Luận văn Tối ưu hóa điều kiện tách chiết và làm giàu axit béo không no omega - 6, 7, 9 từ sinh khối vi khuẩn tía quang hợp

2.2. Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu vi sinh vật có trong dầu sinh học Tên chỉ tiêu thử Đơn vị tính Phƣơng pháp thử Tổng số vi khuẩn hiếu khí CFU/g ISO 4833-1:2013 E. coli CFU/g ISO/TS 16649-2:2005 Coliform CFU/g ISO 4832:2006 Staphylococcus aureus CFU/g AOAC 975.55 Salmonella CFU/g ISO 6579-1:2017 Tổng số nấm men, mốc CFU/g ISO 21527-1:2008 2.3.11. Phƣơng pháp xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. Kết quả biểu diễn ở dạng TB ± SD. Phần mềm SAS 9.1 đƣợc d ng để phân tích số liệu. Vẽ đồ thị đƣợc thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel phiên bản 2010. So sánh trung bình giữa nghiệm thức dựa vào phƣơng pháp ANOVA ở mức ý nghĩa α = 0,05. 38 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Quá trình tách chiết dầu sinh học giàu axit béo không no omega-6, 7, 9 từ SKK VKTQH bao gồm 2 giai đoạn chính: tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH; làm giàu axit béo omega-6, 7, 9 từ hỗn hợp TFA. Để thu đƣợc hiệu suất tách chiết axit béo không no omega-6, 7, 9 cao cần tối ƣu đƣợc hiệu suất tách chiết ở mỗi giai đoạn. Chính vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hƣởng của các tác nhân khác nhau lên hiệu suất tách chiết của mỗi giai đoạn nêu trên là rất cần thiết. Bên cạnh đó, nguồn sinh khối hỗn hợp 2 chủng VKTQH nuôi trồng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho tách chiết phải có chất lƣợng tốt, hàm lƣợng axit béo phù hợp. 3.1. HÀM LƢỢNG SINH KHỐI KHÔ, LIPID VÀ THÀNH PHẦN AXIT BÉO (OMEGA-6, 7, 9) CỦA SINH KHỐI HỖN HỢP 2 CHỦNG VKTQH SẢN XUẤT TRONG BỂ QUANG SINH THỂ TÍCH 1M3 Bể quang sinh thể tích 1m3 (sử dụng môi trƣờng bán tổng hợp) đã đƣợc lựa chọn để sản xuất sinh khối VKTQH làm nguyên liệu tách chiết dầu sinh học giàu axit béo không no (omega-3,6,7,9). Kết quả sau 8 ngày nuôi cấy cho thấy sinh khối có hàm lƣợng sinh khối khô và lipid đạt 2,42 ± 0,29 g/l và 20,342 ± 1,247% SKK tƣơng ứng. Hàm lƣợng axit béo không no omega-6, 7, 9 chiếm 56,28% so với TFA. Trong đó, hàm lƣợng omega-3, omega-6, omega-7 và omega-9 đạt 8,48%; 4,10%; 18,32% và 25,38%, tƣơng ứng (Bảng 3.1). Nhƣ vậy, sinh khối hỗn hợp 2 chủng VKTQH có thành phần và hàm lƣợng axit béo phù hợp, đảm bảo về chất lƣợng sử dụng làm nguyên liệu cho tách chiết dầu sinh học giàu axit béo. Bảng 3.1. Hàm lƣợng sinh khối khô, lipid và omega-3, 6, 7, 9 của VKTQH khi nuôi trong bể quang sinh thể tích 1m3 Các thông số Hàm lƣợng Sinh khối khô (g/L) 2,42 ± 0,29 Lipid (% SKK) 20,342 ± 1,247 Omega-3 (% so với TFA) 8,48 Omega-6 (% so với TFA) 4,10 Omega-7 (% so với TFA) 18,32 Omega-9 (% so với TFA) 25,38 Tổng omega-3,6,7,9 (% so với TFA) 56,28 39 3.2. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG TÁCH CHIẾT TFA TỪ SINH KHỐI KHÔ VKTQH Dầu thực vật có thể đƣợc tách chiết bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ ép, Soxhlet, sử dụng CO2 siêu tới hạn hoặc dung môi hoá học. Phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp (methyl hóa trực tiếp axit béo và chất xúc tác đƣợc bổ sung cùng một lúc) từ sinh khối là phƣơng pháp đơn giản, tiết kiệm thời gian, cho hiệu suất tách chiết cao do đó dẫn đến giá thành sản phẩm giảm hơn so với phƣơng pháp chuyển hóa hai giai đoạn (dầu sau khi tách chiết đƣợc cho phản ứng với methanol có mặt chất xúc tác) [76]. Vì vậy, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp tách chiết sử dụng dung môi hóa học sử dụng phƣơng pháp chuyển vị ester trực tiếp từ sinh khối VKTQH để tách chiết TFA nhằm thu đƣợc hiệu suất tách chiết TFA cao. Chúng tôi sử dụng quy trình tách chiết TFA đã đƣợc xây dựng cho vi tảo áp dụng với đối tƣợng mới là VKTQH và tiến hành tối ƣu các thông số cho phù hợp với đối tƣợng mới này nhƣ: nhiệt độ; chất xúc tác; tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (khối lƣợng: thể tích); thời gian trích ly; chế độ trích ly (khuấy liên tục, để tĩnh, khuấy gián đoạn). 3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng Thông thƣờng, nhiệt độ tách chiết càng cao sẽ làm nguyên liệu tăng khả năng trƣơng nở, vận tốc của quá trình chuyển khối, làm giảm độ nhớt của dầu làm cho dầu tan vào dung môi tốt hơn. Tuy nhiên, nhiệt độ cũng là một trong những yếu tố giới hạn vì nếu nhiệt độ tách chiết quá cao có thể sẽ thúc đẩy các biến đổi hóa học không mong muốn, làm giảm hiệu suất tách chiết. Trong thí nghiệm này sử dụng 3 khoảng nhiệt độ: 60-65ᵒC, 70-75ᵒC và 80-85ᵒC với chất xúc tác HCl, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v), thời gian phản ứng 3 giờ và khuấy trộn liên tục để tách chiết TFA. Hình 3.1 là kết quả hiệu suất quá trình tách chiết TFA với các nhiệt độ phản ứng khác nhau bao gồm 60 - 65 o C, 70 - 75 o C, 80 - 85 o C. Từ Hình 3.1 cho thấy ở nhiệt độ trong khoảng 80-85oC hiệu suất tách TFA tối ƣu đạt 20,3 ± 1,07% SKK. Hiệu suất tách TFA ở các khoảng nhiệt độ 70-75 o C và 60-65 oC đạt lần lƣợt 19,6 ± 1,12% và 13,7 ± 0,87% SKK. 40 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 Nhƣ vậy, hiệu suất tách chiết TFA tăng khi nhiệt độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, khi tách chiết với một lƣợng lớn sử dụng nhiệt độ 80-85°C là không an toàn, dung môi dễ bay hơi và dễ xảy ra cháy nổ. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ phản ứng trong khoảng 70-75°C để tiến hành tối ƣu các thông số tiếp theo. Nhiệt độ này thấp hơn của Johnson và Wen (2009) khi tiến hành phản ứng ở 90oC trong 40 phút trên đối tƣợng vi tảo cho hàm lƣợng diesel sinh học cao nhất đạt 42,05 ± 2,12% SKK tảo [76], nhƣng lại cao hơn so với nhiệt độ nghiên cứu của Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016) ở 60-65oC trong 3 giờ cho tách chiết axit béo đạt hiệu suất 46,7% sinh khối tảo [62]. Cho đến nay, tại Việt Nam chƣa có một công bố nào về tách chiết các axit béo không bão hòa trên đối tƣợng VKTQH. Ngoài ra, về thành phần các axit béo có trong sinh khối VKTQH lại có sự tƣơng đồng khá lớn với thành phần axit béo ở sinh khối vi tảo. Chính vì vậy, chúng tôi đã tiến hành so sánh kết quả nghiên cứu của mình với các công bố của vi tảo tại Việt Nam. 3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của chất xúc tác Chất xúc tác làm giảm năng lƣợng hoạt hóa và làm tăng tốc độ của phản ứng chuyển hóa ester, làm tăng hiệu suất quá trình tách chiết. Sử dụng các chất xúc tác nhƣ: HCl, H2SO4, NaOH và KOH với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v) ở nhiệt độ 70-75oC trong thời gian phản ứng 3 giờ và điều kiện khuấy trộn liên tục để tách chiết TFA. b a a 0 5 10 15 20 25 60 - 65 70 - 75 80 - 85 H iệ u s u ấ t (% ) Nhiệt độ (oC) 41 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 Kết quả ở Hình 3.2 cho thấy khi sử dụng chất xúc tác bazơ (KOH, NaOH) trong phản ứng tách chiết TFA rất phức tạp, khó khăn, hiệu suất tách chiết TFA thấp chỉ đạt 2,4 ± 0,28% và 1,1 ± 0,15% SKK tƣơng ứng. Khi sử dụng chất xúc tác axit (HCl, H2SO4), TFA thu đƣợc dễ dàng và đạt hiệu suất cao 19,7 ± 0,59% và 16,4 ± 0,6% SKK tƣơng ứng. Ngoài ra, H2SO4 có độ đậm đặc rất cao nên rất nguy hiểm khi sử dụng và dễ dàng gây ô nhiễm môi trƣờng nếu không có biện pháp xử lý thu hồi sau khi sử dụng. Trên đối tƣợng là vi tảo, HCl cũng đƣợc sử dụng làm xúc tác cho phản ứng tách chiết axit béo [62]. Một số nghiên cứu cũng sử dụng H2SO4 làm chất xúc tác và thu đƣợc hiệu suất chuyển hóa biodiesel cao nhất đạt 66,47% [76]. Chính vì vậy, HCl cũng đƣợc chọn làm xúc tác cho các phản ứng tiếp theo. 3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (khối lƣợng/ thể tích) Bản chất của quá trình tách chiết là quá trình khuếch tán phân tử. Khi sự chênh lệch nồng độ dầu trong nguyên liệu càng cao thì quá trình khuếch tán diễn ra mạnh, sự khuếch tán xảy ra cho đến khi đạt trạng thái cân bằng thì dừng lại. Khi sử dụng quá ít dung môi thì hiệu suất trích ly thấp do dung môi không đủ để hòa tan lƣợng dầu có trong nguyên liệu. Nếu sử dụng dƣ thừa dung môi thì sẽ gây lãng phí, tốn dung môi, tăng lƣợng tạp chất, tốn năng lƣợng cho quá trình cô thu hồi dung môi nên hiệu quả tách chiết không cao. Do vậy, cần thiết phải nghiên cứu tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp để trích ly đƣợc tối đa lƣợng dầu trong nguyên liệu và có hiệu quả kinh tế cao nhất. Trong thí nghiệm này sinh khối khô VKTQH đƣợc tách chiết với các tỷ b a d c 0 10 20 30 H2SO4 HCl NaOH KOH H iệ u s u ấ t (% ) Chất xúc tác 42 lệ nguyên liệu: dung môi là 1: 6; 1: 8; 1: 10 và 1: 12 (w:v), chất xúc tác HCl, nhiệt độ 70-75oC trong thời gian 3 giờ và ở điều kiện khuấy trộn liên tục. . Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ sinh khối/ dung môi lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 Kết quả Hình 3.3 cho thấy hiệu suất tách chiết TFA cao nhất tại tỷ lệ 1:12 (w:v) (đạt 20,5 ± 0,95% SKK) và thấp nhất tại tỷ lệ 1:6 (w/v) (chỉ đạt 11,8 ± 1,61% SKK). Khi so sánh hàm lƣợng TFA ở tỷ lệ 1:10 và 1:12 (w/v) cho thấy không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Ở điều kiện tỉ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi 1: 8 (w v), TFA thu đƣợc chỉ đạt 82% so với tỷ lệ 1:10 (w/v). Vì vậy, để tiết kiệm dung môi cũng nhƣ giảm giá thành sản phẩm tỷ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi 1:10 (w v) đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo. Nhƣ vậy, trên các đối tƣợng khác nhau thì tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là khác nhau. Johnson và Wen (2009) sử dụng tỷ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi (methanol, dichlomethan, H2SO4, hexane) là 1: 8 (w/v) cho hàm lƣợng diesel sinh học cao nhất đạt 42,05 ± 2,12 % SKK tảo. 3.2.4. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian phản ứng Thời gian ảnh hƣởng tới hiệu suất của quá trình tách chiết dầu. Trong thí nghiệm này, sử dụng chất xúc tác HCl, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w/v), nhiệt độ 70-75oC, điều kiện khuấy trộn liên tục và thời gian thay đổi: 2 giờ, 3 giờ và 4 giờ. Từ Hình 3.4 cho thấy hiệu suất thu TFA thay đổi khi tăng dần thời gian phản ứng. Với thời gian 3 giờ, hiệu suất tách chiết TFA cao nhất đạt 19,7 ± 0,25% SKK. Với thời gian 2 giờ hiệu suất thu TFA thấp chỉ đạt 16,2 ± 0,8% c b a a 0 5 10 15 20 25 1:6 1:8 1:10 1:12 H iệ u s u ấ t (% ) Tỷ lệ SKK : hỗn hợp dung môi 43 SKK, nguyên nhân có thể do phản ứng xảy ra chƣa hoàn toàn. Khi tiếp tục tăng thời gian lên 4 giờ, hiệu suất giảm cũng chỉ đạt 16,9 ± 1,01% SKK. Nguyên nhân có thể do phản ứng xảy ra trong thời gian dài làm bay hơi dung môi hoặc do tác động của nhiệt độ trong thời gian dài một số axit béo chƣa bão hòa bị chuyển hóa dẫn đến hiệu suất giảm. Để tiết kiệm thời gian và đạt hiệu quả kinh tế, thời gian phản ứng là 3 giờ đƣợc lựa chọn cho các thí nghiệm tiếp theo và kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Đinh Thị Ngọc Mai và cộng sự (2012) khi phản ứng ở 3 giờ đã chuyển hóa 43% diesel sinh học và axit béo đạt 46,7% sinh khối tảo [81]. Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 3.2.5. Kết quả xác định ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn Trong thí nghiệm này sử dụng chất xúc tác HCl, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:10 (w:v) ở nhiệt độ 70-75oC, thời gian 3 giờ và điều kiện khuấy trộn nhƣ sau: không khuấy trộn, khuấy trộn gián đoạn (30 phút khuấy, 30 phút ngừng) và khuấy trộn liên tục. Hình 3.5. Ảnh hƣởng của điều kiện khuấy trộn lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối VKTQH Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 b a b 0 10 20 30 2h 3h 4h H iệ u s u ấ t (% ) Thời gian c b a 0 5 10 15 20 25 Không khuấy Khuấy không liên tục Khuấy liên tục H iệ u s u ấ t (% ) Chế độ khuấy 44 Kết quả Hình 3.5 cho thấy hiệu suất tách chiết TFA ở điều kiện khuấy liên tục cao nhất đạt 19,8 ± 1,01% SKK. Trong khi đó ở điều kiện không khuấy hoặc khuấy gián đoạn, hiệu suất tách chiết TFA giảm đi chỉ đạt 14,3 ± 0,76% SKK và 16 ± 0,3 % SKK tƣơng ứng. Nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do chế độ khuấy ảnh hƣởng đến sự tiếp xúc giữa sinh khối và dung môi làm phản ứng xảy ra không liên tục. Do vậy, chế độ khuấy liên tục đã đƣợc lựa chọn để làm tăng tối đa hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô VKTQH. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Đinh Thị Ngọc Mai và cộng sự (2012) trên đối tƣợng vi tảo cho thấy hiệu quả chuyển hóa diesel sinh học tăng lên đáng kể đạt 89% dƣới điều kiện khuấy trộn liên tục [81]. Như vậy các điều kiện tách chiết cho phù hợp với đối tượng mới là sinh khối VKTQH (nhiệt độ 70-75oC, chất xúc tác HCl, tỉ lệ sinh khối: hỗn hợp dung môi là 1:10 (w/v), thời gian phản ứng 3 giờ, điều kiện khuấy trộn liên tục) 3.3. TỐI ƢU ĐIỀU KIỆN LÀM GIÀU OMEGA-6, 7, 9 TỪ HỖN HỢP AXIT BÉO TỔNG SỐ THU ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP TẠO PHỨC VỚI URÊ Dựa vào đặc tính của SFA, MUFA và PUFA, chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp tạo phức với urê để làm giàu hỗn hợp omega-6, 7, 9. Đây là một phƣơng pháp hiệu quả và dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm và để có đƣợc hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố đến quá trình làm giàu axit béo nhƣ: tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê, tỷ lệ TFA: urê: methanol và nhiệt độ kết tinh. 3.3.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo Để có đƣợc hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs cao trong quá trình làm giàu omega-6, 7, 9; chúng tôi tiến hành tối ƣu tỷ lệ hỗn hợp TFA: urê trong quá trình làm giàu. Các tỷ lệ TFA: urê gồm 1:2; 1:3; 1:4 và 1:5 (w w) đã 45 đƣợc sử dụng trong nghiên cứu. Tỉ lệ TFA: methanol đƣợc giữ nguyên 1:20 (w/v) và nhiệt độ kết tinh là 4oC. Hiệu suất tách đƣợc thể hiện trên Hình 3.6. d c b a 0 20 40 60 80 1:2 1:3 1:4 1:5H iệ u s u ấ t tá c h S F A s Tỷ lệ TFA:urê A a b c d 0 20 40 60 1:2 1:3 1:4 1:5 H iệ u s u ấ t tá ch M U F A s v à P U F A s Tỷ lệ TFA:urê B Hình 3.6. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê khác nhau. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 Kết quả ở Hình 3.6 cho thấy, khi tăng dần tỷ lệ TFA: urê từ 1:2 đến 1:5 (w/v) thì hiệu suất thu MUFAs và PUFAs giảm dần, đồng thời hiệu suất thu SFAs tăng dần. Ở tỉ lệ TFA : urê là 1:5 (w/w), hiệu suất tách chiết MUFAs và PUFAs thấp nhất đạt 21,3% (Hình 3.8.B), đồng thời hiệu suất tách SFAs cao nhất đạt 65,1% (Hình 3.8.A); tỷ lệ 1:4 (w/w) và tỷ lệ 1:3 (w/w) có hiệu suất tách chiết MUFAs, PUFAs lần lƣợt đạt 28,6% và 39,2%; hiệu suất tách SFAs lần lƣợt đạt 57% và 46,1%. Ở tỉ lệ TFA: urê là 1:2 (w/w) hiệu suất tách MUFAs và PUFAs cao nhất đạt 44,7% TFA và hiệu suất tách chiết SFAs thấp nhất đạt 37,6%. Axit béo omega-6, 7, 9 thuộc nhóm axit béo có 1 và 2 nối đôi trở lên. Do vậy, để thu đƣợc hỗn hợp axit béo có hàm lƣợng cao có thể chọn tỉ lệ TFA:urê là 1:2 và 1:3 (w/w) cho hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs cao. Tuy nhiên, trong phƣơng pháp tạo phức với urê, tỷ lệ giữa TFA và urê là yếu tố quan trọng quyết định tới độ tinh sạch của MUFAs và PUFAs mong muốn. Nếu tỷ lệ TFA: urê quá nhỏ thì urê sẽ không đủ khả năng tạo phức với tất cả các SFAs, do đó độ tinh sạch sẽ không cao. Nếu tỷ lệ này quá lớn thì urê sẽ có khả năng tạo phức với cả một số MUFAs và PUFAs, do đó sẽ làm cho hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs thấp, đẩy giá thành sản xuất dầu lên cao. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành phân tích thành phần axit béo hỗn hợp MUFAs và PUFAs thu đƣợc với các tỷ lệ TFA: urê khác nhau bằng phƣơng pháp GC-MS. Kết quả đƣợc chỉ ra ở Bảng 3.2. 46 Bảng 3.2. Thành phần axit béo của hỗn hợp MUFAs và PUFAs với tỷ lệ TFA: urê khác nhau Axit béo TFA:urê 1:2 TFA:urê 1:3 TFA:urê 1:4 TFA:urê 1:5 C14:0 0,36 - - - C15:0 1,01 - - - C16:1n-9 1,26 - - - C16:1n-7 0,52 0,1 - - C16:0 15,11 9,99 0,41 - C17:0 0,42 - - - C18:2n-6 4,15 21,51 88,31 82,09 C18:1n-9, 12 hydroxyl 4,52 - - - C18:1n-9 35,21 28,62 4,84 14,66 C18:1n-7 16,47 29,86 - - C18:3n-3 1,72 - - - C18:0 9,59 9,27 - - C18:2n-7 8,36 - 5,64 3,25 C20:1n-9 0,42 - - - C20:0 0,39 0,26 - - C22:0 0,5 0,28 0,8 - Tổng số axit béo ω-6 4,15 21,51 88,31 82,09 Tổng số axit béo ω-7 25,35 29,96 5,64 3,25 Tổng số axit béo ω-9 36,89 28,62 4,84 14,66 Tổng số axit béo ω-6, 7, 9 66,39 80,09 98,79 100 Từ Bảng 3.2 cho thấy ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 2 (w w), hàm lƣợng axit béo không bão hòa dạng ω-6, 7, 9 thu đƣợc chỉ đạt 66,39% so với TFA. Nhƣ vậy ở tỷ lệ TFA: urê này, lƣợng urê chƣa đủ để tạo phức với tất cả các SFAs. Do đó độ tinh sạch của mẫu không cao. Trong khi đó ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 3; 1: 4; 1: 5 (w w), hàm lƣợng ω-6, 7, 9 thu đƣợc tăng đáng kể và đạt 80,09%; 98,79% và 100% so với TFA, tƣơng ứng. Ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 3; 1: 4; 1: 5 (w w), hàm lƣợng ω-6 (PUFAs) thu đƣợc tăng dần đạt lần lƣợt 4,15%; 21,51%; 88,31% và 82,09% so với TFA. Ngƣợc lại, hàm lƣợng ω-7 và ω-9 (MUFAs) thu đƣợc có xu hƣớng giảm dần. Nhƣ vậy ở tỷ lệ TFA: urê là 1: 4; 1: 5 (w/w) urê có khả năng dƣ thừa đã tạo phức với cả một số MUFAs dẫn đến hàm lƣợng ω-6 (PUFAs) tăng cao hơn hẳn chiếm đến hơn 80% so với TFA, còn hàm lƣợng ω-7 giảm (chỉ đạt 5,64 và 3,25% so với TFA) và hàm lƣợng ω-9 cũng giảm (chỉ đạt 4,84 và 14,66% 47 so với TFA). Ở tỷ lệ TFA: urê là 1:3 (w w), hàm lƣợng axit béo tổng số (omega-6, 7, 9) đạt 80,09%. Trong đó ω-6, ω-7 và ω-9 đạt lần lƣợt 21,51%; 29,96%; 28,62% so với TFA. Hàm lƣợng ω-7 thu đƣợc cao gấp 5,3 lần và 9,2 lần so với tỷ lệ 1: 4 và 1: 5 (w w) tƣơng ứng. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ TFA: urê là 1:3 (w w) để làm giàu axit béo ω-6, 7, 9; đặc biệt là thu đƣợc ω-7 cao. Nhƣ vậy, trên từng đối tƣợng và mục đích thu hồi các loại axit béo khác nhau thì tỷ lệ TFA: urê đƣợc lựa chọn là khác nhau. Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016) sử dụng tỷ lệ TFA: urê là 1:4 (w/w) cho làm giàu các axit béo omega-3 và omega-6 trên đối tƣợng vi tảo. Đối với dầu thải từ quá trình chế biến cá ngừ đóng hộp, Mendes và cộng sự (2007) lựa chọn tỷ lệ TFA: urê là 1: 3,5 (w/w) cho làm giàu DHA có độ tinh sạch đạt 99,2% so với TFA. Wayan và cộng sự (2019) cũng chọn tỷ lệ dầu: urê = 1: 3 (w w) để làm giàu axit béo omega-3 từ dầu thải của quá trình chế biến cá ngừ đóng hộp. Quá trình kết tinh urê làm tăng hàm lƣợng axit béo không bão hòa đa nối đôi PUFAs gấp 2,7 lần [82]. 3.3.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của tỷ lệ TFA: urê: methanol trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo Trong thí nghiệm này methanol đƣợc sử dụng làm dung môi để hoà tan urê và axit béo. Để lựa chọn đƣợc tỷ lệ thích hợp, chúng tôi tiến hành xác định tỷ lệ TFA: ure: methanol là 1: 3: 15; 1: 3: 20 và 1: 3: 25 (w/w/v), nhiệt độ kết tinh là 4oC. Kết quả xác định hiệu suất tách chiết SFAs, MUFAs và PUFAs ở các tỷ lệ TFA: urê: methanol khác nhau đƣợc trình bày ở Hình 3.7. Hình 3.7. Hiệu suất tách chiết SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các tỷ lệ TFA: urê : methanol khác nhau. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 a b b 0 20 40 60 1:3:15 1:3:20 1:3:25 H iệ u s u ấ t tá ch S F A s Tỷ lệ TFA:urê:methanol A b a a 0 20 40 60 1:3:15 1:3:20 1:3:25H iệ u s u ấ t tá c h M U F A s v à P U F A s Tỷ lệ TFA:urê:methanol B 48 Kết quả ở Hình 3.7 cho thấy, ở tỷ lệ TFA: urê: methanol là 1: 3: 15 (w/w/v) hiệu suất tách MUFAs và PUFAs thấp nhất và hiệu suất tách SFAs cao nhất (đạt 34,8 % và 51,9% tƣơng ứng). Khi tăng tỷ lệ TFA:urê:methanol từ 1:3:15 lên 1:3:20 (w/w/v) thì hiệu suất tách MUFAs và PUFAs tăng dần từ 34,8% lên 40,3%, đồng thời hiệu suất tách SFAs giảm dần từ 51,9% xuống 45,2%, tƣơng ứng. Khi so sánh hiệu suất ở tỷ lệ 1: 3: 20 và 1: 3: 25 (w/w/v) cho thấy không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Bên cạnh đó, khi sử dụng nhiều dung môi có khả năng cho phép rửa phần lỏng (nhiều MUFAs và PUFAs) ra khỏi phần rắn (nhiều SFAs) tốt hơn. Tuy nhiên, phức tạo thành lại kém bền vững hơn. Do đó, sẽ giải phóng một phần SFAs vào pha lỏng và làm cho độ tinh sạch của MUFAs, PUFAs trong pha lỏng có thể bị giảm và điều này cũng làm cho hiệu suất thu MUFAs, PUFAs tăng. Dựa vào các phân tích trên, chúng tôi chọn tỉ lệ TFA: urê: methanol là 1:3:20 (w/w/v) là thích hợp cho quá trình làm giàu omega-6, 7, 9 tiếp theo. 3.3.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nhiệt độ kết tinh trong quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo Nhiệt độ là thành phần xúc tác cho quá trình tạo phức giữa urê và SFAs. Do đó, nhiệt độ kết tinh không chỉ ảnh hƣởng lớn đến độ tinh sạch, hiệu suất thu hồi MUFAs và PUFAs mà còn ảnh hƣởng tới hiệu quả kinh tế trong quá trình kết tinh. Medina và cộng sự (1995) đã khảo sát nhiệt độ kết tinh từ -36oC đến 36 o C và kết quả cho thấy nhiệt độ kết tinh tối ƣu cho làm giàu EPA và DPA từ dầu cá tuyết là 4oC [83]. Trong khi đó, Gimenez và cộng sự (1998) nhận thấy ở nhiệt độ 28oC, hiệu suất thu hồi EPA và DHA từ vi tảo cao hơn trong khi độ tinh sạch lại giảm không đáng kể [84]. Tuy nhiên, Hayes và cộng sự (1998) cho rằng nhiệt độ tạo phức của urê với các axit béo không nên lớn hơn 25 o C vì nhiệt độ cao hơn dẫn đến hiệu suất thu hồi dầu thấp hơn và độ tinh sạch giảm [85]. Chính vì vậy, khi tham khảo các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đã lựa chọn 3 ngƣỡng nhiệt độ kết tinh là 4, 17 và 25oC trong quá trình làm giàu axit béo, giữ nguyên tỷ lệ TFA:urê:methanol là 1:3:20 (w/w/v). Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.8. 49 a b c 0 10 20 30 40 50 60 4 17 25 H iệ u s u ấ t tá c h S F A s Nhiệt độ kết tinh (oC) A a a a 0 10 20 30 40 50 4 17 25 H iệ u s u ấ t tá c h M U F A s v à P U F A s Nhiệt độ kết tinh (oC) B Hình 3.8. Hiệu suất tách SFAs (A) và MUFAs, PUFAs (B) ở các nhiệt độ khác nhau. Ghi chú: số liệu mang những chữ cái giống nhau thì không khác biệt ở mức ý nghĩa α=0,05 Kết quả thu đƣợc ở Hình 3.8 cho thấy, khi tăng dần nhiệt độ kết tinh hiệu suất thu MUFAs và PUFAs tăng dần, đồng thời hiệu suất thu SFAs giảm dần. Ở 4oC, urê tạo phức với SFAs là bền vững nhất nên hiệu suất tạo phức cao nhất (46,8% so với TFA), ở nhiệt độ cao hơn (17 và 25oC) thì các phức đƣợc tạo ra kém bền vững hơn dẫn đến hàm lƣợng SFAs trong phần tạo phức giảm (43,1 và 38,6% so với TFA); hiệu suất MUFAs và PUFAs lại tăng lên (40,1 và 41,1% so với TFA). Hơn nữa, hiệu suất thu MUFAs và PUFAs giữa nhiệt độ kết tinh 4oC và 17oC không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê. Chính vì vậy, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ kết tinh cho quá trình tạo phức với tinh thể urê là 4oC để tạo ra dầu sinh học giàu các axit béo không no omega-6, 7, 9 trong điều kiện phòng thí nghiệm. Công bố của các tác giả Đặng Diễm Hồng và Hoàng Thị Lan Anh (2016), Mendes và cộng sự (2007) cũng lựa chọn 4oC làm nhiệt độ kết tinh trong quá trình làm giàu thu các axit béo omega-3, omega-6 và DHA [62]. 3.3.4. Kết quả nghiên cứu tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9 bằng việc tạo phức 2 lần với urê Sau quá trình phân tách hỗn hợp axit béo bằng tạo phức với urê, để tăng hiệu suất thu hồi các omega-6, 7, 9, pha rắn tiếp tục đƣợc sử dụng làm nguyên liệu để phản ứng với urê lần 2. Urê lần 2 đƣợc sử dụng với tỷ lệ SFAs: urê: methanol là 1:3:20 (w w v) tƣơng tự với hàm lƣợng và thể tích khi tiến hành với TFA. Để có thể xác định đƣợc hàm lƣợng các axit béo không bão hòa trong hỗn hợp MUFAs, PUFAs thu đƣợc sau khi tạo phức lần 2, chúng tôi xác định chỉ số iot (chỉ số iot là số gam iot kết hợp với 100 g chất 50 béo, iot kết hợp vào các liên kết đôi trong phân tử axit béo không no). Kết quả hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot đƣợc thể hiện trên bảng 3.3. Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs và chỉ số iot của mẫu thu đƣợc sau các lần tạo phức với urê Phản ứng tạo phức với urê Hiệu suất tách MUFAs, PUFAs Chỉ số iot trong MUFAs, PUFAs (I2/100 g) Urê lần 1 39,7 ± 0,56 (% TFA) 86,72 ± 1,49 Urê lần 2 5,35 ± 0,41 (% SFA) 16,39 ± 0,11 Kết quả chỉ ra trên Bảng 3.3 cho thấy khi cho SFAs tạo phức với urê lần 2 cho hiệu suất thu hồi MUFAs, PUFAs thấp chỉ đạt 5,35 ± 0,41 % SFAs, đồng thời chỉ số iot đạt 16,39 ± 0,11 thấp hơn 5,3 lần so với chỉ số iot trong MUFAs, PUFAs thu đƣợc khi tạo phức với urê lần 1. Điều này chứng tỏ trong phần MUFAs, PUFAs thu đƣợc sau tạo phức lần 2 có chứa ít các axit béo không no. Chính vì vậy, xét về hiệu suất, hàm lƣợng axit béo không no, hiệu quả kinh tế, chúng tôi thấy rằng không cần thực hiện bƣớc cho SFAs phản ứng tạo phức với urê lần 2. Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được các điều kiện thích hợp cho quá trình làm giàu hỗn hợp axit béo omega-6, 7, 9 bằng phương pháp tạo phức urê bao gồm tỉ lệ TFA: urê: metha