Luận văn Phân tích proteomic mô gan của người bị ung thư gan nguyên phát

Hơn 70 năm trước, Warburg [44] đã mở đường cho việc nghiên cứu những biến đổi trong vai trò hô hấp nội bào của ty thể đối với ung thư và đã đề xuất ra một cơ chế để giải thích quá trình phát sinh ung thư. Trong một loạt các bài báo, ông đã đưa ra giả thiết rằng sự kiện chìa khóa trong việc phát sinh ung thư là sự phát triển của một “tổn thương” trong bộ máy hô hấp nội bào, dẫn đến sự tăng sinh bù lượng ATP glycolytic. Cuối cùng, các tế bào ác tính sẽ đáp ứng nhu cầu năng lượng của mình bằng cách sản xuất một phần lớn ATP của mình thông qua cơ chế glycolytic hơn là thông qua phosphoryl hóa oxy hóa. Do sự sản sinh ATP glycolytic kém hiệu quả, điều này phần nào phản ánh cơ chế trao đổi chất duy nhất của các tế bào ác tính và điều đó sẽ yêu cầu tiêu thụ một lượng lớn glucose để đáp ứng nhu cầu năng lượng của tế bào. Điều này xảy ra trái ngược ở nhiều tế bào bình thường, các tế bào sử dụng phosphoryl hóa oxy hóa như là cách chủ yếu để tổng hợp ATP với hiệu suất cao. Sự khác biệt trong chuyển hóa năng lượng giữa các tế bào ung thư và các tế bào bình thường tạo thành một cơ sở hóa sinh để suy đoán rằng các hướng điều trị có thể được phát triển để chọn lọc tiêu diệt các tế bào ung thư trong trạng thái tổn thương hô hấp tế bào. Kể từ khi ấn phẩm phẩm đầu tiên của Warburg được xuất bản hơn nửa thế kỷ trước, một số bệnh ung thư liên quan đến khuyết tật ti thể đã được xác định và được mô tả trong các tài liệu. Những khiếm khuyết bao gồm thay đổi biểu hiện và hoạt động của các tiểu đơn vị chuỗi hô hấp và các enzym glycolytic, giảm quá trình oxy hóa các chất NADH được liên kết, cũng như đột biến ADN ti thể (mtDNA). Trong khi có nhiều báo cáo về các hiện tượng, các cơ chế chịu trách nhiệm về việc bắt đầu và tiến triển của đột biến mtDNA, vai trò của nó trong sự phát triển của bệnh ung thư, và tiến triển bệnh vẫn còn chưa được làm sáng tỏ [20]. Hơn 300 triệu người đang bị nhiễm mạn tính với virus viêm gan B, và nhiều người trong số này có khả năng phát triển thành ung thư gan. HBV mang 7 protein virus, trong đó có protein không có cấu trúc X (nonstructural X) (HBx). Các kết quả nghiên cứu với các tế bào bất tử hay các tế bào chuyển gen và với HBx của chuột biến đổi gen đã chứng minh rằng HBx có thể tương tác với các ty thể. Tuy nhiên, không có những nghiên cứu mô tả chính xác vị trí HBx trên ty thể hay ảnh hưởng của nó đến các trạng thái sinh lý của ty thể. Clippingen và cộng sự [6] đã tiến hành nuôi cấy tế bào gan chuột mô hình đặc trưng để mô tả trí của HBx ti thể và ảnh hưởng của nó về mặt sinh lý học. Kết quả, đã cho thấy sự định vị của HBx với mật độ cao và liên kết với màng ngoài ty thể. Họ đã chứng minh rằng HBx có khả năng điều hòa màng ti thể trong các tế bào gan và chức năng này của HBx thay đổi tùy theo tình trạng hoạt động của NF-αB. Trong các tế bào gan chuột sơ cấp, sự hoạt hóa HBx của NF-αB ngăn cản sự khử cực màng ti thể, tuy nhiên, khi hoạt động của NF-αB bị ức chế, HBx gây sự khử cực màng thông qua sự điều khiển tính thấm lỗ ti thể. Tóm lại, các kết quả này xác định con đường tiềm năng mà qua đó có thể kích hoạt HBx để điều chỉnh quá trình sinh lý của ti thể, do đó làm thay đổi nhiều hoạt động tế bào và cuối cùng góp phần vào sự phát triển các nghiên cứu ung thư gan liên quan đến HBV. Nghiên cứu hệ protein microsome Microsome là những túi tiết được hình thành từ mạng lưới nội chất khi các tế bào eukaryote bị phá vỡ. Ở điều kiện bình thường microsome không tồn tại trong các tế bào sống. Microsome có thể được tách và thu lấy từ những mảnh vỡ tế bào bằng cách ly tâm. Các tế bào không vỡ, nhân, và ty thể sẽ bị lắng xuống ở khoảng 11.000g, trong khi các enzyme hòa tan và lưới nội chất chứa cytochrome P450 vẫn còn trong dung dịch. Khi sử dụng máy siêu ly tâm tốc độ lên tới 100.000g các microsome bị lắng xuống thành cặn còn các enzyme hòa tan thì vẫn nổi trên mặt. Bằng cách này microsome được tách ra. Microsome thu được có màu nâu đỏ do sự có mặt của các cofactor có chứa sắt, nhân heme trong enzyme P450 có rất nhiều trong gan của người và động vật. Microsome là một công cụ có giá trị lớn trong việc điều tra sự trao đổi chất của các hợp chất và kiểm tra các tương tác thuốc. Các nhà nghiên cứu thường chọn microsome dựa trên mức độ hoạt động đặc trưng của các enzyme CYP. Năm 2008 Nakamura và cộng sự [22] đã tiến hành nghiên cứu proteomic microsome trên mô gan chuột thí nghiệm được thực hiện bằng sự kết hợp các kỹ thuật điện di biến tính 1 chiều và sắc ký lỏng nano kết hợp với khối phổ (nano-LC-MS/MS) để nghiên cứu hệ protein màng. Hơn 100 protein đã được nhận dạng bằng phân tích khối phổ, và hầu hết các protein trong đó đã được chỉ ra là có liên quan với các protein màng như microsomal glutathione S- transferase 1, cytochrome P-450 và một số ít các protein liên quan đến thụ thể lipoprotein. Trong microsome thì hệ cytochrome P450 (CYP) là hệ protein được quan tâm nhất. Hệ protein này tham gia vào sự khử độc và đáp ứng thuốc trong tế bào. Do đó, việc nghiên cứu hệ protein microsome giúp chúng ta tiến gần đến việc dự đoán và điều trị thuốc cho các vấn đề bệnh lý. Năm 2006, Aderson và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích proteomics so sánh đáp ứng của CYP trong mô gan chuột xử lý vơi 1,4-bis-2- (3,5-dichloropyridyloxybenzene) (TCPOBOP) và mô đối chứng nhằm dự đoán đáp ứng của thuốc. Trong nghiên cứu này, họ đã tiến hành phân tích so sánh proteomics P450 của gan chuột dưới tác động của TCPOBOP. Phương pháp nghiên cứu gồm thu microsome bằng ly tâm, phân tách các protein microsome bằng phương pháp điện di, phân cắt protein bằng enzyme trypsin, và đánh dấu đồng vị 18O/16O, sau đó nhận dạng các peptide bằng kỹ thuật khối phổ nano-LC-MS/MS và LC-MS. 17 protein trong họ P450 đã được xác định. Tất cả các P450 phát hiện ra được nhận dạng một cách rõ ràng ngoại trừ CYP2A4/2A5. Trong đó CYP1A2, -2A4 /5, -2B10, -2B20, -2C29, -2C37, -2C38, -3A11, và -39A1 có biểu hiện tăng và CYP2C40, -2E1, -3A41, và -27A1 có biểu hiện giảm so với đối chứng. Sự biểu hiện khác biệt của các protein này cho ta thấy CYP đã có những đáp ứng với thuốc và việc nghiên cứu hệ protein microsome có thể giúp ta nghiên cứu những đáp ứng với độc chất trong tế bào [5]. Việc phân tích hệ protein microsome trong những biến đổi của bệnh ung thư gan vẫn chưa được tiến hành nhiều. Tuy nhiên, với vai trò của nó trong việc đáp ứng với những thay đổi trong tế bào thì việc nghiên cứu hệ protein microsome hứa hẹn sẽ đem lại những kết quả tốt cho việc tìm các chỉ thị cho bệnh và tiến đến chẩn đoán phát hiện sớm ung thư đặc biệt là với ung thư gan. Nghiên cứu proteomics ở Việt Nam Ở Việt Nam, từ năm 2002 đến nay, nhà nước đã đầu tư kinh phí để xây dựng các Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia với các thiết bị nghiên cứu proteomic tiên tiến được trang bị. Cho đến nay, có 3 Phòng thí nghiệm như thế đã được đưa vào triển khai hoạt động tại Viện Công nghệ Sinh học (năm 2002), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội (năm 2004) và Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học thuộc Học Viện Quân Y (năm 2006). Tại các Phòng thí nghiệm này, các nghiên cứu proteomic đã được triển khai và đã bước đầu đạt được những kết quả nhất định. Bằng cách sử dụng sắc ký lỏng Nano đa chiều và hệ khối phổ liên tục, Vũ Minh Thiết và cộng sự [4] đã xác định được hơn 900 trình tự protein có trong mẫu huyết thanh người như các tác nhân đông máu, bổ thể, các protein gắn kết, vận chuyển, các loại enzym, các loại protease và chất ức chế protease, các loại cytokine, các protein thụ thể v.v. Tiếp cận theo hướng phân tích proteomic, Trịnh Hồng Thái và cộng sự (2005) đã áp dụng kỹ thuật điện di hai chiều kết hợp với khối phổ để phân tích proteomic huyết tương người bị bệnh leukemia cấp dòng tủy [42]. Bằng việc so sánh các bản gel điện di hai chiều, nhóm nghiên cứu đã nhận ra 12 protein biểu hiện khác nhau trong đó có một số là chất chỉ thị ung thư. Trong số các protein này có enzym ADN topoisomerase được biểu hiện tăng lên ở người bị leukemia cấp dòng tủy, enzym này đã được chứng minh có liên quan tới sự chuyển vị NST 8;21 trong bệnh này. Tiếp theo nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã phân tách được trung bình 600 spot protein trên các bản gel điện di huyết tương các thể bệnh leukemia cấp dòng tủy. Phân tích so sánh đã chỉ ra được 2 protein chỉ xuất hiện ở người bình thường mà không có ở các bản gel bệnh, 4 spot protein chỉ có mặt trên các bản gel bệnh mà không tìm thấy trên mẫu đối chứng [17]. Để mở rộng đối tượng nghiên cứu trên các thể bệnh leukemia, nhóm nghiên cứu này đã có một số nghiên cứu như năm 2006 Trịnh Thị Thanh Hương và Trịnh Hồng Thái [17]đã công bố kết quả phân tích proteomic huyết tương người bệnh leukemia cấp dòng lympho. Trong kết quả này, sự khác biệt trong biểu hiện protein giữa mẫu đối chứng và các thể bệnh cũng được phát hiện. Trong báo cáo gửi hội nghị proteomics năm 2008, Nguyễn Minh Đức và Trịnh Hồng Thái đã đưa ra kết quả “phân tích proteomic tế bào máu tủy của bệnh nhân leukemia”. Nghiên cứu này đã nhận ra được 44 protein biểu hiện khác biệt giữa bệnh nhân và người bình thường. Đặc biệt, trong nghiên cứu này chú ý đến 2 protein Cdk 6 và BAX có thể có giá trị cao trong việc nghiên cứu chỉ thị bệnh [12]. Ngoài ra cũng tại hội nghị proteomics năm 2009, Ngô Thị Mai, Hoàng Thị Thùy Dung và Trịnh Hồng Thái [28] cũng đã công bố kết quả nghiên cứu “phân tích proteomic gan của gia cầm ở vùng bị rải chất độc hóa học dioxin (Mã Đà, Đồng Nai)”. Với việc phát hiện nhiều protein có biểu hiện bất thường đã được chứng minh là có liên quan đến đáp ứng của sự phơi nhiễm TCDD, sự biểu hiện tăng của các protein hệ thống miễn dịch trong cơ thể một số động vật nghiên cứu đã góp phần chứng minh rằng tại vùng Mã Đà, Đồng Nai đã có những nhân tố trong môi trường ảnh hưởng không tốt đến hệ protein sinh vât. Ung thư gan là một căn bệnh hiểm nghèo phổ biến ở nước ta. Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu proteomics ung thư, đặc biệt là ung thư gan, tuy nhiên, ở Việt Nam hiện rất ít nghiên cứu ứng dụng phương pháp phân tích proteomics mô gan ở bệnh nhân ung thư gan. Do vậy, trong đề tài này chúng tôi đã sử dụng phương pháp proteomics để bước đầu phân tích hệ protein mô gan ung thư, so sánh với mô gan bình thường trên cùng một bệnh nhân nhằm tìm ra những protein biểu hiện khác biệt trên hai loại mô này. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là mô gan tại vị trí khối u của bệnh nhân ung thư tế bào gan. Mẫu đối chứng là mô gan lành cách 5cm trên lá gan đó tại vị trí không có khối u. Mô gan sử dụng trong nghiên cứu này do Khoa giải phẫu bệnh, Bệnh viện Việt Đức cung cấp. Mẫu mô được cho vào ống eppendorf vận chuyển về trong nitơ lỏng và bảo quản ở tủ lạnh sâu -80OC. 2.1.2. Hóa chất Bảng 1. Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu Tên hóa chất Nhà cung cấp IPG strip pH 4-7, 17cm GE Health Care và Biorad – Mỹ Ampholytes pH 4-7 GE Health Care – Mỹ Các peptide chuẩn (Insulin B, Angiotensin II, chất nền CHCA) Sigma Aldrich – Mỹ Enzyme trypsin Sigma Aldrich – Mỹ CHAPS, DTT, IAA, Ure, Thioure Biorad – Mỹ SDS, Acrylamide Pharmacia Tất cả các hóa chất khác được sử dụng đều có độ sạch phân tích, một số hóa chất dùng cho phân tích gel điện di hai chiều, khối phổ đạt độ sạch phân tích khối phổ. 2.1.3. Thiết bị Thiết bị điện di đẳng điện Protean IEF cell (Biorad – Mỹ). Máy ly tâm lạnh 5417R Eppendorf Hệ thống phân tích hình ảnh với phần mềm chuyên dụng phân tích bản gel điện di hai chiều Phoretix (Shimadzu Nhật Bản). Hệ thống phân tích khối phổ AXIMA-CRFPLUS(KRATOS ANALYTICAL-Anh). Ngoài ra, các dụng cụ và trang thiết bị khác của Phòng Proteomics và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein cũng được sử dụng trong nghiên cứu này. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Xử lý mẫu mô gan Mẫu mô gan bình thường và bệnh được lấy ra từ tủ -800C, cân 2 mẫu với lượng tương đương cho vào hai cối sứ riêng biệt gồm một mẫu bệnh và một mẫu đối chứng. 0,3g mẫu gan được cắt nhỏ bằng kéo, sau đó được nghiền bằng chày sứ cho đến khi nhuyễn thì cho 1,5ml đệm phosphate 0,05M, pH7,4. Lấy xilanh có đầu kim với đường kính 0.5mm hút dịch lên xuống trong khoảng 5 phút cho đến khi thấy dịch đồng nhất. Dịch này được ly tâm 1000g trong 10 phút ở 40C thu dịch nổi. Dịch nổi được đem ly tâm 14.000g trong 15 phút ở 40C thu lấy cặn. Cặn này chứa chủ yếu là các bào quan ty thể. Sau đó cặn này được hòa tan bằng 150µl đệm Rehydration có chứa 7M Ure, 2M Thioure, 30mM Tris, 4% CHAPS, và 65mM DTT. Phần dịch nổi còn lại được đem đi siêu ly tâm 105.000g trong 70 phút ở 4oC thu lấy phần cặn. Trong cặn này chứa phần lớn là microsome, cặn này cũng được hòa tan bằng 150µl đệm Rehydration có chứa 7M Ure, 2M Thioure, 30mM Tris, 4% CHAPS, và 65Mm DTT. Cả hai mẫu trên sau khi hòa tan trong đệm được điện di biến tính một chiều để kiểm tra protein trước khi tiến hành điện di hai chiều. 2.2.2. Điện di hai chiều Để đảm bảo tính đồng nhất về lượng protein giữa các mẫu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford trước khi chạy điện di hai chiều. Điện di hai chiều được bắt đầu bằng việc làm trương thanh strip bằng đệm Rehydration có chứa protein, dung dịch sẽ ngấm vào thanh strip. Lượng protein tối đa mà sợi gel IPG strip pH 4-7 dài 17cm có thể thấm được là 405µg. Sau 1 giờ thanh strip được đưa vào thiết bị chạy điện di đẳng điện. Điện di đẳng điện được thực hiện trên hệ thống Protean IEF cell (Biorad-Mỹ). Quá trình chạy điện di đẳng điện diễn ra theo 4 bước theo bảng sau. Bảng 2. Các bước chạy điện di đẳng điện Hiệu điện thế (V) Thời gian(t) V.t(V-hours) Chế độ tăng U Bước 1 Rehydration 12giờ ...... ...... Bước 2 250 20 phút ...... Tuyến tính Bước 3 8000 2.5 giờ ...... Tuyến tính Bước 4 10000 ..... 40.000 Nhanh Kết thúc điện di đẳng điện, các thanh strip được ngâm trong đệm cân bằng I (50 mM Tris HCl, pH8,8, 6 M Ure, 30% glycerol, 2% SDS, 0,1% DTT) ở nhiệt độ phòng và đệm cân bằng II (50mM Tris HCl pH8.8, 6 M Ure, 30% glycerol, 2% SDS, 0,25% IAA) thực hiện trong bóng tối cũng ở nhiệt độ phòng. Mỗi bước cân bằng được thực hiện hai lần, mỗi lần 8 phút. Điện di chiều hai được tiến hành trên gel polyacrylamide 10% có SDS (SDS-PAGE). Kết thúc điện di chiều hai, các protein được cố định 45 phút trong dung dịch chứa 1,3% acid phosphoric, 20% methanol, sau đó nhuộm bằng Coomassie G-250 qua đêm theo phương pháp nhuộm Colloidal Coomassie Brilliant Blue của Neuhoff (1988). Phương pháp nhuộm này đạt độ nhạy cao, có thể hiện lên các spot chỉ chứa 30ng protein. 2.2.3. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều Đầu tiên bản gel điện di hai chiều được quét vào máy tính có phần mềm phân tích chuyên dụng Phoretix (Shimadzu, Nhật Bản ). Sau đó hình ảnh bản gel được phân tích bằng phần mềm này. Trước tiên, phần mềm sẽ xác định tất cả các spot protein có trên mỗi bản gel và đánh số thứ tự cho các spot. Dựa vào cường độ khối trung bình của mỗi spot trên bản gel (được tính bằng thể tích của spot đó chia cho tổng thể tích các spot trên toàn bản gel nhân với 100), vị trí và thể tích của spot được xác định và có thể chỉ ra điểm khác biệt giữa bản gel mẫu bệnh so với bản gel mẫu đối chứng. Sau khi phân tích bằng hình ảnh, chúng tôi có thể chỉ ra các spot xuất hiện trên bản gel này mà không xuất hiện trên bản gel kia hay các spot biểu hiện tăng, giảm khác nhau giữa hai bản gel. Dựa vào kết quả này, chúng tôi xác định được các spot protein cần để phân tích tiếp theo. 2.2.4. Cắt và thủy phân spot Các spot protein được quan tâm trên bản gel điện di hai chiều được cắt ra khỏi bản gel, tẩy màu và thủy phân thành các peptide để chuẩn bị cho phân tích khối phổ gồm các bước cụ thể như sau: Cắt spot ra khỏi bản gel Rửa bằng nước siêu sạch đã khử trùng Tẩy màu spot bằng dung dịch chứa 50mM ammonium bicarbonate (ABC), 50% acetonitrile (AcCN). Làm khô spot bằng 100% AcCN. Cho enzyme trypsin vào các spot và ủ ở 370C trong 4 giờ để cắt các phân tử protein thành các peptide và chúng có thể chui ra khỏi gel. Các peptide trong dịch thủy phân sẽ được hấp phụ bằng Ziptip theo quy trình: Làm ướt Ziptip bằng dung dịch có TFA 0.1% trong acetonitrile. Cân bằng Ziptip bằng dung dịch chứa 0.1 % TFA Hấp phụ peptide trong dịch thủy phân vào Ziptip. Loại muối bằng 0.1% TFA. Thôi peptide ra khỏi Ziptip lên đĩa MS bằng dung dịch 0.1%TFA, 70% acetonitrile. Cuối cùng, bổ sung lên đĩa MS dung dịch matrix (0.5% CHCA trong 0.1% TFA, 70% acetonitrile). 2.2.5. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein Mẫu peptide được phân tích đồng thời với các mẫu chuẩn là hỗn hợp hai peptide Angiotensin II (Mw 1046.54 Da) và Insulin oxidized B (Mw 3494.65 Da). Tiến hành phân tích khối phổ MALDI-TOF để xác định khối lượng của các peptide của mỗi protein. Các thông số hoạt động của máy khối phổ gồm: Nguồn laser: 40 Profile: 100 profile cho một lần bắn Cổng ion: tắt Khối lượng tối ưu: 2000Da Phổ khối lượng: 500 – 5000Da Protein được nhận dạng bằng phương pháp PMF (Peptide Mass Fingerprint) sử dụng phần mềm Mascot theo chế độ: Cơ sở dữ liệu: NCBI Phân loại: Homo sapiens Enzyme: Trypsin Các cải biến không thay đổi: Cacbamidomethyl (C) Các cải biến thay đổi: Oxidation (M) Giá trị khối: MH+ Độ sai lệch cho phép: 1 amino acid 2.2.6. Xây dựng cây chủng loại phát sinh Để xây dựng cây chủng loại phát sinh dựa vào trình tự amino acid của protein chúng tôi tiến hành theo các bước sau: Bước 1: Lựa chọn trình tự protein nghiên cứu Bước 2: Sử dụng chương trình Blastp để so sánh trình tự amino acid của protein cần phân tích với các protein trong ngân hàng dữ liệu. Bước 3: Lựa chọn các trình tự tương đồng với trình tự cần phân tích từ kết quả BLAST. Lưu tệp tin bằng Notepad. Bước 4: Thực hiện phân tích so sánh nhiều trình tự bằng phần mềm ClustalX2 (lần 1). Bước 5: Phân tích trình tự so sánh bằng BioEdit. Bước 6: Thực hiện phân tích so sánh nhiều trình tự bằng phần mềm ClustalX2 (lần 2). Bước 7: Xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng phần mềm Phylip theo hai chương trình ProML (Protein Maximum Likelihood Method) và PROTPARS (Protein Sequence Parsimony Method). - Chương trình ProML sử dụng mô hình xác suất của Jones-Taylor-Thornton hoặc Dayhoff về sự thay đổi giữa các amino acid. Giả thuyết của mô hình này là: + Mỗi vị trí trong trình tự tiến hóa độc lập với nhau + Các loài khác nhau tiến hóa độc lập + Mỗi vị trí này trải qua sự thay thế với một tỷ lệ mong đợi được lựa chọn từ một dãy tỉ lệ. + Tất cả các vị trí thích hợp trong trình tự đã thay đổi hoặc không thay đổi sẽ cung cấp thông tin cho cây chủng loại phát sinh. + Xác suất thay đổi giữa các amino acid theo mô hình Jones, Taylor, và Thornton (1992) hoặc mô hình PAM của Dayhoff (Dayhoff và Eck, 1968; Dayhoff et. al., 1979). - Chương trình PROTPARS sử dụng phương pháp trung gian giữa Eck và Dayhoff (1966) và Fitch (1971). Theo Eck và Dayhoff (1966), bất kỳ amino acid nào đều có thể thay đổi thành amino acid khác, và tính số lượng những thay đổi cần thiết để tiến hóa các trình tự protein tạo ra trên cây phát sinh chủng loại. Sự thay đổi này cho phép thay thế các mã di truyền không bảo thủ bằng các mã bảo thủ khác. Để vẽ một nhánh khác, tính số nucleotide nhỏ nhất cần thay thế để tạo thành một trình tự protein mới. Giả thuyết của chương trình này là: + Sự thay đổi các vị trí khác nhau là độc lập + Sự thay đổi các loài khác nhau là độc lập + Xác suất thay đổi một base dẫn đến thay đổi trình tự amino acid là nhỏ hơn độ dài thời gian tiến hóa trên một nhánh của cây phát sinh. + Số thay đổi dự kiến trong các nhánh khác nhau của cây phát sinh không thay đổi bởi hai thay đổi có tỷ lệ chia nhánh cao hơn, có thể xảy ra hơn một thay đổi trong tỷ lệ chia nhánh thấp. + Số thay đổi dự kiến không đủ để biến đổi giữa các vị trí, mà hai thay đổi trong một vị trí có thể lớn hơn một thay đổi khác. + Xác suất thay đổi của một base cùng nghĩa là cao hơn nhiều so với xác suất của sự thay đổi base không cùng nghĩa. Bước 8: Hiển thị cây chủng loại phát sinh bằng phần mềm TreeView. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ MÔ GAN Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tiến hành tách chiết và phân tích song song protein ty thể và protein microsome của tế bào từ mô gan ung thư (mẫu bệnh) và mô gan bình thường (mẫu đối chứng). Mẫu mô được nghiền rồi thực hiện các bước ly tâm với những tốc độ khác nhau để phân tách ty thể và microsome của tế bào từ mô gan. Sau đó tách chiết protein và điện di SDS-PAGE để kiểm tra kết quả tách chiết. Trong điện di SDS-PAGE, mỗi protein hoặc một vài protein có cùng khối lượng phân tử được hiện lên dưới dạng từng băng vạch khác nhau. Băng protein bắt màu thuốc nhuộm càng đậm chứng tỏ hàm lượng protein loại đó càng lớn. Số lượng băng trong một giếng điện di càng nhiều, thành phần protein của mẫu càng đa dạng phong phú. Trong kết quả điện di lần 1, chúng tôi đã thấy có sự xuất hiện của các băng vạch protein. Tuy nhiên, sự biểu hiện của các băng vạch là chưa rõ ràng, đặc biệt với các băng vạch phía trên biểu hiện các protein có khối lượng lớn. Do đó, chúng tôi tiến hành tủa mẫu với dung dịch acetone với tỉ lệ 1 thể tích mẫu với 5 thể tích acetone trong 60 phút ở -20oC. Kết quả điện di kiểm tra lần 2 cho thấy các băng protein phân tách rõ ràng, với những băng trải đều từ trên xuống dưới và đặc biệt đã hạn chế được hiện tượng kéo vệt như ở bản gel điện di trước tủa (Hình 3). Hình 3: Điện di trên gel polyacrylamide mẫu trước và sau khi tủa với acetone tỷ lệ 1:5 Giếng 1: dịch chiết ty thể mô gan đối chứng trước tủa; giếng 2: dịch chiết ty thể mô gan đối chứng sau tủa; giếng 3: dịch chiết ti thể mô gan ung thư trước tủa; giếng 4: dịch chiết ti thể mô gan ung thư sau tủa; giếng 5: dịch chiết microsome mô gan đối chứng trước tủa; giếng 6: dịch chiết microsome mô gan đối chứng sau tủa; giếng 7: dịch chiết microsome mô gan ung thư trước tủa; giếng 8: dịch chiết microsome mô gan ung thư sau tủa. Kết quả như trên đã cho thấy, với kỹ thuật tách ty thể và microsome, đã thu được các dịch protein phù hợp cho các bước tiếp theo của quá trình phân tích proteomics. 3.2. PHÂN TÍCH HỆ PROTEIN TY THỂ VÀ MICROSOME TÁCH TỪ MÔ GAN TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU Cho đến nay, điện di hai chiều (2-DE) vẫn là kỹ thuật được dùng phổ biến nhất để phân tách các protein trong một mẫu phức tạp. Kỹ thuật 2-DE cho phép phân tách các protein khác nhau chỉ đến 0.1 đơn vị pI và 1 kDa về khối lượng phân tử. Protein trong dịch chiết mô gan bình thường và mô gan ung thư của bệnh nhân ung thư gan cùng được phân tách bằng điện di hai chiều. Trên bản gel điện di, các protein trong mẫu được phân tách thành các spot riêng rẽ hoặc các dãy spot của một loại protein, đây là kết quả của việc cải biến protein, có thể do sự sắp xếp ARN hay biến đổi sau dịch mã, tạo ra các đồng phân có khối lượng phân tử tương tự nhau và điểm đẳng điện gần nhau. Sau khi thu được protein, chúng tôi tiến hành điện di hai chiều để phân tách protein trong khoảng pH 4-7. Kết quả điện di cho thấy các protein đã được phân tách thành từng điểm (spot), hiện lên rõ ràng, riêng rẽ và phân bố trải khắp bản gel (hình 4 và 5). Hình 4. Điện di hai chiều mẫu protein ty thể tách từ mô gan. Chiều 1: Điện di đẳng điện, sợi IPG strip pH 4-7 dài 17cm; Chiều 2: Điện di SDS-PAGE, gel polyacrylamide 10% có SDS A: mẫu mô bình thường, B: mẫu mô ung thư Hình 5. Điện di hai chiều mẫu protein microsome tách từ mô gan Chiều 1: Điện di đẳng điện, sợi IPG strip pH 4-7 dài 17cm; Chiều 2: Điện di SDS-PAGE, gel polyacrylamide 10% có SDS A: mẫu mô bình thường; B: mẫu mô ung thư Phần mềm Phoretix cho phép so sánh sự biểu hiện của các protein thuộc mô gan ung thư so với mô gan bình thường thông qua sự biểu hiện của các spot trên các bản gel điện di hai chiều. Phần mềm giúp xác định các spot tương ứng trên các bản gel và tính toán giá trị cường độ khối trung bình của các spot, đây là cơ sở để so sánh mức độ biểu hiện của từng spot trên bản gel. Bằng phần mềm này, chúng tôi đã phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều, và đã xác định được các spot trên mỗi bản gel. Thống kê các spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô gan ung thư so với bản gel mô gan bình thường, chúng tôi nhận thấy có 43 spot khác biệt rõ ràng giữa hai bản gel, bao gồm: 1 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô ung thư, 1 spot chỉ thấy xuất hiện rõ rệt ở bản gel mô bình thường, 21 spot biểu hiện tăng ở bản gel mô ung thư, 20 spot biểu hiện giảm ở bản gel mô ung thư. Hình 6, 7 và 8 minh họa một số spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư và bản gel mô bình thường. Hình 6. Hình ảnh một số spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa hai bản gel điện di 2-D A: bản gel mô bình thường; B: bản gel mô ung thư Hình 7: Hình ảnh 3D một số spot protein ty thể biểu hiện khác biệt giữa hai bản gel điện di 2-D A : bản gel mô bình thường; B : bản gel mô ung thư Hình 8. Sự biểu hiện khác biệt của một số spot protein ty th