Luận văn Phân lập, tuyển chọn vi sinh vật sinh hương trong công nghệ sản xuất nước mắm

đã phân lập được một chủng từ cá và từ giai đoạn đầu của quá trình sản xuât nước mắm. Đó là vi khuẩn yếm khí, tạo bào tử. Ông cho rằng đó là một chủng mới thuộc nhóm Clostridium có liên quan đến tạo hương vị đặc biệt cho nước mắm. Vi khuẩn này có đặc tính kị khí bắt buộc, phát triển tốt trong môi trường có đường glucoza, maltoza, fructoza và đường kính, tạo khí, nhiệt độ thích hợp từ 28 – 450C. Nó có thể tạo enzyme proteaza trong môi trường muối, chủ yếu chúng tạo ra các hợp chất chưa nitơ, dễ bay hơi trong nước mắm. Sau này tác giả Trương Văn Chôm [15] đã phát hiện ra acid axetic và acid n.butanoic và giả thiết rằng có thể vi khuẩn lên men lactic liên quan đến vấn đề tạo hương. Việc phân hủy protein từ cá là do hai nguyên nhân chính: Do enzyme có sẵn trong cá và do enzyme từ vi sinh vật trong nước mắm Các sản phẩm được làm trong điều kiện vô trùng thiếu hẳn hương vị của nước mắm. Như vậy vi sinh vật tồn tại trong quá trình sản xuất một mặt thúc đẩy nhanh quá trình phân hủy bằng chính enzyme tạo ra mà thành phần quan trọng hơn cả là tạo ra các sản phẩm hình thành hương vị đặc trưng của nước mắm. Nhiều nhà nghiên cứu khác như Saisithi và cộng sự [27] đã nghiên cứu vai trò vi sinh vật trong quá trình tạo hương nước mắm bằng cách phân tích các hợp chất bay hơi từ nước mắm Thái Lan, Melver và cộng sự [21], Sanceda và cộng sự [28,29] đã tách các thành phần bay hơi trong nước mắm Philippin rồi so sánh chúng trong thành phần nước mắm Nhật Bản, nước mắm Việt Nam. Suphson Chayovan và cộng sự [29] với kết quả phân tích thành phần axit bay hơi và axit không bay hơi, tác giả nhận thấy khó có thể chỉ ra một axit riêng rẽ nào đó mang đặc trưng của hương vị nước mắm. Hương nước mắm là do ảnh hưởng của các yếu tố axit bay hơi và các axit không bay hơi tạo ra trong quá trình lên men. Các hợp chất chứa nitơ có thể đóng vai trò quan trọng trong hương nước mắm. Một khả năng khác cũng được dự đoán là hương nước mắm là kết quả của việc tạo ra các axit bay hơi (acid axetic, acid propionic, acid butyric, acid isobutyric, acid isovaleric) từ chủng vi khuẩn Pediococus halophilus. Hiroshi Itoh [17] cho rằng hàm lượng cao acid axetic, acid lactic trong nước mắm là kết quả của các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men tạo nên acid lactic. Chương 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Nguyên liệu chính phục vụ cho quá trình nghiên cứu là các mẫu chượp ở các giai đoạn khác nhau từ các xí nghiệp sản xuất nước mắm Hải Phòng, Nghệ An, và mẫu chượp được làm tại Viện Công Nghệ Thực phẩm. Cá cơm được cung cấp bởi cơ sở sản xuất nước mắm Nghệ An Enzyme protease thương phẩm được lựa chọn để nghiên cứu trong đề tài là enzyme Alacalse, Flavourzyme được cung cấp bởi hãng Novoenzyme (Đan Mạch). 2.2 Hóa chất và thiết bị. 2.2.1. Hóa chất: Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đều là những hóa chất tinh khiết cho phân tích, cho nghiên cứu về sinh học phân tử hoặc dùng cho thực phẩm có xuất xứ từ Đức, Nhật, Mỹ, Pháp, Trung Quốc. 2.2.2. Thiết bị dùng trong nghiên cứu Dụng cụ: Hộp petri, pipet tự động các loại, ống nghiệm, ống eppendorf, cốc đong, đèn cồn, que cấy, bình tam giác Thiết bị cơ bản phục vụ thí nghiệm Tên thiết bị Hãng sản xuất - Kính hiển vi Niko, Nhật Bản - Máy đo pH Thuỵ sỹ - Tủ ấm, tủ sấy Liên Xô - Máy đo OD Anh - Nồi hấp Nhật Bản - Máy li tâm Hettich Zentrifugen - Đức - Cân điện phân tích Sartorius- Đức - Lò vi sóng Nhật - Buồng cấy vô trùng Pháp - Tủ lạnh Sanyo- Nhật Bản - Bể ổn nhiệt BW 400 Yamato Scientific- Nhật - Máy Voltex Nhật 2.3. Môi trường phân lập và nuôi cấy vi sinh vật - Môi trường Plate Count Agar: dùng để phát hiện vi khuẩn hiếu khí - Môi trường LB: dùng để nuôi cấy nhóm Bacillus Thành phần Khối lượng g/l Tryptone 10 Cao men 5 NaCl 5 Nước 1000ml Agar 20 pH 7 – 7,4 Môi trường MRS: Dùng để nuôi cấy nhóm Lactobacillus Thành phần Khối lượng (g/l) Cao thịt 5 Pepton 10 Cao men 5 Glucose 20 Aminoxitrat 2 MgSO4.7H2O 0,2 MnSO4.7H2O 0,2 CH3COONa 5 KH2PO4 2 Tween-80 1ml Agar 14 CaCO3 5 Nước 1000ml pH 6,2 – 6,5 - Môi trường Place Count Agar (PCA) có bổ sung BCP: dùng để xác định sự có mặt của nhóm vi khuẩn Lactobacillus 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp vi sinh a. Phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu chượp cá Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau 10-1 đến 10-7Tùy theo số lượng vi sinh vật trong mẫu nhiều hay ít mà pha loãng đến nồng độ cần thiết. Sử dụng nước cất đã hấp vô trùng để pha loãng. Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường, dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h Phân lập vi khuẩn Bacillus Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau xử lý ở 800C trong 10 phút Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường (1), dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h. Xác định nhóm vi khuẩn lactic Pha loãng dung dịch mẫu ở các cấp độ khác nhau. Lấy 100 µl từ mỗi độ pha loãng cho vào hộp petri chứa môi trường PCA có chứa BCP, dàn đều bằng que trang vô trùng, nuôi trong tủ ấm ở 300C, quan sát khuẩn lạc sau 16h, 24h, 36h, 48h. Các khuẩn lạc nào có tạo vòng sinh axit trên môi trường BCP được các định thuộc nhóm vi khuẩn lactic b) Định tên các chủng vi khuẩn đã phân lập và tuyển chọn Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào Nuôi cấy các chủng vi khuẩn trên môi trường thạch thường ở nhiệt độ 370C. Sau 2 ngày, quan sát và mô tả hình thái khuẩn lạc. Nhuộm Gram và quan sát hình dạng tế bào. -       Chuẩn bị vết bôi: -       Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. -        Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. -        Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây, rửa nước, thấm khô. -        Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: dùng vật kính dầu 100X. Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ. Xác định khả năng sinh bào tử Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường. Sau 3 ngày tiến hành xử lý nhiệt ở 800C. Dùng vi khuẩn đã xử lý nhiệt cấy lại trên đĩa thạch thường đặt ở 300C. Sau 24 giờ nếu xuất hiện khuẩn lạc thì kết luận chủng vi khuẩn có khả năng sinh bào tử. Nếu không thì kết luận ngược lại. Xác định hoạt tính catalaza Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường thạch thường dịch thể, đặt ở 300C. Sau 24 giờ, nhỏ 2 giọt H2O2 vào dịch nuôi cấy. Nếu sủi bọt ta kết luận có hoạt tính catalaza. Ngược lại không có hoạt tính Xác định đặc điểm sinh học phân tử Œ Phương pháp tách ADN vi khuẩn - Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 ml TE trong ống Eppendoft - Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 370C trong 30 phút - Thêm 100 ml SDS 10%, ủ ở 370C trong 30 phút - Thêm 300 ml PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên (Bước này được lặp lại 2 lần). - Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN. - Rửa tủa bằng etanol 70%. - Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không - Thêm 30-50 ml nước, bảo quản để dùng dần. Điện di trên gel agaroza Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước. - Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn đều 2ml dung dịch loading buffer 6x với 5ml mẫu, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 ml/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel. ŽPhản ứng khuếch đại ADN Thành phần Thể tích (%) 10 X buffer 10 dNTP 1,25 mM 16 Mồi xuôi 1 (10 pmol/ml) Mồi ngược 1 (10 pmol/ml) Taq polymeraza 1,2 Mẫu 2 Nước Đủ 100 Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí nucleotit 27 đến 47 của E.coli Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí nucleotit 1525 đến 1507 của E.coli - Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 94 1 phút 2 lặp lại 30 lần chu kỳ sau 94 30 giây 55 45 giây 72 2 phút 30 giây 3 72 7 phút 4 4 - Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như đối với điện di genom.  Xác định hàm lượng axit nucleic Do trong thực tế thường phải sử dụng những lượng axit nucleic rất nhỏ (thường là micro-, nano- hoặc picogram) khi tiến hành các thí nghiệm tách dòng. Không thể xác định số lượng này một cách trực tiếp mà nồng độ của dung dịch axit nucleic được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng 260 nm (A260) trong máy đo quang phổ kế. Một đơn vị (1,0) giá trị hấp thụ bước sóng 260 nm tương đương với nồng độ 50mg/ml của ADN sợi kép, hoặc tương đương với nồng độ 40mg/ml của ADN hoặc ARN mạch đơn. Tỉ số A260/A280 là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. Tỷ số A260/A280 là 1,8 đối với mẫu ADN sạch.  Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau : Terminator Ready Reaction Mix 8 ml Mồi 1 ml Mẫu 1ml Nước cất đủ đến 20ml - Chu trình nhiệt: Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian 1 96 1 phút 2 lặp lại 25 lần chu kỳ sau 96 10 giây 50 5 giây 60 4 phút 3 4 - ‘ Đọc trình tự ADN Trình tự của rADN 16S của các chủng vi khuẩn được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động ABI 3100 Avant. Sau đó kết quả trình tự được so sánh với các trật tự của các loài đã có trong ngân hàng gen quốc tế để xác định đến tên loài. c. Xác định mật độ vi sinh vật: - Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch: Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 180v/p trong 24h, sau đó tiến hành pha loãng dịch huyền phù đến 10-7, hút 50µl dịch pha loãng, cấy gạt trên môi trường thích hợp, đặt vào tủ ấm 30 – 320C, sau 24h đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri. Số lượng khuẩn lạc trong 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức: N = a x 1/K x 1/V a: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa thạch K: nồng độ pha loãng V: thể tích dịch pha loãng cấy trải trên đĩa thạch - Phương pháp đo mật độ quang học-OD Số  lượng tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi có thể  xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ quang học. Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở  bước sóng 620 nm. 2.4.2. Phương pháp sinh hóa a. Xác định khả năng chịu mặn các chủng vi sinh vật. Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS, LB với độ mặn 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12% . b. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của các chủng vi sinh vật. Chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường lỏng tại các khoảng nhiệt độ được khảo sát là: 20; 25; 30; 35 và 450C. Kết quả được đo sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học - OD ở bước sóng l = 620nm. Cứ 4h lấy mẫu ra đo một lần. Kết quả cho trên đồ thị 3 ở 28h. c. Xác định ảnh hưởng của pH tới sự phát triển của các chủng vi sinh vật. Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của các chủng vi khuẩn trong môi trường MRS và LB lỏng. Dải pH được khảo sát từ 4 – 8, ở nhiệt độ đã lựa chọn, trong 48h. Cứ 4h lấy mẫu đo OD một lần. Kết quả được biểu diễn trên đồ thị 4, ở 28h d. Xác định ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống. Chúng tôi tiến hành khảo sát tỷ lệ tiếp giống trong môi trường lỏng, với các tỷ lệ khác nhau: 1; 3; 5; 7; 10; 15; 20% giống. Với môi trường có pH và nhiệt độ nuôi thích hợp, trong 24h đem đo OD. e. Xác định khả năng sinh enzyme proteaza của các chủng vi sinh vật phân lập . Môi trường sơ tuyển là môi trường phân lập có nồng độ muối 10% cộng 0.5% protein (sữa tách béo). Cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào chính giữa hộp lồng với môi trường sơ tuyển. Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp (48 – 72h). Nếu xung quanh vết cấy xuất hiện vòng tròn thuỷ phân trong suốt thì ta nói rằng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteaza. Và đo vòng phân giải (D-d;mm) trong đó: D: Chiều rộng của đường phân giải d: Độ rộng của khuẩn lạc vi khuẩn 2.4.3 Phương pháp tính toán thống kê: Thống kê kết quả bằng phương pháp ANOVA (chương trình TAGRAPHIC) cho hai nhân tố, với sự kiểm tra mức độ khác biệt có ý nghĩa của nghiệm thức qua kiểm định LSD. 2.4.4 Phương pháp cảm quan [13] Cách tiến hành: a) Chế biến mẫu chượp bằng cá cơm theo phương pháp thủy phân cá bằng enzyme sau đó bổ sung các chế phẩm vi sinh vật sinh hương Cá: xay nhỏ, trộn enzyme Flavouyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 500C trong 2 ngày, bổ bổ sung vi sinh vật đã được tuyển chọn vào các mẫu chượp theo tỉ lệ 105 CFU/g nguyên liệu cá, sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%. Sau khi chượp chín, cảm quan hương thơm nước mắm bằng phương pháp cho điểm. b) Mẫu đối chứng: Chế biến mẫu chượp bằng cá cơm theo phương pháp thủy phân cá bằng enzyme không bổ sung các chế phẩm vi sinh vật sinh hương. Các mẫu này được đánh giá cảm quan như mẫu thí nghiệm Cảm quan mùi hương nước mắm Chuẩn bị mẫu Thành lập hội đồng cảm quan gồm 6 thành viên làm việc độc lập Điểm Yêu cầu 5 Sản phẩm có mùi thơm rất đặc trưng của nước mắm, dễ chịu 4 Sản phẩm có mùi thơm đặc trưng của nước mắm 3 Sản phẩm có mùi thơm nhẹ của nước mắm 2 Sản phẩm có mùi thơm rất nhẹ của nước mắm 1 Sản phẩm không có mùi thơm của nước mắm, không có mùi lạ 0 Sản phẩm có mùi lạ, hư hỏng Đánh giá kết quả 2.4.5. Nghiên cứu tỷ lệ bổ sung các chủng vi khuẩn sinh hương trong sản xuất nước mắm a, Nghiên cứu sự kết hợp các chủng vi khuẩn tới khả năng sinh hương Các chủng vi khuẩn được được lựa chọn, bổ sung kết hợp vào các mẫu chượp. Kết hợp hai chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1 Kết hợp ba chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1:1 Kết hợp bốn chủng vi khuẩn theo tỉ lệ 1:1:1:1 Hỗn hợp vi khuẩn bổ sung vào các mẫu chượp theo tỉ lệ 105 CFU/g nguyên liệu cá. Đánh giá cảm quan hương thơm nước mắm. b, Ảnh hưởng tỉ lệ vi khuẩn với khả năng sinh hương Các mẫu chượp được chuẩn bị bao gồm Cá, muối, enzyme. Lượng vi khuẩn bổ sung với các tỉ lệ 104, 105, 106, 107 CFU/g cá. Đánh giá cảm quan hương thơm nước mắm. 2.4.6 Phương pháp phân tích a. Phân tích các cấu tử hương bằng GC- MS. Mẫu xác định thành phần hương được phân tích các cấu tử trên máy GC-MS. Xử lý mẫu phân tích các cấu tử tạo hương: Lấy 300ml mẫu với 450 ml nước cất, trích ly bằng diethyl ether, làm khan, phân tích trên hệ GC-MS Chương trình cài đặt phân tích GC-MS - GC: Injector: 1800C; He: 2ml/ phut; Chương trình nhiệt độ 1000C – 1800C (200C/phút ); lượng mẫu bơm 0.2ul; DB5 (30m x 0,25mm x 0,25um). - MS: Nguồn Ion: 200 0C, 70 eV; Phổ quét: 30 – 300m/z b. Phân tích protein tổng số theo phương pháp Kjeldahl[9] Cơ sở của phương pháp: Mẫu phẩm vật được vô cơ hóa bằng aicd sunfuric đậm đặc. Hợp chất hữu cơ bị oxy hóa và tạo thành CO2 và H2O còn nitơ sau khi giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dịch theo phản ứng (1) và (2) R –CH2N-CH2-COOH +H2SO4 NH3 + CO2+ SO2+ H2O (1) NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 (2) Đuổi amoniac khỏi dung dịch bằng NaOH, đồng thời cất và thu bằng một lượng dư acid boric H3BO3 theo phương trình (3) và (4) (NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2H2O +2NH3 (3) 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O (4) Định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4 chuẩn 0,1N qua đó dễ dàng tính được lượng nitơ có trong mẫu vật theo phương trình (5) (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O = (NH4)2SO4 + 3H3BO3 (5) Cách tiến hành Vô cơ hóa mẫu: Cân 100 mg mẫu khô vào bình Kjeldahl sao cho phẩm vật không dính lên thành cổ bình. Cho tiếp vào bình kenđan 10ml H2SO4 đậm đặc. Thêm hỗn hợp xúc tác K2SO4 : CuSO4 ( 3:1) có tác dụng làm tăng nhiệt độ sôi của H2SO4 và làm tăng cường vận tốc của phản ứng. Sau khi đã thêm các chất xúc tác, đặt bình vào bộ vô cơ hóa mẫu. Đun cho đến khi dung dịch hoàn toàn mất màu. Trong quá trình đun, thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo sao cho không còn một vết đen nào của mẫu vật thí nghiệm chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình. Đun cho đến khi dung dịch trong bình hoàn toàn trắng. Cất mẫu: Sau khi vô cơ hóa mẫu xong thêm khoảng 150ml nước cất vào bình vô cơ hóa mẫu thêm 2-3 giọt chỉ thị phenolphtalein, tiếp theo thêm khoảng 40 ml NaOH 30-40% dung dịch chuyển sang màu hồng là được. lắp nhanh vào bộ cất thu NH3, ở bình hứng đã có sẵn 20 ml H3BO3 và vài giọt chỉ thị taxiro( chú ý đầu nối cong phải ngập trong dịch). Sau khi cất khoảng 30 phút nhấc bình hứng và kiểm tra lượng NH3 đã hết chưa bằng giấy quỳ, nếu đã hết ta mang mẫu đi định phân lượng tetraborat amon tạo thành bằng dung dịch H2SO4 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt, ghi lại thể tích H2SO4 0,1N đã chuẩn độ - a . Tính toán kết quả X = a.1,4.100/m Trong đó X: hàm lượng nitơ tổng số tính bằng % a: số ml H2SO4 0,1N dùng định phân 1,4- số mg Nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N 100 hệ số chuyển sang % m-lượng mẫu cân tính bằng mg. c. Phân tích hàm ẩm của mẫu Cơ sở của phương pháp: Dùng nhiệt để loại bỏ nước ra khỏi mẫu, hiệu số khối lượng cuả mẫu trước và sau khi sấy khô là lượng ẩm có trong mẫu. Cách tiến hành: Sử dụng máy xác định hàm ẩm Startorius (Đức). Cân 1 g mẫu để vào trong khay giấy bạc, nhấn nút khởi động thiết bị. Lúc này thiết bị sẽ ự động gia nhiệt để đuổi nước ra khỏ mẫu. Đọc kết quả khi quá trình kết thúc. Phân tích lipit theo phương pháp chiết bằng máy soxhlet [9] Cơ sở của phương pháp: Chiết chất béo từ nguyên liệu sấy khô bằng dung môi hữu cơ. Chất béo được chiết tách khỏi dung môi và đem cân: - Các dung môi để chiết chất béo là ete etylic, ete petrol...thường có trọng lượng riêng nhỏ, nhiệt độ sôi thấp cho phép chiết nhanh chóng chất béo - Tốc độ và mức độ chiết chất béo hoàn toàn phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu thí nghiệm và bản chất dung môi Cách tiến hành: Cân lấy vào ống giấy 10 g nguyên liệu đã xay nhỏ và sấy khô đến trọng lượng không. Chuyển vào trụ chiết. Thêm dung dịch chiết vào với thể tích gấp 1,5 đến 2 lần thể tích trụ chiết - a). Mở nước làm mát vào ống sinh hàn và bắt đầu chiết. Để cho ete sôi không quá mạnh, nhiệt độ khoảng 45-500C, tốc độ chiết sao cho số lần trút ete từ trụ chiết vào bình chiết khoảng 10-15 lần trong 1 giờ. Quá trình chiết kết thúc khi nhỏ một vài giọt ete từ đầu mút của trụ chiết lên kính, nếu sau khi ete bay hơi hết mà không còn để lại vết chất béo nào trên kính thì xem như chất béo đã được chiết hoàn toàn và quá trình chiết kết thúc. Khi chiết xong lấy bình cầu có chứa chất béo hòa tan ra khỏi thiết bị soxlet, lắp ống sinh hàn vào cất ete. Sấy bình đến trọng lượng không đổi rồi đem cân -b. Thường khi chiết bằng ete etylic thì sấy ở nhiệt độ 60-700C trong 30 phút, còn khi chiết bằng ete petrol sấy ở nhiệt độ 80-900C trong 45-50 phút. Tính kết quả: Hàm lượng chất béo tính theo công thức sau: X = (b-a).100/m(100-w) Với X - hàm lượng chất béo tính bằng % a- trọng lượng bình không, g b- trọng lượng bình và chất béo, g m- trọng lượng mẫu nguyên liệu thí nghiệm, g w-độ ẩm của mẫu nguyên liệu, % Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định thành phần nguyên liệu cá Cá sử dụng cho thí nghiệm là cá cơm, được sử dụng làm nguyên liệu sản xuất chính cho nước mắm tại Công ty Cổ phần thủy sản Nghệ An. Cá sau khi thu mua, bảo quản lạnh trong hộp xốp kín, chuyển tới phòng thí nghiệm Viện Công nghiệp thực phẩm. Trước khi thí nghiệm, cá được rửa sạch, để ráo nước, xay nhỏ, trộn đều, được đưa đi phân tích để xác định các chỉ tiêu như: hàm ẩm, hàm lượng protein tổng, hàm lượng lipid. Kết quả phân tích được thể hiện trên bảng 3.1 Bảng 3.1: Thành phần cơ bản của nguyên liệu cá Chỉ tiêu Hàm lượng Phương pháp phân tích Hàm ẩm (%) 72,81 TCVN 5613-91 Hàm lượng protein tổng (%) 20,1 TCVN 3705-90 Hàm lượng lipit (%) 1,91 Phương pháp soxhlet So sánh kết quả phân tích nguyên liệu với các công bố về chất lượng nguyên liệu cho sản xuất nước mắm cho thấy, loại cá cơm thí nghiệm có hàm lượng protein và lipid tương đối phù hợp cho sản xuất nước mắm loại phổ thông. Với mục đích phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh hương để ứng dụng cho quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày có sử dụng enzyme protease, do vậy nguyên liệu cá sử dụng cho thí nghiệm được xử lý như sau: - Mẫu đối chứng: thuỷ phân nguyên liệu cá bằng enzyme sau đó tàng trữ lên men: Cá xay nhỏ, trộn enzyme Flavourzyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 500C trong 2 ngày, sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%. Sau quá trình thuỷ phân, nguyên liệu được tàng trữ cho quá trình lên men, rút dịch tạo sản phẩm nước mắm ngắn ngày không bổ sung vi sinh vật gây hương. -Mẫu thí nghiệm - Mẫu thuỷ phân nguyên liệu cá bằng enzyme sau đó bổ sung chế phẩm vi sinh vật gây hương trong quá trình tàng trữ lên men: điều kiện thủy phân cá tương tự mẫu đối chứng. Sau quá trình thuỷ phân, bổ sung chế phẩm vi sinh vật và tàng trữ cho quá trình lên men rút dịch tạo sản phẩm nước mắm ngắn ngày có bổ sung vi sinh vật gây hương. 3.2. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật. Việc bổ sung vi khuẩn có khả năng phân giải protein đồng thời tạo hương sản phẩm là rất cần thiết đối với quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày nhằm tăng thêm hương vị cho sản phẩm tương tự với sản phẩm nước mắm lên men theo phương pháp truyền thống. Các vi sinh vật tạo hương đồng thời có khả năng sinh tổng hợp enzyme proteaza sẽ làm tăng thêm hiệu suất thuỷ phân đạm trong khối chượp trong quá trình lên men, nâng cao chất lượng cho sản phẩm. 3.2.1. Phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh proteaza trong môi trường có nồng độ muối cao. Từ 15 mẫu chượp ở các giai đoạn khác nhau được thu thập tại các cơ sở sản xuất đã được phân lập, kiểm tra, làm sạch chọn ra được 120 chủng vi khuẩn. Từ 120 chủng này, chúng tôi sơ tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein mạnh trên môi trường có nồng độ muối cao, bằng cách cấy vi khuẩn cần kiểm tra vào hộp lồng với môi trường sơ tuyển (môi trường phân lập có nồng độ muối 10% được bổ sung 0.5% sữa tách béo). Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp (48 – 72h), các khuẩn lạc có khả năng tạo vòng thủy phân protein được đánh giá mức độ thủy phân. Kết quả sơ tuyển được trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2: Khả năng sinh enzyme proteaza của 120 chủng vi sinh vật phân lập tính theo số chủng và đơn vị % Hoạt tính enzyme Proteaza Số chủng Tỉ lệ phần trăm (%) Mạnh 10 8 Trung bình 22 18 Yếu 17 14 Không có 91 76 Ghi chú: + Không có hoạt tính enzyme khi vòng phân giải (D – d, mm) ≤ 1mm + Hoạt tính enzyme yếu khi vòng phân giải (1mm < (D – d, mm) ≤ 10mm + Hoạt tính enzyme mạnh khi vòng phân giải (10mm < (D – d, mm) Kết quả bảng 3.2 cho thấy: Trong 120 chủng vi sinh vật được phân lập có hoạt tính proteaza ở mức độ phân giải khác nhau, có rất nhiều chủng không có hoạt tính proteaza ở môi trường có nồng độ muối cao. Chúng tôi tuyển chọn 10 chủng có khả năng phân giải proteaza mạnh để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh hương, sinh proteaza, chịu mặn cho sản xuất nước mắm ngắn ngày. Cá xay nhỏ, trộn enzyme Flavouyme 0,3%, Alacalse 0,5%, muối 10% cho vào bình gói kín để ở nhiệt độ thường 4 ngày, đưa vào điều kiện tối ưu 500C trong 2 ngày, bổ sung vi sinh vật đã tuyển chọn 105 CFU/g , sau 3 ngày thì bổ sung muối một lần, mỗi lần 3% cho đến khi tổng khối lượng muối đủ 25%. Thí nghiệm gồm 11 mẫu kí hiệu Mẫu 0 (mẫu đối chứng), Mẫu 1, Mẫu 2, Mẫu 3, Mẫu 4, Mẫu 5, Mẫu 6, Mẫu 7, Mẫu 8, Mẫu 9, Mẫu 10. Các mẫu nước mắm có bổ sung vi khuẩn lần lượt là L14, L15, L18, L22, B9, B13, B16, B26, B28, B36. Chượp chín, tiến hành đánh giá cảm quan mùi nước mắm. Hội đồng cảm quan gồm 6 cảm quan viên, ngửi và cho điểm theo bảng điểm đánh giá cảm quan về mùi nước mắm. Kết quả đánh giá cảm quan được thể hiện trên bảng 3.3 Bảng 3.3. Kết quả cảm quan mùi nước mắm khi bổ sung vi sinh vật Mẫu Mùi nước mắm (Giá trị trung bình) Mẫu 0 1,333a Mẫu 1 1,167a Mẫu 2 1,5a Mẫu 3 2,333b Mẫu 4 2,167b Mẫu 5 2,167b Mẫu 6 1,5a Mẫu 7 1,333a Mẫu 8 1,333a Mẫu 9 2,167b Mẫu 10 1,333a F=5,19 P= 0,0000 Các số liệu trong bảng sự khác biệt thống kê chỉ có ý nghĩa theo cột. Các trị số có chữ đi kèm giống nhau khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5%. Qua kết quả thống kê bảng 3.3 ta thấy, các chủng vi sinh vật tuyển chọn có khả năng tạo hương rất khác nhau khi phát triển trên môi trường chượp cá thủy phân bằng enzyme thương phẩm. Các mẫu được bổ sung các chủng L18, L22, B9, B28 và các chủng còn lại có sự khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê. Từ các kết quả thu được, chúng tôi tiến hành chọn 4 chủng vi sinh