprep kit – Fermentas. Xác định nồng độ plasmid tái tổ hợp sau khi tinh sạch bằng cách đo khả năng hấp thụ bước sóng 260nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Dựa vào nồng độ plasmid tái tổ hợp có thể tính được số bản sao plasmid trên một đơn vị thể tích theo công thức [35]: N= (6.022*1023)*C/(650*109*3262) Trong đó: 6.022*1023 là số bản copi plasmid trong 1 mole (định luật Avogadro) C là nồng độ plasmid (ng) 650 là khối lượng 1 mole của một cặp base (gr) = 650*109ng 3262 là chiều dài của plasmid (bao gồm plasmid có kích thước 2974 bp và đoạn chèn kích thước 288 bp). Sau đó, mẫu plasmid tái tổ hợp có mang đoạn DNA của vi khuẩn C.trachomatis được pha loãng thành các dung dịch có các nồng độ từ 1010, 109, 108, 107,... đến 101 bản sao plasmid/µl và sử dụng làm mẫu chuẩn để đánh giá độ nhạy của phản ứng. Phản ứng PCR được chuẩn bị trong một khối lượng cuối cùng của 25 µl có chứa Master mix 2X và các loại mồi, 0.05 U UNG, thực hiện với mẫu chứng dương plasmid có nồng độ khác nhau: 101, 102, 103, 104 bản sao/µl và sử dụng 10 µl để điện di trên gel agarose 1%. Chu trình nhiệt của cặp mồi KL5/KL6: 37°C trong 15 phút, biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, 35 chu kỳ bao gồm 1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55°C, 1 phút ở 72°C, một bước kéo dài trong 20 phút ở 72°C và giữ ở 4°C. Chu trình nhiệt với cặp mồi KL1/KL2: biến tính ban đầu 95°C trong 10 phút, (1 phút ở 94ºC, 1 phút ở 55ºC, và 1 phút ở 72°C) trong 35 chu kỳ một