Luận văn Nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh để phòng trừ bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai (Acacia auri culiformis x Acacia mangium ) do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại tại Lâm trường Tam Thắng, huyện Thanh Sơn, Phú Thọ

cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh Cấp 2: > 10 - 20% diện tích lá bị bệnh Cấp 3: > 20 - 30% diện tích lá bị bệnh Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh. - Tính mức độ bị bệnh chung cho mỗi chủng khuẩn. R = 1 . . i ni vi N V x100% [3.02] Trong đó: R: Là mức độ bị bệnh (Severity of attack) ni: Là số cây bị bệnh theo cấp bệnh i. vi: Là chỉ số của cấp bệnh i. n: Là tổng số cây điều tra trong ô tiêu chuẩn. V = 4. - Mức độ bị bệnh của toàn khu vực điều tra được tính theo công thức: Rtb = Ri n [3.03] Trong đó: Rtb là mức độ bị hại của toàn khu vực điều tra. Ri là mức độ bị hại của từng ô tiêu chuẩn. n là tổng số ô tiêu chuẩn. - Chỉ số tổn thất được xác định thông qua công thức sau: DI (%) = R% x P% [3.04] Trong đó: R (%) mức độ bị bệnh P (%) tỷ lệ bị bệnh Căn cứ vào trị số DI xác định được biện pháp phòng trừ: DI < 0,1 không cần phun thuốc phòng trừ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 0,1 ≤ DI < 0,25 cần loại bỏ lá, thân cành bệnh và phun thuốc phòng trừ 0,25 ≤ DI < 0,5 cần cắt bỏ lá và thân cành bệnh, loại bỏ cây bệnh nặng và phun thuốc phòng trừ DI ≥ 0,5 chặt bỏ cây bệnh 3.4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp bệnh Trên các khu rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, Thanh Sơn, Phú Thọ tiến hành phân cấp mức độ bị hại theo 5 cấp được đánh số từ 0 đến 4. Ở mỗi cấp bệnh khác nhau cần phải chọn ra 3 cây đặc trưng và tiêu biểu, mỗi cây lấy một mẫu (một cành) có đường kính 1 - 1,5 cm. Các cành được chọn có vị trí cành ít được chiếu sáng và đánh ký hiệu riêng cho từng cành. Phƣơng pháp phân lập Bƣớc 1: Chuẩn bị dụng cụ Rửa hộp lồng cho sạch sau đó để khô bọc kín bằng giấy báo và cho vào nồi hấp khử trùng ở 121 0 C tương đương với áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút. Sau đó cho vào tủ sấy đặt ở nhiệt độ 110 0 C để qua đêm. Bƣớc 2: Chuẩn bị môi trƣờng Để phân lập vi khuẩn nội sinh cần chuẩn bị một số loại môi trường sau: Môi trƣờng PBS: NaCl : 8,5 gam KH2PO4 : 6,8 gam NaOH : 1,16 gam Nước cất : 1000 ml Điều chỉnh pH : 7 Sau khi pha được môi trường cho vào các ống nghiệm, các ống nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 cần phải nút bông chặt và miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy, mỗi ống nghiệm là 9ml: hấp khử trùng ở 121 0 C trong thời gian 30 phút . Môi trƣờng PDA: Khoai tây : 200 gam D-Glucose : 20 gam Agar : 15-18 gam Nước cất :1000ml Khoai tây rửa sạch cắt thành miếng có kích thước 1x1x1cm cho vào nồi và đổ nước 1000 ml đun sôi, để 30 phút tính từ lúc sôi, lọc lấy nước trong, sau đó cho thêm nước cho đủ 1000 ml. Cho D-glucose và agar vào các bình tam giác 500 ml nút bông, quấn giấy đầu cổ bình (3 bình, mỗi bình 330 ml). Hấp khử trùng ở môi trường 121 0 C trong 30 phút rồi đổ ra hộp lồng để trong tủ cấy. Môi trƣờng nƣớc cất Rửa sạch các ống nghệm cho 9 ml nước vào các ống nghiệm nút bông vào miệng ống nghiệm được quấn bằng giấy. Cho vào nồi hấp khử trùng ở môi trường 121 0 C (tương đương với 1atm) trong 30 phút. Bƣớc 3: Cắt mẫu Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7- 8 cm, khử trùng bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành các lát mỏng có kích thước 0,5 - 1,0 (mm) ở 3 vị trí : phần vỏ (Bark) ký hiệu là B; phần tượng tầng (Phloem) ký hiệu là P; phần gỗ (Xylem) ký hiệu là X. Sau khi cắt xong cân mỗi phần 1 gam rồi cho vào ống nghiệm có chứa môi trường PBS nút bông và b ịt miệng ống nghiệm bằng giấy để qua đêm. Nếu phần tượng tầng của mẫu bệnh quá ít ta có thể lấy 0,5 gam của phần tượng tầng cho vào ống nghiệm chứa 4,5 ml môi trường PBS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Bƣớc 4: Phân lập vi khuẩn nội sinh Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn. Dùng pipet lấy 0,1ml cho vào hộp lồng có chứa môi trường PDA, dùng que trang đều trên mặt thạch và ghi rõ ngày cấy và ký hiệu mẫu bệnh. Để các hộp lồng đã cấy vi khuẩn trong tủ định ôn với nhiệt độ 28 0 C, theo dõi sự xuất hiện của các khuẩn lạc đếm số lượng vi khuẩn có trong hộp lồng, có bao nhiêu chủng khác nhau, mô tả đặc điểm của mỗi chủng. Nếu mật độ vi khuẩn quá nhiều trên mỗi hộp lồng cần pha loãng đến 10 5 , 10 6 . Dùng que cấy tách ra từng chủng vi khuẩn khác nhau rồi cho ra một hộp lồng khác có chứa môi trường PDA (mỗi hộp một loại vi khuẩn), mỗi chủng cấy 2 hộp lồng, sau đó dùng băng keo quấn chặt. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn và đánh giá khả năng sinh trưởng của vi khuẩn, mô tả đặc điểm của vi khuẩn khi nó được tách ra. Dựa vào hình thái, màu sắc, kích thước để nhận biết các loại vi khuẩn khác nhau và được thống kê các chủng phân lập được từ các mẫu thí nghiệm. 3.4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 3.4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh - Xác định các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm gây bệnh Sau phân lập được vi khuẩn thuần khiết chúng ta cấy nấm gây bệnh ở 3 góc của hộp lồng và cuốn kín hộp lồng rồi ghi rõ ngày tháng trên nắp hộp lồng giữ mẫu ở tủ định ôn. Sau 5 - 7 ngày thì tiến hành đánh giá hiệu lực của vi khuẩn đối với nấm gây bệnh trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế. Công thức đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh được tính bằng công thức: V (mm) = D (mm) - d (mm) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Trong đó: V (mm): đường kính trung bình vòng ức chế. D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của hộp lồng đến mép trong của khuẩn lạc nấm bệnh. d (mm): đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn tính theo hai chiều vuông góc. Căn cứ vào trị số V, xác định được chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm gây bệnh loét thân cành keo lai. Trị số V càng lớn, chủng vi khuẩn càng có hiệu lực mạnh. Những chủng khuẩn có hiệu lực đường kính trung bình vòng ức chế (V ≥ 20 mm). - Mật độ tế bào của các chủng vi khuẩn có hiệu lực cao Lấy 1ml dung d ịch khuẩn của các chủng có hiệu lực kháng nấm cao pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn. Lấy 0,1 ml d ịch khuẩn đã pha loãng trang trên các hộp lồng chứa môi trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28 0 C trong 48 giờ. Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ml. Từ đó làm cơ sở cho việc xác định mật độ tối ưu để phòng trừ bệnh. 3.4.3.2. Mô tả đặc điểm của các chủng vi khuẩn nội sinh có hiệu lực Mô tả hình dạng, màu sắc, kích thước, các chủng khuẩn (bào tử và các thể quả). Khả năng sinh trưởng, phát triển của từng loại khuẩn trên môi trường PDA, khả năng kháng nấm của các chủng khuẩn có hiệu lực. 3.4.4. Đánh giá mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với cây chủ ở các cấp bị bệnh khác nhau để tìm hiểu về cơ chế Thu thập mẫu bệnh theo các cấp độ bị bệnh khác nhau. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh. So sánh và đánh giá hiệu lực các chủng khuẩn, mật độ khuẩn đối với các cây ở các cấp độ bệnh khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 3.3.5. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai 3.4.5.1. Nhân sinh khối sản xuất chế phẩm Chuẩn bị môi trường PD để nhân sinh khối vi khuẩn sản xuất chế phẩm theo Nguyễn Lân Dũng (2002) [7]. Thành phần gồm: Khoai tây: 200 gam D- Glucose: 20 gam Nước : 1000 ml Khoai tây rửa sạch để cả vỏ, cắt thành khối có kích thước 1x1x1cm, cho vào đun cùng 1000 ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, cho thêm nước để đủ 1000 ml. Sau đó cho D-glucose vào khuấy cho tan đều, cho vào mỗi bình tam giác nút bông và quấn giấy ở miệng bình. Hấp khử trùng ở 121 o C trong thời gian 20 phút. Sau khi hấp khử trùng để các bình môi trường vào trong tủ cấy, khử trùng các dụng cụ cần thiết và tiến hành trước ngọn lửa đèn cồn. Lấy từng loại chủng có hiệu lực, dùng que cấy khuẩn khử trùng lấy từng loại khuẩn cho vào mỗi bình môi trường. Với mỗi loại lấy 3 - 5 lần để đảm bảo lượng khuẩn đưa vào môi trường không quá ít. Nút bông lại và ghi rõ ký hiệu của từng loại. Cho các bình vào máy lắc, lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở 28 o C trong 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Sau khi lấy các bình đã lắc, lấy ở mỗi loại ra một ít làm mẫu đếm số bào tử hữu hiệu bằng cách: lấy 1ml dịch khuẩn pha loãng với 9 ml nước cất đã hấp khử trùng theo phương pháp pha loãng tới hạn. Lấy 1ml d ịch khuẩn đã pha loãng trên các hộp lồng chứa môi trường PDA. Đặt các hộp lồng đã cấy trong tủ định ôn ở 28 0 C trong 48 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Đếm số lượng khuẩn lạc thu được trên các hộp lồng tính theo CFU/ ml. Từ đó biết được loại khuẩn nào sinh trưởng nhanh trên môi trường nuôi cấy thuần khiết. 3.4.5.2. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh trong phòng thí nghiệm Phương pháp thí nghiệm: Lấy cành, lá non không bị bệnh lần lượt nhúng vào các cốc đựng dung dịch khuẩn trong vòng 30 phút, công thức đối chứng không nhúng mỗi một công thức có 3 hộp lồng. Lấy bào tử từ cơ quan sinh sản của nấm đã nuôi cấy trên môi trường PDA bằng que cấy inox được khử trùng trên ngọn đèn cồn, cho bào tử nấm vào cốc nước vô trùng tới khi mật độ đạt khoảng 1.10 6 tế bào/ml. Rồi tiến hành nhúng các mẫu lá keo nhiễm khuẩn vào cốc nước bào tử đó, sau đó để lá vào trong hộp lồng petri giữ ẩm, mỗi hộp để 3 lá và băng keo lại xung quanh hộp. Theo dõi và đánh giá mức độ bị bệnh ở mỗi công thức. Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại trong phòng thí nghiệm Ghi chú: Cấp 0: Không bị bệnh Cấp 1: < 10% diện tích lá bị bệnh Cấp 2: >10 - 20% diện tích lá bị bệnh Cấp 3: >20 - 30% diện tích lá bị bệnh Cấp 4: > 30% diện tích lá bị bệnh. - Tính mức độ bị bệnh trung bình cho mỗi chủng khuẩn theo công thức Rtb = n Ri [3.05] Ri là tổng các cấp hại của một chủng khuẩn n là số mẫu thí nghiệm 3.4.5.3. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ngoài vƣờn ƣơm Thử nghiệm với 3 chủng khuẩn có hiệu lực cao trong phòng thí nghiệm, mỗi chủng khuẩn được tiến hành với 4 công thức ở các nồng độ khác nhau và 1 công thức đối chứng, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp. Công thức 1: tiêm 05 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Công thức 2: tiêm 10 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 3: tiêm 15 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 4: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn mỗi loại, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 5: tiêm 10 ml nước cất vô trùng Sau 2 tuần phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 10 5 tế bào/1 ml. Theo dõi sau một thời gian đánh giá mức độ bị bệnh theo công thức [3.02] và sinh trưởng của cây keo lai như chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính cổ rễ (Dg) ... 3.4.5.4. Thử nghiệm hiệu lực phòng chống bệnh ở rừng non keo lai 1 tuổi Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam với 5 công thức, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp thời gian theo dõi trong vòng 60 ngày. Công thức 1: tiêm 20 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 2: tiêm 30 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 3: tiêm 40 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 4: tiêm 50 ml dịch vi khuẩn, mật độ 10 5 tế bào/1ml Công thức 5: tiêm 20 ml nước cất vô trùng Sau 4 tuần nhiễm vi khuẩn nội sinh, phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức bằng dung dịch nấm gây bệnh có mật độ 10 5 tế bào/1ml. Sau 4 tuần đánh giá mức độ bị bệnh ở các công thức thí nghiệm. Ảnh hưởng của khuẩn nội sinh đến sinh trưởng (chiều cao, khối lượng tươi, khối lượng khô) của cây keo lai ở các công thức thí nghiệm. 3.4.5.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở vƣờn ƣơm Tiến hành đo Hvn, Dg ở tất cả các cây có trong công thức sau đó tính toán và xử lý số liệu trên Excel để lấy các giá trị trung bình của lần lượt từng công thức và so sánh với công thức đối chứng. Tìm ra những chủng khuẩn có tác dụng cho sự sinh trưởng của cây keo lai trong giai đoạn vườn ươm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 3.4.6.5. Ảnh hƣởng của vi khuẩn nội sinh đến sinh trƣởng của cây keo lai ở giai đoạn rừng non (1 tuổi) Thí nghiệm được tiến hành tại vườn rừng của Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam (Đông Ngạc, Từ Liêm, Hà Nội) với số lượng 30 cây cho mỗi công thức. - Tiến hành đo Hvn bằng thước chuyên dùng, đường kính D1.3 cây có trong công thức sau đó tính toán và xử lý số liệu trên Exel 7.0. - Thu 30 cây keo lai một năm tuổi gồm (rễ, thân, cành, lá) ở lần lượt từng công thức đem cân các bộ phận ngay tại chỗ được sinh khối tươi. Sấy khô bằng tủ sấy ở nhiệt độ 75 0 C trong khoảng thời gian từ 6 - 8 giờ. Trong quá trình sấy, kiểm tra trọng lượng của mẫu sau 2, 4, 6 và 8 giờ sấy. Nếu sau 3 lần kiểm tra thấy trọng lượng không đổi thì đó chính là trọng lượng khô của mẫu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chương 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. Xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai và đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu 4.1.1. Kết quả thu thập mẫu bệnh và triệu chứng bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai mới đầu trên lá keo thấy xuất hiện những vết đốm nhỏ màu nâu hoặc đen trên lá sau đó chúng lan dần ra gây khô cành ngọn những cây bị nặng dẫn đến chết. Trên mặt vỏ xuất hiện các đoạn đen nứt dọc. Chỗ vết bệnh thường xuất hiện các sợi nấm dọc tạo ra các vân đen. Cành bị bệnh thường có màu sắc không tươi như màu của cây khoẻ (Hình 4.01). Hình 4.01: Thân cành keo lai bị bệnh Khi bệnh nặng, vỏ khô dần, co thắt, nhăn nheo, mô vỏ bị bệnh thối mềm làm lá và cả ngọn cây bị héo (Hình 4.02). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Hình 4.02: Rừng trồng keo lai bị bệnh đốm lá, khô cành ngọn 4.1.2. Kết quả phân lập nấm bệnh Để ẩm cành bị bệnh từ 3 - 5 ngày và trên kính hiển vi quang học ta thấy thể quả nấm xuất hiện khối bào tử vô tính hình tròn màu da cam. Hình 4.03: Thể quả nấm gây bệnh Dùng kim nhọn bằng sắt đã qua khử trùng hớt nhẹ phần sợi bào tử trên cành làm ẩm, cho đầu kim sắt đã dính nấm bệnh đó vào hộp lồng có chứa môi trường PDA và dùng băng keo quấn hộp lồng lại, để hộp lồng vào tủ bảo quản ở nhiệt độ 28 0 C và theo dõi sự phát triển của nấm bệnh. Khi sợi nấm bắt đầu mọc, cấy truyền sang môi trường dinh dưỡng mới. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Hình 4.04: Sự sinh trưởng của sợi nấm trên môi trường PDA 4.1.3. Kết quả thí nghiệm gây bệnh nhân tạo Để xác định chủng nấm phân lập được từ tổ chức bị bệnh có đúng là nấm gây bệnh hay không tiến hành thí nghiệm gây bệnh nhân tạo bằng cách nhúng lá non keo lai vào nấm bệnh Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Theo dõi trong vòng 7 ngày sau đó đánh giá mức độ bị bệnh ở các cấp nặng, nhẹ khác nhau, phân cấp mức độ bị hại theo diện tích của lá bị bệnh. Kết quả thí nghiệm gây bệnh nhân tạo được ghi ở Bảng 4.01. Bảng 4.01: Kết quả gây bệnh nhân tạo lá keo lai Thời gian quan sát Cấp bệnh (R%) Đối chứng Sau 1 ngày 7,50 0 Sau 2 ngày 25,00 0 Sau 3 ngày 45,00 0 Sau 4 ngày 50,00 0 Sau 5 ngày 62,50 0 Sau 6 ngày 81,25 0 Sau 7 ngày 93,75 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Từ Bảng 4.01 cho thấy chủng nấm phân lập được gây bệnh cho lá, cành non keo lai. Sau 7 ngày toàn bộ các lá keo ở công thức gây bệnh có mức độ bị bệnh là 93,75% trong khi đó đối chứng không bị bệnh (Hình 4.05). Hình 4.05: Thí nghiệm gây bệnh nhân tạo 4.1.4. Giám định nguyên nhân gây bệnh Căn cứ vào nhữmg triệu chứng bệnh đã mô tả, đặc điểm hình thái bào tử quan sát trên kính hiển vi tham khảo đối chiếu với các tài liệu phân loại nấm của các tác giả Zhao Liping (1983), F.G. Brown (1968) và Sutton B. 1980, Nấm gây bệnh cho keo lai được xác định là loài nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai có hai giai đoạn sinh sản trong vòng đời, giai đoạn hữu tính và giai đoạn vô tính. Giai đoạn vô tính (Anamorph): Bào tử phân sinh hình bầu dục hay hình hạt gạo thuôn dài đơn bào không mầu, sau khi thành thục có mầu nâu. Bào tử không có vách ngăn nhưng đặc biệt là ở trước giai đoạn nẩy mầm bào tử thường có một vách ngăn ngang hình thành hai tế bào có mầu nâu, bào tử có chiều dài từ 11,87 m - 16,38 m, chiều rộng 3,26 - 4,78 m. Vỏ bào tử dạng đĩa có mầu nâu nhạt, nằm rải rác dưới vỏ cây, sau đó màng lộ ra ngoài mầu nâu đen khi chín nứt ra và bào tử bay ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi nẩy mầm thực hiện quá trình xâm nhiễm mới trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 mùa sinh trưởng, đĩa bào tử có kích thước chiều dài 121,5 - 182,7 m, và chiều rộng 2 - 53,6 m. Bên trong của đĩa bào tử có cuống bào tử mọc ra trên đó, cuống bào tử không mầu đơn bào, có kích thước chiều dài 101,8 và chiều rộng 4,1 - 6,3 m. Bào tử Bào tử nẩy mầm Hinh 4.06: Bào tử vô tính của nấm gây bệnh + Giai đoạn vô tính (Anamorph) Tên loài : Nấm đĩa gai Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Thuộc chi nấm bào tử đĩa gai: Colletotrichum Họ nấm đĩa : Melanconiaceae Bộ nấm đĩa: Melanconiales. Ngành phụ nấm bất toàn: Deuteromycetes Ngành nấm thật: Eumycota + Giai đoạn hữu tính (Teleomorph) Giai đoạn hữu tính (Teleomorph), quan sát trên kính hiển vi cho thấy bào tử túi đơn bào hình bầu dục. Vỏ bào tử dạng túi, vỏ túi hình cầu mọc đơn hoặc cụm dưới vỏ cây. Bên trong vỏ túi có nhiều túi bào tử và sợi bên, túi bào tử không mầu dạng que có đỉnh tròn. Đối chiếu với chuyên khảo nấm túi của Richard T. Hanlin 1990, nấm túi được xác định là: Tên loài : Glomerella cingulata (Stonem.) Spauld.& Schrenk. Chi: Glomerella Spald. & H. Schrenk. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Họ: Phyllachoraceae Bộ: Phyllachorales Lớp: Sordariomycetes Ngành phụ: Pezizomycotina Ngành nấm túi: Ascomycota 4.1.5. Sự sinh trƣởng của hệ sợi nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. trên môi trƣờng dinh dƣỡng PDA Tốc độ sinh trưởng của hệ sợi nấm bệnh theo thời gian khi nuôi trên môi truờng dinh dưỡng PDA được trình bày ở Bảng 4.02. Bảng 4.02: Sinh trưởng của hệ sợi nấm trên môi trường PDA. Chi tiêu Thời gian Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ Đường kính khuẩn lạc (mm) 8,35 18,30 23,19 Từ Bảng 4.02 cho thấy loài nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. mọc khá nhanh trên môi trường dinh dưỡng PDA. Sau 24 giờ đầu nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. sinh trưởng bình thường với tốc độ sinh trưởng bình quân đạt 347,9 µm/giờ đến 48 giờ tiếp theo nấm sinh trưởng rất nhanh (381,25 µm/giờ) tốc độ sinh trưởng bắt đầu giảm từ giờ 49 trở đi tốc độ sinh trưởng bình quân của sợi nấm 322 µm/giờ. 4.1.6. Đánh giá ảnh hƣởng của bệnh đối với keo lai tại khu vực nghiên cứu Bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo lai đã dẫn đến vỏ của thân cây bị thối, mất dần khả năng dẫn truyền dinh dưỡng nuôi cây, làm tán cây bị héo dần và chết từ ngọn xuống (Die Back). Bệnh gây hại trên nhiều loài keo ở các nước ôn đới và nhiệt đới. Bệnh hại, gây cho cây bị đốm lá, khô cành ngọn làm giảm khả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 năng sinh trưởng phát triển của cây. Ở nước ta bệnh phân bố chủ yếu ở các tỉnh Tuyên Quang, Phú Thọ, Hoà Bình, Hà Giang, Vĩnh Phúc, Hà Tây (cũ), Sơn La, Lâm Đồng, Kon Tum, Thừa Thiên Huế,…Bệnh hại đã gây tổn thất rất lớn về giá trị kinh tế và môi trường sinh thái. Dịch bệnh có khả năng bùng phát gây chết hàng loạt rừng trồng trên diện rộng, làm cho ngọn và lá cây bị biến mầu sau đó khô héo, lá rụng, cành khô chết từ trên ngọn xuống, tạo điều kiện cho mối mọt tấn công phá hại, làm giảm sinh trưởng của cây, gây cho cây có nhiều khuyết tật, sản lượng thấp, phẩm chất kém, giá trị thành phẩm giảm. Tại Lâm trường Tam Thắng huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ, đã điều tra đánh giá thực trạng tình hình bệnh tại 4 khu vực nghiên cứu. Kết quả về tỷ lệ bị bệnh, mức độ bị bệnh và chỉ số tổn thất được trình bày ở Bảng 4.03. Bảng 4.03: Ảnh hưởng của bệnh đối với keo lai ở Lâm trường Tam Thắng huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ Chỉ tiêu Địa điểm Mức độ bị hại (R%) Tỷ lệ bị hại (P%) Chỉ số tổn thất (DI) Xã Yên Sơn 38,41 55,85 0,215 Xã Tinh Nhuệ 16,70 31,03 0,052 Xã Tinh Nhuệ 47,20 63,71 0,301 Xã Lương Nha 14,10 26,08 0,037 Trung bình 29,10 44,17 0,129 Từ Bảng 4.03 ta thấy mức độ bị hại và tỷ lệ bị hại trung bình của rừng trồng keo lai tại Lâm trường Tam Thắng là 44,17%, mức độ bị hại trung bình 29,10%, chỉ số tổn thất là DI = 0,129 nằm trong khoảng (0,1 ≤ DI < 0,25) cần loại bỏ lá, thân cành bị bệnh và phun thuốc phòng trừ. Chứng tỏ diện tích rừng trồng keo lai của Lâm trường bị bệnh nặng dẫn đến tổn thất rất lớn về mặt kinh tế. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 4.2. Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở cây keo lai theo các cấp hại Với 15 mẫu keo lai ở các cấp bị hại từ 0 đến 4, mỗi cấp 3 mẫu đã tiến hành phân lập được 30 chủng vi khuẩn nội sinh khác nhau. Các chủng vi khuẩn này được thống kê theo cấp bị hại và ở các vị trí phân lập, được trình bày ở Bảng 4.04. Bảng 4.04: Số lượng chủng khuẩn ở các mức độ bị bệnh STT Mức độ bị bệnh Số lượng Chủng vi khuẩn 1 Cây khoẻ, không bị bệnh 10 B01, B02, B03, B1.3 P01, P1.3, P2.2 X01, X02, X2.2 2 Hại nhẹ 9 B01, B03, B1.2, B1.3 P1.1, P1.3, P2.2 X1.1, X02 3 Hại trung bình 5 B1.3, B3.1 P2.1 X1.1, X02 4 Hại nặng 4 B1.3, B3.1 P3.1 X3.1 5 Hại rất nặng 2 B4.1 P4.1 Qua Bảng 4.04 ta thấy 15 mẫu cành keo lai được lấy ở các cây có các cấp bệnh từ 0 đến 4 đã phân lập được tất cả 30 chủng khuẩn trong đó có 20 chủng vi khuẩn khác nhau. Ký hiệu của các chủng vi khuẩn là: B01, B02, B03, B1.3, B4.1, B3.1, B1.2, P01, P1.3, P2.2, P1.1, P3.1, P4.1, P2.1, X01, X02, X2.2, X1.1, X3.1, X1.3. Cấp bị bệnh 0 (cây khoẻ): phân lập được 10 chủng vi khuẩn trong đó ở phần vỏ phân lập được 4 chủng B01, B02, B03, B1.3. phần tượng tầng 3 chủng P01, P1.3, P2.2 và phần gỗ phân lập được 3 chủng vi khuẩn X01, X02, X2.2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Cấp bị bệnh 1 (cây bị hại nhẹ): phân lập được 9 chủng khuẩn trong đó ở phần vỏ phân lập được 4 chủng là B01, B03, B1.2, B1.3, phần tượng tầng 3 chủng P1.1, P1.3, P2.2 và phần gỗ phân lập được 2 chủng X1.1, X02 vi khuẩn. Cấp bị bệnh 2 (cây bị hại trung bình): phân lập được 5 chủng vi khuẩn trong đó ở phần vỏ phân lập được 2 chủng B1.3, B3.1 phần tượng tầng phân lập được 1 chủng P2.1 và phần gỗ phân lập được 2 chủng vi khuẩn X1.1, X02 Cấp bị bệnh 3 (cây bị hại nặng): phân lập được 4 chủng vi khuẩn trong đó ở phần vỏ phân lập được 2 chủng B1.3, B3.1, phần tượng tầng phân lập được 1 chủng và phần gỗ phân lập được 1 chủng vi khuẩn. - Cấp bị bệnh 4 (cây bị hại rất nặng): phân lập được 1 chủng vi khuẩn ở phần vỏ và 1 chủng khuẩn ở phần tượng tầng. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy: Vi khuẩn phân bố trong cây chủ ở các bộ phận của cây khác nhau: Các chủng vi khuẩn ở cây keo lai thường tập trung ở phần vỏ và phần tượng tầng nhiều hơn so với phần gỗ cụ thể như sau: Ở vị trí vỏ phân lập được 13 chủng khuẩn chiếm 43,33%; ở phần tượng tầng phân lập được 9 chủng khuẩn chiếm 30%; ở phần gỗ phân lập được 8 chủng chiếm 26,67%. Số lượng các chủng vi khuẩn phân lập được trên các vị trí khác nhau của cây chủ được thể hiện ở Hình 4.07: 43.33% 30% 26.67% Vỏ Tượng tầng Gỗ Hình 4.07: Tỷ lệ các chủng khuẩn phân lập được trên các vị trí khác nhau của cây chủ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 4.3. Thử hiệu lực khả năng kháng nấm bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 4.3.1. Xác định cơ chế kháng bệnh thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh Từ 30 chủng vi khuẩn phân lập được tiến hành thử nghiệm hiệu lực của các chủng này với nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Kết quả thử nghiệm hiệu lực kháng nấm gây bệnh và mật độ các chủng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 4.05. Từ Bảng 4.05 cho thấy trong số 30 chủng vi khuẩn phân lập được thì có 7 chủng khuẩn nội sinh (B01, B02, B03, P01, P02, X01, X02, X1.1) có khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. - Cấp bị bệnh 0 (cây khoẻ): phân lập được 10 chủng khuẩn có 6 chủng có khả năng kháng nấm gây bệnh (B01, B02, B03, P01, X01, X02). Đặc biệt chủng vi khuẩn B03 phân lập được từ phần vỏ của cây không bị bệnh (cây khoẻ) mọc rất nhanh và làm cho nấm bệnh chậm phát triển tạo nê