Luận văn Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) ở Việt Nam

iai đoạn Trong nhiều nghiên cứu, người ta đã chứng minh được rằng nhân tố  RpoS đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát triển của màng sinh vật. Tuy nhiên yếu tố này lại xuất hiện không giống nhau trong các giai đoạn phát triển của từng loài vi sinh vật. Nếu như ở E. coli, người ta thấy được sự xuất hiện của RpoS với nồng độ thấp ở pha tăng trưởng lũy thừa và có sự tích tụ lại thì ở P. aeruginosa, sự hiện diện của RpoS được ghi nhận ở đầu pha cân bằng [33]. Sự sản xuất RpoS được điều hòa ở nhiều mức độ khác nhau giúp tế bào đáp ứng với các điều kiện stress của môi trường, bao gồm cả sự giới hạn về mặt dinh Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 24 dưỡng. RpoS điều chỉnh độ dày của cấu trúc màng sinh vật cho phép tế bào thu nhận tối đa nguồn chất dinh dưỡng [75]. Khi màng sinh vật đạt kích thước đủ lớn, các tế bào trung tâm giảm hấp thụ các chất dinh dưỡng, dẫn đến kích hoạt RpoS, là tín hiệu giúp tế bào nhận biết sự giới hạn của nguồn chất dinh dưỡng trong màng sinh vật. Do đó, các tế bào liên kết trong màng sinh vật được giải phóng ở dạng tế bào trôi nổi tự do di chuyển đến môi trường mới thuận lợi hơn [76]. 1.4.3.4 Cơ chế cảm biến tới hạn (Quorum sensing) Thông tin liên lạc nội bào giữa các vi sinh vật được thực hiện chủ yếu thông qua các sản phẩm của vi sinh vật khuếch tán từ tế bào này sang tế bào khác. Một sản phẩm tiêu biểu cho các phân tử cảm biến tín hiệu được biết đến là acyl - HSL [45]. Nghiên cứu trên chủng P. aeruginosa cho thấy các phân tử acyl - HSL chịu trách nhiệm xác định sự tách biệt các khối tế bào vi sinh vật trong cấu trúc không gian ba chiều của màng sinh vật, góp phần giữ cho cấu trúc màng sinh vật ổn định. Các chủng P. aeruginosa đột biến không sản xuất được acyl - HSL dẫn đến các tế bào trong màng sinh vật được đóng gói chặt chẽ với nhau và dễ dàng bị phá vỡ bởi SDS. Acyl - HSL cũng là các phân tử trung gian trong bề mặt bám dính ở chủng Pseudomonas fluorescens [83]. Mặc dù còn khá ít những hiểu biết về vai trò của các tín hiệu nội bào trong màng sinh vật đa loài, song các nhà nghiên cứu tin rằng có một sự khác biệt đáng kể giữa chúng với các màng sinh vật đơn loài [45]. Những nghiên cứu về các tín hiệu nội bào ảnh hưởng đến sự hình thành màng sinh vật vẫn đang là một trong những vấn đề vô cùng thú vị cần được nghiên cứu. 1.5 Nghiên cứu ứng dụng màng sinh vật 1.5.1 Ứng dụng màng sinh vật trong việc xử lý nước thải Xử lý nước thải môi trường, nhất là trong tình hình thực tiễn hiện nay là một vấn đề mang tính thời sự cấp thiết. Bởi lẽ xử lý nước thải không chỉ nhằm mục đích Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 25 cải thiện điều kiện vệ sinh môi trường sống của con người mà xa hơn còn nhằm duy trì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển bền vững lâu dài cho loài người. Hiện nay, việc xử lý nước thải nói chung theo hướng áp dụng các kỹ thuật sinh học rất được chú trọng do chúng có tính bền vững, thích nghi với nhiều điều kiện trong tự nhiên. Trong cấu trúc màng sinh vật, các vi sinh vật liên kết với nhau chặt chẽ, tạo ra một cấu trúc bền vững, hoạt động có hiệu quả hơn trong việc xử lý nước thải. Đồng thời, các vi sinh vật trong mạng lưới màng sinh vật sẽ cùng hợp tác trao đổi chất giúp cho quá trình loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong nước diễn ra dễ dàng và hiệu quả [76]. So sánh với việc sử dụng các chủng vi sinh vật trôi nổi để xử lý nước thải thì công nghệ xử lý sinh học nước thải bằng màng sinh vật mang lại nhiều lợi ích đáng kể. Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh vật cao hơn nhiều, tạo điều kiện xử lý tối đa nguồn nước thải. Hai là, ngoài việc loại bỏ các chất không mong muốn trong nước thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi môi trường. Đối với các tế bào trôi nổi, việc khử trùng nguồn nước sẽ tốn một chi phí lớn, do vậy việc áp dụng màng sinh vật trên các giá thể cố định thể hiện ưu thế lớn. Với những ưu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nước thải ứng dụng màng sinh vật được xem là giải pháp thân thiện môi trường [50]. 1.5.2 Ứng dụng màng sinh vật trong việc ức chế các vi sinh vật gây hại Đấu tranh phòng trừ bệnh gây hại cho cây trồng đã và đang là hướng nghiên cứu rất được quan tâm ứng dụng trong ngành nông nghiệp. Và một trong những biện pháp được ưa chuộng đó là đấu tranh sinh học. Trong đó, nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các vi sinh vật có thể hoạt động như một tác nhân đối kháng với nhiều mầm bệnh khác nhau ở thực vật bao gồm các loại sâu bọ và các mầm bệnh vi sinh vật như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn. Các vi sinh vật có thể tồn tại tự do trong đất hoặc bám dính với bề mặt mô thực vật thành từng cụm tế bào. Mối quan hệ này phần lớn mang lại lợi ích cho cả hai bên: thực vật là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng và nơi khu trú lâu dài cho các Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 26 quần thể vi sinh vật. Mặt khác, các vi sinh vật trong mối tương tác này có thể làm thay đổi môi trường sống xung quanh theo hướng có lợi cho sự phát triển của thực vật [69]. Một trong những cơ chế giúp các vi sinh vật ức chế mầm bệnh gây hại ở cây trồng đó là thông qua chất kháng sinh. Ví dụ, chủng Bacillus cereus UW85 có khả năng tổng hợp cả zwittermycin và kanosamine [69]. Khả năng tổng hợp chất kháng sinh giúp làm tăng tính cạnh tranh giữa các nhóm vi sinh vật; đồng thời cũng là cơ sở để tạo ra các chế phẩm vi sinh vật có khả năng phòng trừ bệnh gây hại ở thực vật chủ yếu dưới dạng phân bón vi sinh bổ sung vào nguồn đất trồng. Bais và cộng sự [5] đã chứng minh rằng nhờ quá trình hình thành màng sinh vật trên rễ cây Arabidopsis, chủng vi khuẩn Bacillus subtilis 6051 đã tạo ra surfactin ức chế sự xâm nhiễm của chủng P. syringae gây hại cây trồng. Khả năng đối kháng của chủng Bacillus thuringiensis chống lại tác nhân gây bệnh cây trồng Erwinia carotovora đã được chứng minh qua nghiên cứu của Morikiwa [56]. E. carotovora sản xuất các phân tử tín hiệu cảm ứng mật độ tế bào acyl - HSL và biểu hiện gen gây độc, trong khi đó các chủng B. thuringiensis có enzyme acyl - homoserine lactonase, làm giảm mạnh acyl - HSL. Do vậy, B. thuringiensis làm giảm đáng kể khả năng nhiễm và phát triển của E. carotovora - tác nhân gây bệnh thối củ ở khoai tây. 1.5.3 Một số nghiên cứu ứng dụng khác  Ứng dụng của màng sinh vật làm giảm sự ăn mòn kim loại Vi khuẩn gây ra sự ăn mòn kim loại được biết đến là các chủng vi khuẩn khử sulfate Desulfosporosinus orientis và vi khuẩn oxy hóa sắt Leptothrix discophora SP-6. D. orientis gây ra sự ăn mòn ở gang, thép cacbon, thép không gỉ và một số hợp kim khác. Hằng năm, thiệt hại do sự ăn mòn kim loại gây ra ở Mỹ là 4 - 6 tỷ USD [34]. Vi khuẩn này có chứa enzyme hydrogenase sử dụng hydrogen như một chất cho điện tử để thu nhận năng lượng gây ra hiện tượng ăn mòn điện hóa ở các bề mặt kim loại. Trong khi đó, vi khuẩn L. discophora SP-6 oxy hóa sắt, tự nó không gây ra sự ăn mòn đáng kể thép nhẹ (thép ít cacbon), nhưng khi có sự kết hợp Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 27 với D. orientis và Paenibacillus polymyxa 10401 thì tốc độ ăn mòn thép nhẹ sẽ tăng lên rất lớn [28]. Nghiên cứu của Morikawa [56] cho thấy sự hình thành màng sinh vật ở chủng Bacillus brevis 18-3 đã tạo ra gramicidin làm giảm đáng kể tốc độ ăn mòn kim loại bằng cách ức chế cả hai chủng vi khuẩn D. orientis và L. discophora SP-6.  Trong công nghiệp lên men Trong các bồn lên men ở quy mô công nghiệp, màng sinh vật là hình thức hiệu quả để giữ lại sinh khối vi sinh vật [47]. Sau mỗi mẻ lên men, các tế bào ở dạng tự do khó có khả năng giữ lại trong các bồn lên men. Do đó, mỗi khi tiếp tục một quy trình mới lại phải bổ sung thêm một lượng sinh khối nhất định và đợi thời gian để vi sinh vật có thể sinh trưởng, phát triển tới một nồng độ nhất định mới. Quy trình này gây tốn kém ở khâu nguyên liệu đầu vào cũng như mất thời gian vận hành. Ngược lại, khi đã được bám giữ trên bề mặt giá thể bằng mạng lưới màng sinh vật sinh khối vi sinh vật có thể được giữ lại một cách có hiệu quả sau mỗi mẻ xử lý cũng như tái sử dụng được ở những lần xử lý tiếp theo mà không cần phải bổ sung thêm vi sinh vật cũng như đợi thời gian phát triển.  Ứng dụng trong công nghiệp dầu khí Nghiên cứu khả năng tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh học (biosurfactant) hoạt tính cao từ chủng vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa, được phân lập từ nguồn nước thải nhiễm dầu [67] mở ra triển vọng ứng dụng trong công nghiệp dầu khí với các mục đích như nâng cao hệ số thu hồi dầu, xử lý môi trường, làm chất phân tán và nhũ hóa cặn dầu. Nghiên cứu về màng sinh vật đã và đang là lĩnh vực thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về tác hại cũng như lợi ích ứng dụng của màng sinh vật trong đời sống. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu thu nhận được từ các công trình khoa học nước ngoài. Tài liệu về màng sinh vật ở Việt Nam còn tương đối ít và nghiên cứu về màng sinh vật còn chưa nhiều, chưa sâu. Đề tài nghiên cứu của chúng tôi với mục đích tạo thêm cơ sở dữ liệu khoa học về các Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 28 chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật từ môi trường nước thải giàu nguồn cacbon ở các khu vực làng nghề và nhà máy sản xuất và đưa ra một số ứng dụng theo hướng xử lý nước thải môi trường. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 29 Chương 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nước thải cũng như ức chế các vi sinh vật gây hại, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nước thải tại một số khu vực ô nhiễm làng nghề ở Việt Nam. Mẫu được lấy vào thời điểm các buổi sáng trong ngày, chứa trong các ống falcon đã khử trùng rồi đem về phòng thí nghiệm để phân tích. Cụ thể, tại các địa điểm sau: Thứ nhất, nguồn nước thải tại làng miến Lại Trạch - Yên Phú - Yên Mỹ - Hưng Yên: Hệ thống thoát nước và hồ lắng của làng miến chứa lượng nước thải lớn lẫn cặn bột và bã bột dong. Mẫu nước thải được lấy tại các hồ lắng này. Thứ hai, nguồn nước thải tại làng bún Phú Đô - Mễ Trì - Từ Liêm - Hà Nội: Toàn bộ nước thải của quá trình làm bún được thải trực tiếp ra các cống, rãnh của cả làng. Do vậy, khu vực nước thải làng nghề nơi chúng tôi lấy mẫu có một màu trắng đục, chua và hôi. Thứ ba, nguồn nước thải tại nhà máy sản xuất bia - Viện Công nghiệp thực phẩm - Thanh Xuân - Hà Nội: Nguồn nước thải được sử dụng là nước thải của xưởng bia - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã được tách cặn thông qua bể lắng sơ bộ. Nguồn nước thải có thành phần COD 2500 - 3000 (mg/l), BOD5 1500 - 2000 (mg/l), pH 4,5 - 5,5. Chỉ số COD cao chủ yếu là do trong thành phần nước thải có chứa nhiều tinh bột và các chất hữu cơ. 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định Các vi sinh vật kiểm định được sử dụng trong đề tài bao gồm: Staphylococcus aureus; Ralstonia solanacaerum; Samonella typhi; E. coli; Vibrio parahaemolyticus do bộ môn Vi sinh thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội phối hợp cung cấp. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 30 2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 2.2.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường LB (Luria - Bertani broth hay Luria broth): Tryptone 10g Cao nấm men 5g NaCl 10g Nước cất 1 lít Môi trường LB là môi trường thường được sử dụng trong việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn hiếu khí. Môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng nguồn cacbon, nitơ cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Môi trường khoáng cơ bản: (NH4)2SO4 2g MgSO4.7H2O 0,2g NaH2PO4.H2O 0,5g CaCl2.2H2O 0,1g K2HPO4 0,5g Nước cất 1 lít Môi trường khoáng cơ sở: KH2PO4 1,36g CaCl2 0,03g Na2HPO4 2,13g MgSO4.7H2O 0,2g FeSO4.7H2O 0,01g Glucose 10g Nước cất 1 lít Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 31 Các môi trường đều được khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 120 phút. Các hóa chất khác sử dụng trong nghiên cứu, đánh giá khả năng tạo màng sinh vật như các loại đường Fructose (Sigma - Mỹ); Arabinose (Merk - Đức), Mannose (Merk - Đức), NaCl (Công ty cổ phần Hóa chất Đức Giang) đều đạt độ tinh sạch cho mục đích nghiên cứu. 2.2.2 Máy móc, thiết bị Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản) Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức) Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý) Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức) Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ) Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản) Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh) Tủ ấm (Memmert - Đức) Tủ sấy (Memmert - Đức) Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức) Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước thải, sử dụng phương pháp pha loãng mẫu trong nước cất vô trùng. Mẫu sau khi pha loãng được cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1, 10-2 đến 10-5 trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch. Các đĩa sau khi cấy trải được nuôi cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện và được quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ. Các khuẩn lạc sau khi phát triển sẽ được tách riêng rẽ và được nuôi cấy trên môi trường phù hợp hoặc LB có bổ sung thạch. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 32 2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật  Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Sau khi phân lập riêng rẽ trên các đĩa petri chứa môi trường LB - thạch, các vi sinh vật được cấy truyền trên môi trường thạch nghiêng thích hợp đã được khử trùng. Các ống thạch nghiêng sau khi cấy được nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ. Các ống giống sau khi phát triển sẽ được lấy ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4oC. Hàng tháng, các ống giống được lấy ra và cấy truyền lại vào môi trường mới.  Phương pháp bảo quản giống lâu dài Các chủng vi sinh vật sau khi phân lập riêng rẽ được bảo quản lâu dài trong môi trường glycerol theo tỷ lệ 1:1 ở nhiệt độ lạnh sâu -80oC. 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật Trong môi trường dinh dưỡng thích hợp và điều kiện nuôi cấy tĩnh, một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật trên bề mặt giá thể. Việc phát hiện, quan sát sự tạo thành màng sinh vật được thực hiện bằng phương pháp nhuộm màu với dung dịch tím kết tinh 1% (w/v). Tím kết tinh (crystal violet hay Gentian violet) là một thuốc nhuộm hóa học triarylmethane có công thức phân tử là C25H30N3Cl, công thức cấu tạo là [C(C6H4N(CH3)2)3]Cl - Tris (4-(dimethylamino) phenyl) methylium chloride. Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống, sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng của các tế bào vi sinh vật. Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của O’Toole và cộng sự [62] Khuẩn lạc các chủng vi sinh vật sau khi tách riêng rẽ sẽ được nuôi cấy kích hoạt trong bình tam giác chứa 10ml môi trường LB lỏng trong 24 giờ ở 37oC sao cho mật độ tế bào OD620 ở vào khoảng 0,3 - 0,4. Hút 100l dịch nuôi cấy vi khuẩn Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 33 bổ sung vào 700l LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC. Sau 24 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf. Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 620 nm (OD620) dịch nuôi cấy vi khuẩn. Phương pháp quan sát khả năng tạo thành màng sinh vật: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng. Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím kết tinh 1% và giữ trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. Dung dịch nhuộm tím kết tinh sau đó được loại bỏ, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh. Mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]: Sau khi rửa sạch 2 lần bằng nước cất, các tinh thể tím bám trên thành eppendorf được hòa tan trong 1ml etanol 70o. Mật độ tế bào trong màng sinh vật được xác định bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm. 2.3.4 Tối ưu hóa các điều kiện tạo màng sinh vật Mỗi chủng vi sinh vật tùy theo đặc tính sinh học của chúng chỉ có thể tạo thành màng sinh vật tốt nhất ở những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, pH, các nguồn carbon, nitơ. 2.3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện nhiệt độ môi trường khác nhau. Các nhiệt độ được lựa chọn nghiên cứu là: 20oC, 30oC, 37oC, 40oC, 50oC và 60oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, tiến hành quan sát, đánh giá khả năng tạo thành màng sinh vật của các chủng vi sinh vật nghiên cứu bằng cách đo độ hấp thụ OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 34 2.3.4.2 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nghiên cứu về khả năng phát triển trong các điều kiện pH môi trường khác nhau. Các giá trị pH môi trường khác nhau được lựa chọn nghiên cứu là: pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. 2.3.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cacon trong môi trường Bổ sung các nguồn cacbon vào môi trường khoáng cơ bản với nồng độ 1%. Các nguồn carbon được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: Đường 5 cacbon: Arabinose, Fucose, Rhamnose Đường 6 cacbon: Glucose, Mannose, Fructose, Galactose Đường đôi: Saccharose, Lactose Polysaccarit : Tinh bột Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ bản có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau, điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. 2.3.4.4 Ảnh hưởng của nguồn nitơ trong môi trường Bổ sung các nguồn nitơ khác nhau vào môi trường khoáng cơ sở với nồng độ 0,1%. Chỉnh pH tới 7,0 - 7,2. Các nguồn nitơ được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3, (NH4)2C6H5O7, Pepton, Cao nấm men. Khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 35 Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường khoáng cơ sở có bổ sung các nguồn nitơ khác nhau với điều kiện tĩnh, ở 37oC. Sau 24 giờ nuôi cấy, mật độ tế bào trong màng sinh vật tạo ra được đánh giá bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng OD 570 nm theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [57]. 2.3.5 Phương pháp đánh giá khả năng tạo chất hoạt động bề mặt Khả năng tạo thành chất hoạt động bề mặt của các chủng vi sinh vật được đánh giá bằng mức độ nhũ tương hóa dung dịch dầu ăn của dịch nuôi cấy tế bào thông qua chỉ số E24 (emulsion index) theo phương pháp của Suwansukho và cộng sự [80]. Các chủng vi sinh vật sau khi được lựa chọn, có hoạt tính tạo màng sinh vật sẽ được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, lắc với tốc độ 160 vòng/phút trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau đó, dịch nuôi cấy lắc được ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy phần dịch nổi. Bổ sung 2ml dầu ăn vào 2ml dịch vi khuẩn thu được sau khi ly tâm trong các ống nghiệm nhỏ, đường kính 1cm. Vortex với tốc độ cao trong 1 phút Sau 24 giờ, lấy ra đo mức độ nhũ tương hóa. Chỉ số nhũ tương hóa E24 được tính theo công thức sau: E24 = [(chiều cao cột nhũ tương hóa)/(tổng chiều cao cột)] × 100% [80]. 2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm đối với các chủng vi khuẩn kiểm định được xác định theo phương pháp của De Angelis và cộng sự [21]. Các chủng vi sinh vật (bao gồm các chủng vi sinh vật đã phân lập được thử nghiệm khả năng kháng khuẩn và các chủng vi sinh vật kiểm định) được nuôi cấy qua đêm trong môi trường LB lỏng trên máy lắc với tốc độ 160 vòng/phút, ở 37oC. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 36 Sau đó, dịch nuôi cấy vi sinh vật thử nghiệm được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ hoàn toàn tế bào vi khuẩn. Dịch lắc của vi khuẩn kiểm định được cấy trải trên các đĩa môi trường LB - thạch với thể tích 100l. Các lỗ được đục với đường kính 6mm trên các đĩa thạch. Dịch lọc của từng chủng vi sinh vật thử nghiệm được cho vào các lỗ thạch với thể tích 30l. Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở 37oC. Quan sát và chụp ảnh trên các đĩa thạch. Khả năng kháng khuẩn của các chủng vi sinh vật thử nghiệm được xác định dựa vào đường kính vòng kháng khuẩn (D) xuất hiện xung quanh lỗ thạch. D = D - d D: đường kính vòng vô khuẩn (mm) d: đường kính lỗ thạch (mm). 2.3.7 Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động như một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tím kết tinh. Ban đầu, vi khuẩn được nhuộm bằng tím kết tinh sau đó được xử lý bằng iot để tăng độ giữ màu. Sau đó được tẩy màu bằng cồn làm co các lỗ của lớp peptidoglican dày lại. Do vậy phức chất tím kết tinh và iot được giữ lại, vi khuẩn có màu tím. Peptidoglican ở vi khuẩn Gram (-) rất mỏng, ít liên kết chéo và có lỗ lớn. Do vậy, ở bước rửa bằng cồn đã loại bỏ phức chất màu tím của tím kết tinh - iot. Khi nhuộm lại bằng safranin thì vi khuẩn có màu hồng [3]. Tiến hành: Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ đĩa thạch (sau khi cấy 24 giờ) hòa vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 - 3 lần. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 37 Nhuộm lại bằng dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu (ethanol 95%), giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2 - 3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Quan sát dưới kính hiển vi: dùng vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần [3]. 2.3.8 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét Chuẩn bị mẫu màng sinh vật nổi: dịch nuôi cấy lắc vi khuẩn phân lập có khả năng tạo màng sinh vật tốt được bổ sung vào bình tam giác chứa 20ml môi trường LB lỏng. Nuôi cấy tĩnh trong 24 giờ, ở 37oC. Mẫu màng sinh vật được gắn lên lamelle, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. Rửa nhẹ mẫu gắn màng sinh vật bằng nước cất khử trùng, để khô tự nhiên. Gắn mẫu lên đế Mạ phủ mẫu bằng vàng trên máy JFC - 1200 trong 5 phút ở 30mA Quan sát và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật) tại phòng chụp hiển vi điện tử quét thuộc Trung tâm Khoa học Vật liệu - Khoa Vật Lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. 2.3.9 Phương pháp phân loại phân tử dựa trên gen 16S rDNA Phương pháp này dựa trên phương pháp Sanger có cải tiến: Dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA - polymerase. Với việc sử dụng thêm các ddNTP cùng các dNTP thông thường, kết quả là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau. Vectơ tái tổ hợp có chứa đoạn gen 16S rRNA mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi trình tự nằm trên một mạch. Khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết Luận văn thạc sĩ Sinh học Trần Thúy Hằng Trường Đại học KHTN 38 phải biến tính tách rời 2 mạch rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó. Mỗi dideoxynucleotit được đánh dấu bằng một hóa chất huỳnh quang có màu khác nhau. Mỗi thuốc nhuộm huỳnh quang phát ra một phổ ánh sáng hẹp với một đỉnh khác biệt. Các số liệu phát ra được lưu ghi lại trong máy tính. Sau khi quá trình chạy điện di kết thúc, chuỗi các tín hiệu huỳnh quang được chuyển ngược thành thông tin trình tự nucleotit [71]. Kết quả được xử lý trên phần mềm PC/Gene, Gendoc, BioEdit và được so sánh với trình tự đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế bằng chương trình BLAST (Basic Local Aignment Search Tool) qua dữ liệu của DDGJ EMBL để tìm xem mức độ