Luận văn Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh

nh hưởng trực tiếp đến sự gia tăng các hoạt động đồng hóa PAH. Tính đến năm 2004 đã có trên 30 enzym C23O và nhiều trình tự nucleotide của các gen mã hóa C23O đã được xác định [34]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang khai thác các khía cạnh ứng dụng và học thuyết của C23O và gen mã hóa C23O trong các chủng đơn, tập đoàn và trong quá trình phân hủy các chất vòng thơm ở tự nhiên và trong xử lý làm sạch bằng phân hủy sinh học. PAH là các chât gây ô nhiễm quan trọng trong nước ngầm. Các PAH có 2 và 3 vòng được quan tâm đặc biệt do khả năng hòa tan cao hơn trong nước và dễ di chuyển vào nước ngầm [43]. Hiện nay, có rất ít công bố về chuyển hóa PAH bởi vi khuẩn kỵ khí. Mặc dù naphthalene và acenaphthalene Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 đã được loại bỏ (rất ít) bởi hỗn hợp vi khuẩn khử nitrat, tuy nhiên cơ chế trao đổi chất của quá trình chưa được sáng tỏ. Gần đây, Coates và cộng sự đã công bố về khả năng oxy hóa PAH đến CO2 dưới điều kiện khử sulphat của các mẫu tràm tích vịnh San Diego [18]. Tuy nhiên quá trình này đòi hỏi nhiều thời gian và tốc độ rất chậm [16]. Phân hủy kỵ khí PAH đã được nghiên cứu với NO 3- , ion Fe hoặc SO4 2- như là các chất nhận điện tử và dưới các điều kiện sinh methan. Các con đường phân hủy sinh hóa đã được nghiên cứu với các tập đoàn vi khuẩn hoặc chủng sạch phân hủy napthalene và cho thấy, 2-naphthoic acid là chất trao đổi chất trung gian. Naphthalene được họat hóa bởi bổ sung đơn vị C1 để tạo ra 2-naphthoic acid, trong khi đó methylnaphthalene được hoạt hóa bởi bổ sung fumarate đối với nhóm methyl và được phân hủy tiếp thành 2-naphthoic acid. Phân hủy 2-naphthoic acid được thực hiện qua khử và cắt vòng để tạo ra 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoic acid. Sản phẩm trung gian cắt vòng như là 2- carboxyclohexylacetic acid cho thấy sự phân hủy diễn ra qua các dẫn xuất cyclohexan chứ không qua các hợp chất thơm. Phân hủy kỵ khí PAH cũng đã được chứng minh trong môi trường nước nhiễm bằng xác định các hợp chất trao đổi chất đặc hiệu và nghiên cứu đồng vị phóng xạ. Các sản phẩm trao đổi chất đặc hiệu phân hủy kỵ khí PAH như naphthyl-2-methylsuccinate đã được phát hiện chứng tỏ sự phân hủy kỵ khí của 2-methylnaphthalene, trong khi đó 2-naphthoic acid là dấu hiệu của phân hủy kỵ khí naphthalene và 2- methylnaphthalene [43]. 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Ngoài các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ ẩm của đất, nồng độ oxy, nó còn Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các PAH, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của các PAH trong môi trường. Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào. Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16], [51], [31], [42], [61]. Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của chúng. Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trường, vấn đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý. Quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân bởi các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ chậm, do vậy việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát triển tốt nhất, có hiệu quả phân hủy sinh học cao có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học. Theo Yuan và cộng sự (2000), điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân của đối tượng mà tác giả nghiên cứu là 30 o C, pH 7. Hai chủng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia AC1100 phát triển tốt nhất ở 29 o C [30]. Một số nghiên cứu khác cho thấy chủng Streptomyces danangensis XKDN19 có khả năng phát triển tốt nhất ở 32 o C, pH 6, nồng độ NaCl 0 - 3% [9]; chủng Streptomyces danangensis XKDN11 ở 30 o C, pH 7, nồng độ NaCl 0,5% [1]; chủng nấm sợi FDN20 ở 28 o C, pH 6, nồng độ NaCl 3% [3]. Các yếu tố khác như nguồn nitơ, photpho, cacbon và các khoáng khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển và phân hủy chất độc của các vi sinh vật. Nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự (2002) về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Sphingomonas phân lập từ đất nhiễm dầu cho thấy các chủng này có khả năng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 o C, pH 7 - 7,8 và nồng độ muối NaCl từ 0% đến 3% [4]. Một số Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 tác giả khác cũng phát hiện điều kiện tối ưu cho phân hủy sinh học PAH ở 30 o C và pH 7 [31], [51], [61]. Trên đây là những kết quả quan trọng trong việc kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa trong đó có vi khuẩn để tiến tới xử lý vùng đất nhiễm độc hóa học. Trong tự nhiên, thường không tồn tại một loại hydrocarbon thơm đa nhân mà thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp. Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp các PAH là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ của chúng. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học, nồng độ của PAH cao sẽ làm giảm quá trình phân hủy sinh học và gây độc cho vi sinh vật. Các PAH có trọng lượng phân tử thấp, cấu trúc đơn giản dễ dàng phân hủy hơn so với các PAH có trọng lượng phân tử cao và có cấu trúc phức tạp. Theo Yuan, điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân đối với đối tượng tác giả nghiên cứu là tại nhiệt độ 30 o C, pH 7 [52]. Tác giả Zaidi cùng các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phân hủy phenanthrene và nhận thấy tại pH từ 6 đến 7 thì không ảnh hưởng mạnh đến khả năng phân hủy, nhưng tại pH 10 thì gây ức chế khả năng phân hủy phenanthrene của vi sinh vật [14],[61]. Bên cạnh các yếu tố quan trọng kể trên phải kể đến các yếu tố dinh dưỡng. Đó là nguồn nitơ, phốt pho, các nguồn cacbon có thể bổ sung như cao men, glucoza, axetat, pyruvat.v.v. Đây cũng sẽ là những nghiên cứu rất cần thiết phục vụ cho quá trình tạo các yếu tố công nghệ thích hợp trong xử lý tẩy độc [37]. Sự phân hủy sinh học các hydrocarbon thơm đa nhân riêng rẽ trong mẫu thí nghiệm đã không ngừng được nghiên cứu và ngày càng thu được nhiều kết luận có giá trị [16], [42], [58]. Các PAH có cấu trúc phân tử đơn giản, trọng lượng phân tử thấp dễ dàng phân hủy sinh học hơn so với các Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 PAH có trọng lượng phân tử cao và cấu trúc phức tạp [11], [16], [58], [59]. Tuy nhiên, chúng ta còn ít hiểu biết về khả năng phân hủy sinh học các PAH khi chúng có mặt đồng thời trong các vùng ô nhiễm. Thường trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại PAH mà tồn tại hỗn hợp các PAH. Do đó, việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp PAH là điều cần thiết để có thể đánh giá được ảnh hưởng qua lại và tương quan nồng độ của chúng đến sự phân hủy hỗn hợp. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học [58]. Yuan cùng cộng sự (2000) tiến hành nghiên cứu khả năng phân hủy đồng thời các PAH trong bùn sông có nhiễm PAH. Kết quả cho thấy, tốc độ phân hủy Phenanthrene giảm khi có mặt thêm bất kì một PAH nào trong mẫu. Khi 6 PAH có mặt đồng thời, tốc độ phân hủy phenanthrene, acenaphthalene giảm nhưng tốc độ phân hủy Anthracene, Fluorene và Pyrene lại tăng [58]. Ngoài ra, tốc độ phân hủy PAH cũng còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt không phân cực như Bij 30, Bij 35, triton X100, triton N110. Các chất này gây độc và ức chế hoạt động của vi sinh vật vì chúng có khả năng tương tác với màng tế bào hay chính xác hơn là các phân tử chất hoạt động bề mặt tương tác với protein màng tế bào [40]. Các chất này cũng có thể trực tiếp gây ức chế hoạt động của các enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa PAH. Có thể chúng còn liên kết với cả các enzyme hay với các cơ chất . Một lí do làm giảm khả năng phân hủy sinh học các hợp chất này là chúng hạn chế sự tiếp xúc của tế bào vi sinh vật với các chất hữu cơ hòa tan trên bề mặt [61]. Tóm lại, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân là rất quan trọng. Có thể coi đây là cơ sở công nghệ cho quá trình xử lý ô nhiễm PAH bằng phương pháp phân Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 hủy sinh học (bioremediation), đảm bảo các điều kiện thuận lợi làm cho tốc độ phân hủy các hydrocarbon đa nhân có thể đạt tới mức tối đa. 1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên. Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm. Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn. Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật. Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử axit nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại. Từ đó có thể thành lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các loài với nhau. 1.6.1. Phương pháp phân loại truyền thống Phương pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thái kết hợp những đặc điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại. Các phương pháp cổ điển thường dùng các chỉ tiêu để phân loại là: màu sắc, kích thước của khuẩn lạc phát triển trên môi trường; các đặc điểm giống nhau về hình dạng, kích thước, có hay không có tiên mao của tế bào vi khuẩn; sự khác nhau về đặc điểm sinh hóa: phản ứng nhuộm Gram, sự kháng chất kháng sinh, sự trao đổi chất và dinh dưỡng, đối tượng vật chủ, phân tích phân tử axit teichoic. Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như: kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệt các chủng của một loài [15]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 1.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic. Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại. Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử”. Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả mức độ sử dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [35] Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại DNA nhiễm sắc thể Thành phần bazơ (%G+C) Chi Biến tính DNA :DNA Loài Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxom RNA riboxom Trình tự nucleotide Loài, chi và trên chi Lai DNA : rRNA Protein Trình tự axit amin Chi và trên chi So sánh bằng phản ứng huyết thanh Loài và chi Các kiểu điện di Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysacharid Axit teichoic Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Màng Axít béo Loài và chi Lipid phân cực Axit mycolic Isoprenoid quinonones Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA). Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài. Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác. Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật. Trong 3 loại gen rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại. Gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng. Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000) nucleotide do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự. Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu. Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 chúng bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [35]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu để sử dụng trong đề tài nghiên cứu này là mẫu nước nhiễm dầu thu thập tại bể thu gom của xí nghiệp khai thác mỏ Quảng Ninh. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết cao của các hãng trên thế giới như New England Biolabs, Sigma, Merk v.v. Cặp mồi 27F và 1492R được tổng hợp tại hãng Invitrogen TM , vector PCR ® 2.1 (Invitrogen). Mồi xuôi (27F ): 5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’ Mồi ngược (1492R) : 5’ - GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’ Cặp mồi catechol 2,3-dioxygenase được tổng hợp tại hãng Alpha DNA (Canada). Mồi xuôi (C23OF) : 5’ - ATG GAT DTD ATG GGD TTC AAG GT - 3’ Môi ngược (C23OR) : 3’ - ACD GTC ADG AAD CGD TCG TTG AG - 5’ 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy + Môi trường muối khoáng dịch (g/l) NH4NO3 4 NaCl 1,2 KH2PO4 0,3 Nước máy vừa đủ 1 lít MgSO4 0,4 pH 6,5 NaH2PO4 0,7 + Môi trường muối khoáng thạch (g/l): Thành phần các loại hóa chất giống như môi trường khoáng dịch nhưng được bổ sung thêm 20g agar. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 + Môi trường muối khoáng được bổ sung thêm hỗn hợp vitamin, hỗn hợp vi lượng và cao men. Môi trường trước khi được sử dụng được khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 25 phút. + Môi trường LB dịch (g/l) NaCl 10 Nước cất vừa đủ 1 lít Trytone 10 pH 7 Cao men 5,0 + Môi trường LB thạch (g/l): Thành phần các hóa chất tương tự môi trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 20g agar. + Nước muối sinh lý (0,85%) NaCl 8,5g Nước cất 1 lít 2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ sinh học bao gồm: kính hiển vi, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, máy PCR, máy soi DNA, máy điện di Bio-Rad, máy chụp ảnh Gel-Doc, tủ lạnh các loại 4 o C, -20 o C, - 80 o C, máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, lò vi sóng, pipet man của hãng Eppendorf, bình nón, đầu côn, ống ly tâm v.v. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu Làm giàu vi sinh vật lần một bằng cách hút 5 ml mẫu nước nhiễm dầu chuyển vào trong bình tam giác chứa 45 ml môi trường khoáng dịch có bổ Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 sung vitamin, vi lượng, cao men và PAH với nồng độ 50 ppm. Nuôi lắc bình 200 vòng/phút, ở 30 o C trong 5 ngày. Làm giàu vi sinh vật lần 2 và lần 3 tương tự như mẫu làm giàu lần 1. Tiến hành pha loãng mẫu làm giàu lần 3, rồi gạt mẫu pha loãng trên môi trường muối khoáng có bổ sung vitamin, vi lượng, cao men và 100 ppm PAH. Mẫu được đem nuôi tĩnh ở 30 o C. Chọn chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có PAH rồi tiến hành nuôi lắc và làm sạch. 2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn * Phƣơng pháp nhuộm Gram Lam kính được rửa sạch bằng các dung dịch rửa, sau đó làm khô trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy một giọt dịch sau 16 giờ nuôi nhỏ lên lam kính rồi dùng que cấy vô trùng dàn đều giọt dịch và cố định tế bào trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím kết tinh (Cystal violet) trong thời gian 1 phút. Rửa bằng nước cất rồi nhuộm tiêu bản với lugon trong thời gian 2 phút. Tiếp tục rửa tiêu bản bằng cồn 70 % khoảng 20 giây, sau đó rửa bằng nước sạch rồi để khô. Nhuộm tiếp với safarin trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất 2 lần và để khô tự nhiên. Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần dưới vật kính dầu. Nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím thuộc loại Gram (+) còn bắt màu hồng là Gram (-). Vi khuẩn sử dụng làm đối chứng cho nhóm Gram (-) là E. coli và Gram (+) là Bacillus. * Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét Vi khuẩn được nuôi cấy 5-7 ngày trên môi trường muối khoáng chứa PAH. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc vô trùng để loại bỏ cặn, rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Rửa lại sinh khối vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 photphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý đưa lên lưới đồng khoảng 1 phút để cho mẫu bám được vào lưới. Rửa nhẹ bằng nước sạch sau đó làm khô mẫu qua cồn 25, 50, 75, 100 % T-butyl. Sau đó làm khô mẫu bằng máy đông khô và phủ mẫu bằng vàng. Mẫu được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Hình thái tế bào vi khuẩn được chụp ảnh và đo kích thước. Cố định mẫu và soi kính được thực hiện tại Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Hồ Chí Minh. 2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn PAH được xác định bằng phương pháp đo quang phân tử, dựa trên sự dịch chuyển điện tử trên các orbital п của các nối đôi liên kết trong vòng thơm của PAH. Khả năng chuyển hóa PAH của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS: GBC - CINTRA 4. 20 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật sử dụng PAH được chiết bằng 180 ml acetone, sau đó lọc toàn bộ, thu dịch lọc đưa đi phân tích. Nồng độ của mỗi PAH trước và sau xử lý được tính toán dựa vào chiều cao peak hấp thụ tại các bước sóng, các PAH hấp thụ tại các bước sóng như: pyrene 275 nm; fluorene: 257,7 nm, fluoranthrene: 286,7 nm, phenanthrene: 292,6 nm, anthracene: 252 nm, naphthalene: 296 nm. 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phương pháp của Sambrook, Russell [47]. Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách lấy dịch nuôi cấy chuyển vào ống li tâm rồi li tâm với vận tốc 6.000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút. Bƣớc 2: Hòa tan mẫu trong 400 µl đệm lys is rồi lắc kỹ cho tan tủa. Bƣớc 3: Bổ sung 50 µl lysozym và ủ ở 37 o C trong 30 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 20 µl protease K rồi ủ ở 56 o C trong 2 giờ. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bƣớc 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1) với tỷ lệ 1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Bƣớc 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng cồn tuyệt đối, giữ ở -20 o C trong khoảng 2-3 giờ. Bƣớc 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C, thu tủa DNA. Bƣớc 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C Bƣớc 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này tạo ra bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và được sử dụng phổ biến đến nay. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn. Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, máy PCR v.v. * Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5 µl MgCl2 25 mM 3,0 µl dNTPs 2,5 mM 2.5 µl Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,2 µl H2O 13,3 µl DNA khuôn 1,5 µl Tổng thể tích 25 µl Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Đối với nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và 1492R thì chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: Bƣớc 1 95 o C trong 5 phút Bƣớc 2 94 o C trong 1 phút Bƣớc 3 55 o C trong 1 phút Bƣớc 4 72 o C trong 2 phút Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bƣớc 6 72 o C trong 7 phút Bƣớc 7 4 o C bảo quản mẫu Trong trường hợp nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase sử dụng cặp mồi C23OF và C23OR với chu trình nhiệt dưới đây: Bƣớc 1 94 o C trong 7 phút Bƣớc 2 94 o C trong 1 phút Bƣớc 3 55 o C trong 1 phút Bƣớc 4 72 o C trong 1 phút Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bƣớc 6 72 o C trong 10 phút Bƣớc 7 4 o C bảo quản mẫu 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng Biến nạp: bộ Kit TA Cloning (R) của hãng Invitrogen TM (Mỹ) đã được sử dụng cho quá trình biến nạp. Nguyên tắc: Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được sử dụng để gắn vào vector PCR 2.1 tạo thành vector mang đoạn gen 16S rRNA. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 * Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 1,0 µl Vector pCR2.1 1,5 µl Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết) 1,2 µl Enzyme T4 ligase 1,0 µl Nước 5,3 µl Tổng thể tích 10 µl Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết vào vector được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 14 o C, thời gian 18 giờ. Sau đó sản phẩm này được biến nạp vào tế bào khả biến (vi khuẩn E. coli INV F’). * Quy trình biến nạp: Bƣớc 1: Lấy 4 µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả biến E. coli INV F’ rồi ủ trên đá 30 phút. Bƣớc 2: Sốc nhiệt 42 o C trong thời gian 45 giây. Bƣớc 3: Đặt ống tế bào lên đá trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 250 µl SOC vào ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc 37 o C trong khoảng 1 giờ. Bƣớc 5: Hút dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 50 mg/l ampicilin, và 50 mg/ml X-Gal. Sau đó nuôi ở 37 o C trong khoảng 16-18 giờ. Chọn các dòng khuẩn lạc màu trắng và một dòng khuẩn lạc màu xanh nuôi trên môi trường LB dịch. Trên môi trường LB có X-gal những khuẩn lạc màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai. * Quy trình tách chiết DNA plasmid: Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm dịch nuôi 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, đổ dịch và thu tủa. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Bƣớc 2: Bổ sung 100 µl Sol I rồi vontex kỹ cho tan hết tủa. Bƣớc 3: Thêm 200 µl Sol II và đảo nhẹ, ủ đá khoảng 5 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 150 µl Sol III, đảo đều rồi ủ đá 10 phút. Bƣớc 5: Bổ sung C:I theo tỷ lệ 1:1 v/v, lắc đều rồi ly tâm 12.000 vòng/phút tro