Luận văn Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza và một số đặc tính của enzim

ố axit amin (methionin, lysine, histidine) but also consume large amounts of energy [12; 13]. lysin, histidin), sản sinh một số chất độc, nên khó sử dụng sản phẩm phân huỷ theo cách này để làm thức ăn cho chăn nuôi hay tận dụng nguồn protein cho các mục đích khác. Bên cạnh đó, phân huỷ lông vũ theo phương pháp này còn tiêu thụ một lượng lớn năng lượng. Nhiều nơi, keratin thô bị xử lý bằng cách đốt. Phương pháp này tạo ra một số khí gây ô nhiễm môi trường đồng thời lãng phí nguồn protein từ keratin. 1.4.2. Phương pháp sinh học Thuỷ phân lông vũ nhờ các vi sinh vật có hoạt tính keratinaza là một phương pháp thay thế được lựa chọn đem lại hiệu quả cao, khắc phục được những hạn chế của các phương pháp lý hoá. Người ta đã tiến hành phân lập được các vi sinh vật bao gồm cả nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn với nhiều chủng có hoạt tính keratinaza cao được sử dụng trong việc phân huỷ lông vũ và sử dụng sản phẩm phân huỷ đó làm nguồn thức ăn bổ sung cho chăn nuôi. Chúng là loài chung của nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn như: Doratomyces microsporus, Aspergillus sp, Alternaria radicina, Trichurus spiralis, Stachybotrys atra, Onygena sp, Absidia sp, Rhizomucor sp , Streptomyces pactum, S. albs, S. thermoviolaceus, S. fradiae , S.thermonitrificans , Flavobacterium pennavorans, Bacillus sp , Stenotrophomonas sp , Bacillus licheniformis và B. pumilus và Vibrio sp. Phân huỷ lông vũ trong quá trình lên men của các nhóm vi khuẩn ưa nhiệt như Bacillus, Streptomyces, Vibrio, Chryseobacterium đã được ứng dụng rộng rãi hơn cả. Những vi sinh vật này tiết keratinaza ngoại bào khi môi trường có keratin - phân huỷ keratin thành các axit amin hoặc các peptit ngắn, những chất này được vi sinh vật sử dụng làm nguồn cacbon và nitơ. 1.5. ĐẶC ĐIỂM CỦA KERATINAZA Keratinaza là enzim thuỷ phân protein ngoại bào trong tự nhiên. Keratinaza có tên IUB là EC 3.4.99, có trọng lượng phân tử từ hàng chục đến vài trăm kDa. Keratinaza chủ yếu được xếp vào nhóm proteaza serin do có đến 97% cấu trúc giống với cấu trúc của proteaza serin và cũng bị ức chế bởi các chất ức chế proteaza serin (7, 40). Hầu hết các keratinaza đã phát hiện được cho đến nay là serin proteaza (5, 7, 12, 22), và một vài Metallo proteaza (6). Theo Brandelli, A. (2008), đặc điểm của keratinaza ở một số chủng vi sinh vật như sau: Vi sinh vật Nhóm Trọng lượng pH tạo ra enzim phân tử (kDa) tối thích B. licheniformis PWD-1 Serine 33 7.5 B. subtilis KS-1 Serine 25.4 7.5 B. pseudofimus FA 30-10 Serine 27.5 9-10 S. pactum DSM 40530 Serine 30 7-10 S. albidoflavus K1-02 Serine 18 6-9.5 F. pennavorans Serine 130 10 X. mantophilia POA-1 Serine 36 8.0 Vibrio sp. kr2 Serine 30 8.0 Chryseobacterium sp. kr6 Metallo 64 7.5 Microbacterium sp. kr10 Metallo 42 7.5 Kocuria rosea LPB-3 Serine 240 10 Hầu như tất cả các keratinaza là enzim cảm ứng và các vật liệu có chứa keratin khác nhau như lông, tóc và lông cừu có thể được sử dụng làm chất nền cho keratinaza sản xuất (17). Trong đó, lông là chất nền chủ yếu được sử dụng. Keratinaza ở vi sinh vật chỉ được tạo thành khi môi trường có mặt keratin. Các keratinaza của vi sinh vật có vai trò sinh học rất quan trọng đối với mục tiêu thuỷ phân các liên kết ngang disulfua bền vững của các hợp chất keratin. Nó chủ yếu tấn công vào các liên kết -S-S- của phân tử keratin. Cơ chế phân giải phức tạp của chúng liên quan đến sự hoạt động đồng thời của hệ thống phân giải sunfua và phân giải protein. Keratinaza hoạt động ở khoảng nhiệt độ và pH tương đối rộng nhưng tốt hơn điều kiện môi trường hơi kiềm và là loại enzim ưa nhiệt. Keratinaza là enzim ngoại bào do nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn sản sinh. Các enzim này có nhiều đặc trưng với chất nền vì có thể phân giải nhiều protein sợi như: fibrin, elastin, collagen và protein không có xơ như casein, albumin huyết thanh bò gelatin (7, 24, 25). 1.6. MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA KERATINAZA Hiện nay, keratinaza của vi sinh vật được quan tâm nhiều trong việc phân giải lông gia cầm làm thức ăn chăn nuôi và phân bón. Bên cạnh đó, chúng cũng được biết đến với ứng dụng làm sạch lông cừu, làm sạch lụa, trong ngành công nghiệp da, cạo lông tóc, các sản phẩm chăm sóc cá nhân,Hơn nữa, ứng dụng tiềm năng của chúng trong lĩnh vực phân giải prion sẽ rất có ý nghĩa. Thức ăn thuỷ phân Sản xuất thuốc Phân bón Chất tẩy rửa KERATINAZA Công nghiệp da Sản xuất khí Công nghiệp dệt sinh học may Thuỷ phân prion * Ứng dụng làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng lông thuỷ phân được cân bằng về một số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein chiếm tới 70% trong khẩu phần. Trong các nghiên cứu khác (Cater, 1998), bột lông thương mại được ủ qua đêm với Keratinaza để tạo ra một phần bột lông thuỷ phân. Khả năng tiêu hoá axit amin từ bột lông thuỷ phân ở gà trưởng thành là 82%, cao hơn so với bột lông thương mại, 60%. Thí nghiệm trên gà, bột lông thuỷ phân được coi  là có thể thay thế đậu nành ở mức 70% protein trong khẩu phần. Có thể kết luận rằng Keratinaza có thể thuỷ phân và biến đổi bột lông thành nguồn protein có thể tiêu hoá ở mức tối đa là 70% protein trong khẩu phần ăn. Gần đây hơn, sản phẩm Keratinaza được thử nghiệm như là một enzim cho ăn trực tiếp trong thức ăn của gà. Khi gà thiếu nhiều protein trong khẩu phần (80% nhu cầu) thì Keratinaza trong khẩu phần có thể cải thiện sinh trưởng của gà. Trong 3 tuần đầu tiên, tỷ lệ biến đổi thức ăn là 2,03 đối với khẩu phần được bổ sung Keratinase. Tỉ lệ biến đổi thức ăn đối với khầu phần đối chứng đủ protein là 1,83. Nhiều thí nghiệm đang được nghiên cứu để thiết lập giá trị dinh dưỡng của Keratinaza (23). * Ứng dụng trong điều trị bệnh bò điên Bệnh bò điên (BSE), Scrapie ở cừu và Creusfldt - Jakob (CJD) ở người là thành viên của nhóm bệnh thoái hoá thần kinh. Chúng gây nên bởi protein truyền nhiễm (PrPCS) (21). Chúng là bệnh gây tử vong và rất khó kiểm soát, bởi vì PrPSC có sức đề kháng với các quá trình vô trùng thông thường. Về hoá học, PrPSC là một protein ổn định, giàu cấu trúc B, có sức đề kháng với nhiệt và proteaza. Sự bùng nổ BSE , tiếp theo là bệnh CJD trên người ở Anh đã trở thành một làn sóng hoảng loạn trên thế giới. Một phương pháp phòng chống để kiểm soát bệnh này là một nhu cầu cấp bách để đàn gia súc của chúng ta và sức khỏe cộng đồng. Keratinaza phân huỷ lông và PrPSC có cấu trúc tương tự nhau, cả hai đều có cấu trúc protein B và có sức đề kháng với hầu hết proteaza. Một thí nghiệm gần đây đã được tiến hành ở ID-Lelystad, Hà Lan. Tế bào não BSE được xử lý và chẩn đoán bằng phương pháp chuẩn, ngoại trừ là các mô đồng nhất được nấu trước và được tiêu hoá bởi PWD-1 Keratinase. Rất là thú vị, PrPSC được coi là hoàn toàn tự phân huỷ hay tự thuỷ phân bởi enzyme . Khám phá đầu tiên này cho thấy có thể phát triển một quá trình enzim, sử dụng keratinaza từ chủng Bacillus subtilis PWD-1,  để khử các dụng cụ y tế truyền nhiễm và các sản phẩm gia súc. * Ứng dụng trong công nghệ thuộc da Công nghệ thuộc da gồm nhiều khâu: khâu chuẩn bị thuộc (làm sạch da và chuẩn bị điều kiện để thuộc); khâu thuộc (tạo cho da không bị phân hủy trong không khí); khâu hoàn thành (Tạo các tính chất sử dụng cho da). Mỗi khâu đều sử dụng nhiều hóa chất và đưa ra chất thải với lượng lớn . Sử dụng chế phẩm enzym là ví dụ điển hình của xu hướng công nghệ mới trên ngưỡng cửa thế kỷ 21, đó là sự kết hợp giữa các ngành hóa học và sinh học, mà kết quả là những sản phẩm được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Sử dụng chế phẩm enzyme thay thế hóa chất là hướng nghiên cứu quan trọng cho nhiều công đoạn thuộc da. Công nghệ tẩy lông thông thường sử dụng vôi và natri sulphua, đây là nguồn ô nhiễm lớn. Sử dụng keratinaza để tẩy lông trong thuộc da rút ngắn thời gian xử lý, giảm chi phí sản xuất, nâng cao chất lượng sản phẩm. Proteaza kiềm có trong chế phẩm đã thuỷ phân các protein không phải là colagen như albumin, glubulin và keratin mềm, không tác động lên colagen ở lớp cật. Với chế phẩm enzim có hoạt độ proteaza 3000 U/g (hoạt độ keratinaza 700 U/g), lượng enzim bổ sung với nồng độ 2% (khối lượng da), thời gian ngâm là 6 - 7 giờ, hiệu quả tẩy lông đạt 90 - 93% (1). * Ứng dụng trong công nghiệp dệt        Keratinza được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi nhân tạo được tạo ra bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi được bóng, dễ nhuộm. Keratinaza có tác dụng thủy phân lớp protein serin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. * Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất các chất tẩy rửa Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với tên BIO-40 được thu nhận từ Bacillus subtilis. Đến năm 1963, Novo Industry A/S đã giới thiệu alcalase dưới tên thương mại là BIOTEX được chiết xuất từ Bacillus licheniformis. Và đến gần đây, tất cả các proteaza bổ sung vào chất tẩy dùng trên thị trường đều là proteaza serine được sản xuất từ các chủng Bacillus , và chủ yếu là từ Bacillus subtilis (1). Trên thế giới, mỗi năm người ta đã sử dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tẩy rửa. Trong đó hai công ty lớn là Novo Nordisk và Genencor Internatinal mỗi năm đã cung cấp cho toàn cầu hơn 95% lượng enzim proteaza (17). Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ CÁC THIẾT BỊ 2.1.1. Vật liệu - Các mẫu đất chôn lông gà từ 1 đến 6 tháng thu thập từ các vị trí khác nhau tại các huyện Thanh Hà, Ninh Giang tỉnh Hải Dương; quận Hà Đông thành phố Hà Nội. Các mẫu đất này được sử dụng để phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza. Các mẫu đất được sử dụng trong nghiên cứu: Mẫu A: Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Thanh Hồng, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương. Mẫu B : Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại xã Hợp Đức, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương. Mẫu C: Đất ở nơi thải lông của cơ sở giết mổ gia cầm tư nhân, thị trấn Thanh Hà, huyện Thanh Hà, Hải Dương. Mẫu D: Đất vườn, đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại huyện Ninh Giang, tỉnh Hải Dương. Mẫu E: Đất đã được chôn lông gà trước đó để lông gà bị phân huỷ, tại quận Hà Đông, Hà Nội. - Lông gà, tóc,... 2.1.2. Hoá chất Các hoá chất được sử dụng nghiên cứu hầu hết là các hoá chất được nhập ngoại của các hãng Sigma, Merc, Aldrich, Các loại dung dịch đệm được sử dụng: - Các dung dịch đệm có pH 5,8 -9,2 ( đệm photphat borat ) pH Dung dịch KH2PO4 0.1M , ml Dung dịch borat 0.05M , ml 6.0 87.7 12.3 7.0 61 39 8.0 45 55 9.0 13.2 86.8 - Các dung dịch đệm có pH 7,8 -11,0 ( đệm borat ) pH Dung dịch borat 0,05 M , ml Dung dịch natri hiđroxit 0,1 N ,ml 10 59.5 40.5 11 50.1 49.8 - Đệm Tris - HCl. * Môi trường nuôi cấy - Môi trường Nutrient Agar (NA, g/l) để phân lập vi khuẩn: Cao thịt bò 3 Pepton 10 Agar 18 Nước cất 1000ml pH = 7 Khử trùng ở 1210C, 1 atm, 30 phút. - Môi trường LB (g/l) để giữ giống: Cao nấm men 5 Pepton 10 NaCl 5 Agar 18 pH 7 Khử trùng ở 1210C, 1 atm, 30 phút. - Môi trường thạch sữa (g/l): Pepton 5 Cao nấm men 3 Sữa không béo vô trùng 100 ml Agar 12 - Môi trường phân lập, tuyển chọn vi khuẩn có hoạt tính keratinaza (g/l): Lông sạch 8 MgSO4 0.1 KH2PO4 2 Glucozơ 2 Nước cất 1000ml pH 7.0 - Môi trường cơ bản kiểm tra hoạt tính enzim (g/l): K2HPO4 1.5 KH2PO4 0.7 MgSO4.7H2O 0.2 NaCl 0.5 FeCl3 0.2 Lông sạch 10 Nước cất 1000 ml pH 7 2.1.3. Thiết bị, máy móc - Cân kĩ thuật - Lò vi sóng - Tủ cấy vô trùng - Nồi khử trùng - Tủ nuôi ổn nhiệt - Máy lắc ổn nhiệt S150 (Bibby - Anh), SI - 300R (Trung Quốc) - Máy lắc GFL 3017 - Máy li tâm Eppendorf - Máy đo OD - Kính hiển vi quang học - Tủ lạnh Ngoài ra còn một số dụng cụ phòng thí nghiệm khác như: pipet của hãng Eppendof, bình nón, bình cầu, ống nghiệm, hộp lồng, cuvert, giấy lọc, giấy đo pH, lam kính, lamen, ... 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. Phân lập vi khuẩn có hoạt tính keratinaza từ đất Mẫu đất được pha loãng bằng nước cất vô trùng ở các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3,10-4, 10-5. Cấy trải trên môi trường NA, ủ ở 370C trong 24h. Các khuẩn lạc mọc lên được kiểm tra, phân loại theo hình thái; sau đó được cấy ria trên môi trường NA, tiếp tục ủ ở 370C trong 24h để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc. Sau khi đã được tinh sạch thì cấy truyền sang môi trường LB trong ống thạch nghiêng để giữ giống. Các chủng phân lập được kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách: - Pha chế môi trường phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza (xem phần các loại môi trường nuôi cấy). Chia đều vào các bình nón 150 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường. - Dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy lần lượt một ít vi khuẩn đã tinh sạch mỗi chủng hoà vào môi trường nuôi lắc trên. Chú ý: Khử trùng que cấy sau mỗi lần lấy ở từng chủng. - Nuôi lắc, 150 vòng / phút ở 370C trong 6 ngày. Chủng có hoạt tính keratinaza sẽ làm phân rã lông gà có thể quan sát được bằng mắt thường. 2.2.2. Nghiên cứu một số đặc điểm về hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào và khả năng sinh bào tử của các chủng sinh keratinaza. - Các chủng có hoạt tính keratinaza được kiểm tra hình dạng tế bào bằng cách nhuộm Gram: + Bước 1: Làm vết bôi: Nhỏ 1 giọt nước lên lam kính; dùng que cấy đã vô trùng trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội, lấy 1 ít vi khuẩn hoà vào giọt nước. + Bước 2: Làm khô vết bôi trong không khí. + Bước 3: Cố định vết bôi bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn: Đưa vết bôi nhanh qua ngọn đèn cồn 2 - 3 lần. + Bước 4: Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím tinh thể (crystal violet) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước. + Bước 5: Nhuộm bằng dung dịch iot (dung dịch lugol) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước. + Bước 6: Phủ lên bằng dung dịch etanol 95% : axeton (1 : 1) trong 1 phút rồi rửa lại bằng nước. + Bước 7: Nhuộm bằng thuốc nhuộm màu đỏ trong 30 - 60s, rửa qua nước, để khô. + Bước 8: Quan sát tiêu bản ở vật kính dầu. G+ không bị dung môi hữu cơ tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và iot, cồn còn làm cho các lỗ trong peptiđoglican co lại; do đó bắt màu tím. G- bị dung môi tẩy thuốc nhuộm đầu do lipit của lớp màng ngồi bị hoà tan làm tăng tính thấm của màng; do đó, sự rửa trôi phức chất tím tinh thể - iot và làm vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc nhuộm này (đỏ). - Kiểm tra khả năng sinh nội bào tử của các chủng bằng cách: + Đun dịch nuôi pha loãng của mỗi chủng ở 800C trong 15 phút sau đó lấy ra để nguội. + Cấy trải trên môi trường NA rồi đưa vào ủ trong tủ ấm 370C trong 24h. + Lấy ra quan sát khả năng tạo khuẩn lạc của mỗi chủng. Nếu có khả năng tạo khuẩn lạc chứng tỏ chủng nghiên cứu có khả năng sinh nội bào tử. - Quan sát hình thái khuẩn lạc: Lấy một ít sinh khối đã tinh sạch, pha loãng, cấy trải trên môi trường NA, đưa vào tủ ấm giữ ở 370C trong 24h rồi lấy ra quan sát. 2.2.3. So sánh khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn Các chủng sinh keratinaza được so sánh về khả năng sinh enzim bằng cách nuôi lắc trong môi trường cơ bản chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Các bước thực hiện như sau: Bước 1: Chế tạo keratin thô từ lông gà. - Chọn những lông gà có kích thước tương đối đồng đều. - Ngâm 30 phút ở 370C trong clorofom - metanol (1:1) để loại mỡ. - Giữ trong nước xà phòng 12h ở 420C. - Rửa nước cất vài lần và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bước 2: Pha chế môi trường cơ bản kiểm tra hoạt tính enzim (xem phần các loại môi trường nuôi cấy). Chia đều vào các bình nón 150 ml, mỗi bình chứa 50 ml môi trường cơ bản. Bước 3: Dùng pipet hút dịch chứa vi khuẩn sinh keratinaza (50 µl) thu được từ bước kiểm tra hoạt tính ở trên cho vào mỗi bình nón tương ứng và đánh số thứ tự. Bước 4: Nuôi lắc, 150 vòng / phút trong 7 ngày. Bước 5: So sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phương pháp Saville (1958): - Lông còn sót lại trong môi trường nuôi cấy được thu lại bằng cách lọc qua giấy lọc, rửa sạch với nước cất và sấy khô ở 650C đến khối lượng không đổi. - Tỉ lệ phần trăm của lông bị phân huỷ được tính dựa trên khối lượng của lông còn lại chưa bị phân huỷ so với khối lượng lông ban đầu sử dụng đưa vào môi trường. So sánh tỉ lệ lông gà bị phân huỷ để xác định khả năng sinh keratinaza của các chủng vi khuẩn. Để kiểm tra lại, có thể dùng phương pháp đục giếng thạch, quy trình tiến hành như sau: Sau khi đổ môi trường thạch sữa gầy ra các đĩa Petri, dùng khoan thạch tạo các giếng thạch, đồng thời nhỏ 0,5 ml dịch nuôi vào các giếng thạch tương ứng. Cho vào tủ lạnh giữ ở 40C từ 6 đến 8 giờ, sau đó nhấc ra đặt vào tủ nuôi cấy tại nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Hoạt tính của keratinaza được xác định bằng đường kính vòng phân huỷ trong suốt xung quanh giếng thạch, tính bằng mm. 2.2.4. Xác định một số điều kiện tối ưu hoá môi trường nuôi cấy 2.2.4.1. Xác định ảnh hưởng của lượng lông đưa vào môi trường nuôi cấy Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C trong các môi trường có hàm lượng lông khác nhau, cụ thể là 5, 10, 15, 20, 25 g / l trong môi trường cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hưởng của nồng độ lông trên hoạt động sinh keratinaza (19). 2.2.4.2. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, nhiệt độ 300 C trong các môi trường có pH khác nhau, cụ thể là pH 6, 7, 8, 9, 10 trong môi trường cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu trên hoạt động sinh keratinaza của chủng. 2.2.4.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu Chủng có hoạt tính sinh keratinaza tốt nhất được nuôi lắc 6 ngày, 150 vòng / phút, pH = 8 trong các môi trường có nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 250C, 300C, 350C, 400C, 450C trong môi trường cơ bản, sau đó xác định tỉ lệ lông bị phân giải để điều tra những ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường nuôi cấy ban đầu trên hoạt động sinh keratinaza của chủng đó. 2.2.5. Xác định ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và một số ion kim loại đến hoạt tính keratinaza 2.2.5.1. Xác định hoạt tính keratinaza Trước hết, để thu dịch enzim, có thể tiến hành như sau (30): Các chủng có hoạt tính keratinaza được nuôi lắc ở 300 C, 160 vòng / phút trong môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất: Nuôi trong bình nón 500 ml có chứa 100 ml môi trường cơ bản với 10% lông gà. Sau 5 ngày, dịch lọc được li tâm 10 000 vòng / phút ở 40C trong 30 phút. Thu lấy dịch lọc (dịch enzim thô). Tủa bằng muối amoni sunphat các phân đoạn từ 0 - 80%. Kết tủa thu được sau khi bổ sung muối amoni sunphat và làm lạnh ở 40 C trong 1 giờ được thu lấy sau khi li tâm tiếp (10 000 vòng / phút ở 40C trong 30 phút). Hoà tan kết tủa vào một lượng tối thiểu đệm Tris - HCl (pH = 8), ta được dịch enzim có độ tinh khiết cao hơn được dùng để xác định hoạt tính keratinaza. Hoạt tính của keratinaza được xác định theo phương pháp của Cheng et al. (1995) sửa đổi (10) và được thực hiện lại trong một số nghiên cứu (18,19, 43) khác như sau : 2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nước. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ . Một đơn vị (U) hoạt động của keratinase được định nghĩa là hoạt tính làm tăng độ hấp thụ lên 0,01 trong 1h ở 370 C. 2.2.5.2. Xác định ảnh hưởng của pH Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở các pH lần lượt 6, 7, 8, 9, 10, 11 và 1 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nước. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ. 2.2.5.3. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ Dịch enzim của các chủng có hoạt tính keratinaza được tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzim bằng cách: Cho 2 ml đệm ở pH = 8 và 1,0 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở các nhiệt độ khác nhau, cụ thể là 300 C, 400 C, 500C và 600C trong một cốc nước. Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ. 2.2.5.4. Xác định ảnh hưởng của một số ion kim loại Hỗn hợp gồm: 2 ml đệm Tris / HCl (pH 7,5) và 1,0 ml dịch enzim được ủ với 10 mg bột lông trong lh ở 37° C, trong một cốc nước. Bổ sung vào hỗn hợp ở mỗi thí nghiệm từng loại ion: Na+, Ca2+, K+, Mg2+, Fe3+, Cu2+ ở các nồng độ 1 mM và 5 mM.  Phản ứng enzim được dừng lại bằng cách cho thêm 2,0 ml axit trichloroacetic 10% (TCA) và các mẫu được ly tâm trong 15 phút ở 10.000 vòng và 4° C. Đo OD ở 280 nm trên máy quang phổ. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SỰ PHÂN RÃ CỦA LÔNG GÀ KHI ĐƯỢC SỬ DỤNG LÀM NGUỒN CACBON VÀ NITƠ DUY NHẤT ĐỂ NUÔI CẤY VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Từ các mẫu đất nghiên cứu đã phân lập được 13 chủng vi khuẩn dựa trên sự khác nhau về hình thái khuẩn lạc (phụ lục 1). Các chủng sau khi được kiểm tra hoạt tính keratinaza bằng cách nuôi lắc trong môi trường phân lập, tuyển chọn giống vi khuẩn có hoạt tính keratinaza nói trên ở 370C, 150 vòng / phút trong 6 ngày, chủng có hoạt tính keratinaza đã làm phân rã lông gà có thể quan sát được bằng mắt thường. Trong nghiên cứu này đã phân lập được 6 chủng có hoạt tính keratinaza. Hình 3.1. Sự phân rã của lông gà sau khi nuôi lắc 6 ngày Những chủng này có thể sinh trưởng, phát triển trên môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất. Điều đó cho thấy 6 chủng này đều có khả năng tiết keratinaza ngoại bào để phân huỷ lông gà (mà thành phần chính của nó là keratin) làm nguồn cung cấp cacbon và nitơ cho chúng. 3.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA Sau khi nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi, hình dạng tế bào các chủng có hoạt tính keratinaza được mô tả như bảng 3.1: Bảng 3.1: Hình thái tế bào các chủng sinh keratinaza Chủng Hình thái tế bào Kr 1 Gram dương, tế bào hình que, tạo thành chuỗi. Kr2 Gram dương, tế bào hình que tương đối đồng đều, ở 2 đầu vuông, tạo thành chuỗi 2 - 4 tế bào. Kr3 Gram dương, tế bào xếp thành từng đôi hay từng chuỗi , số ít phân tán hoặc tập trung thành đám. Kr4 Gram dương, tế bào hình que ngắn, các tế bào dạng đơn hoặc xếp đôi, 2 đầu hơi tròn. Tế bào già tròn và hơi nhẵn hơn, đôi khi có hình thoi tù 2 đầu. Kr5 Gram dương, tế bào hình que ngắn, tạo thành chuỗi. Kr6 Gram dương, tế bào hình que ngắn, đơn lẻ hoặc xếp đôi, ít khi dạng chuỗi. Tiến hành đun dịch nuôi pha loãng của chúng ở 800C trong thời gian 15 phút, để nguội rồi cấy trải trên môi trường NA, ủ ở 370C trong 24h thấy đều mọc thành các khuẩn lạc; chứng tỏ đây là các chủng sinh nội bào tử. Sau khi cấy trải mỗi chủng đã tinh sạch trên môi trường NA và để trong tủ ấm (370C) 24 giờ, hình thái khuẩn lạc quan sát được như sau: Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc các chủng có hoạt tính keratinaza Chủng Đặc điểm khuẩn lạc Kr1 Màu trắng sữa, bề mặt nhăn nheo, xù xì Kr2 Tròn, to, ở giữa có núm lồi lên có màu trắng ngả vàng nhạt, hơi bóng, nhớt. Kr3 Tròn, bờ riềm không đều, có màu vàng nhạt chuyển dần sang xám, xù xì, khô, bề mặt khuẩn lạc hơi nhăn và có núm lồi ở giữa. Kr4 Khuẩn lạc hình tròn đều, hơi lượn sóng, nhẵn, thường có các vòng tròn đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa chuyển sang màu kem, có khi nâu nhạt có ánh mờ đục. Kr5 Khô, hình tròn, màu trắng, có vòng tròn màu trắng trên bề mặt, không nhăn. Kr6 Tròn, rất bóng và nhớt, ngả vàng Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc chủng Kr2 Từ các thí nghiệm trên có thể nhận định các chủng sinh keratinaza trên đều có một số đặc điểm giống với chi Bacillus. Để phân loại chính xác hơn cần phải tiến hành thêm một số thí nghiệm kiểm tra đặc tính sinh lý, sinh hoá của chúng. 3.3. XÁC ĐỊNH CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH KERATINAZA MẠNH NHẤT Từ 6 chủng vi khuẩn có hoạt tính keratinaza đã phân lập được, tiến hành mức độ hoạt động của enzim bằng 2 cách sau: - Nuôi lắc trong môi trường chỉ sử dụng lông gà làm nguồn cacbon và nitơ duy nhất, 150 vòng / phút ở 370C trong 10 ngày. Sau đó, so sánh tốc độ phân huỷ lông gà của các chủng sinh keratinaza theo phương pháp Saville (1958). Kết quả được trình bày ở bảng 3.3: Bảng 3.3: Hoạt tính keratinaza của 6 chủng sinh keratinaza Chủng Phần trăm lông gà bị phân huỷ Kr1 58,5 Kr2 70 Kr3 60,5 Kr4 55,5 Kr5 60 Kr6 50 - Đánh giá hoạt tính keratinaza của các chủng bằng cách: Đục giếng thạch có đường kính 10 mm trên các đĩa thạch có cơ chất là sữa gầy; nhỏ 0,15 ml dịch enzim thô vào các giếng thạch; giữ ở 40C trong tủ lạnh 12h rồi mang ra ngoài khoảng 15 phút sau đó đưa vào tủ ấm 370C ủ trong 24h. Hoạt tính của keratinaza được xác định bằng đường kính vòng phân huỷ trong suốt xung qua