Luận văn Xác định hợp chất thuốc trừ sâu cơ phốt pho (OP) trong rau quả bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC /MS)

etat, ly tâm và đƣợc lọc qua màng PTFE rồi tiến hành xác định. Hiệu suất thu hồi đạt 80% đến 105% với RSD <11%. Giới hạn định lƣợng 0,01mg/kg và giới hạn phát hiện khoảng 0,001 đến 0,004mg/kg.  Tác giả Min Liu, Yuki hashi, Yuanyuan Song và Jin-Ming Lin [56],[57] đã tiến hành xác định đồng thời nhóm cacbamat và nhóm phốt pho hữu cơ trong rau quả bằng phƣơng pháp LC/MS. Các chất cần phân tích đƣợc chiết ra khỏi mẫu bằng acetonitril và làm sạch bằng chất hấp phụ PSA. Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng từ 80% đến 110% với RSD <8%. Giới hạn định lƣợng khoảng từ 0,5 đến 35µg/kg  Tác giả Elvira Grou và cộng sự [36] đã xác định thuốc bảo vệ thực vật carbamat trong đất và nƣớc bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV ở bƣớc sóng 254nm. Các mẫu nƣớc đƣợc chiết lỏng lỏng với diclometan, các mẫu đất đƣợc làm sạch bằng cột florisil. Dịch chiết đƣợc đem cô 22 quay đến cạn, hòa cặn bằng 1ml metanol và đem đo. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với mẫu nƣớc từ 0,005 – 0,01µg/g, đối với mẫu đất từ 0,05 - 0,1µg/g. 1.3.3. Phƣơng pháp điện di mao quản Nguyên tắc: là dựa trên cơ sở tính chất điện di của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đƣờng kính 25 - 100 µm ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dƣới tác dụng của một từ trƣờng điện E nhất định đƣợc cung cấp bởi một nguồn thế cao một chiều (V: 15 - 40 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa là CEC là kỹ thuật tách đƣợc thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trƣờng điện E điều khiển sự tách của các chất. Việc dùng cột mao quản có nhiều ƣu việt, nhƣ tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhƣng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất xẩy ra nhanh và hiệu quả cao. * Cơ chế điện di: Sự điện di của các phần tử chất tan (các ion) trong ống mao quản là cơ chế di chuyển khác nhau của chất tan (chất phân tích), dƣới tác dụng của lực điện trƣờng E nhất định và tính chất của dòng điện di thẩm thấu (Electro- Osmotic Flow: EOF), trong sự phụ thuộc vào điện tích và kích thƣớc của chúng. Kĩ thuật điện di mao quản là một kĩ thuật mới đƣợc phát triển khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Đây là một kĩ thuật có thời gian phân tích nhanh, tốn ít dung môi và hóa chất. Việc xác định các hóa chất bảo vệ thực vật bằng thiết bị này vẫn đang đƣợc nghiên cứu và chƣa có nhiều loại thuốc trừ sâu đƣợc xác định bằng phƣơng pháp này.  Các tác giả Gordon Ross, Monika Dittmann Agilent Technologies, Waldbronn, Germany, Thomas Adam thuộc đại học Mainz, Đức [40] đã tiến hành xác định các herbicides bằng phƣơng pháp CEC. Thiết bị sử dụng của hãng Agilent kết hợp với detecto mảng diot. Các dung dịch đệm đƣợc lọc và làm khô trƣớc khi sử dụng. Hình 1.1 mô tả cho quá trình tách của các loại thuốc diệt cỏ. 23 Hình 1.2. Sắc đồ của một số loại thuốc diệt cỏ tách bằng CE  Các tác giả Gordon Ross, Kaho Minoura [41] đã tiến hành xác định các chất diệt cỏ trên thiết bị CE/MS. Kết quả cho thấy thiết bị tách nhanh và chính xác các loại thuốc diệt cỏ (hình 1.2). Khảo nghiệm có khả năng tái cho. Độ lặp lại rất tốt đối thời gian lƣu là 0,14 đến 0,16% RSD và đối với diện tích pic là 4,2% đến 4,5% RSD. Khoảng tuyến tính từ 0 đến 10mg/ml với r2 là 0,99928.  Tác giả Xiaoping Wu và cộng sự [65] đã tách và xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu carbamat bằng phƣơng pháp điện di mao quản đẳng áp. Cột mao quản có đƣờng kính 75µm đƣợc nhồi hạt ODS 3µm. Pha động bao gồm 30% acetonitril và 70% dung dịch đệm CH3COONH4 5mM (pH = 6,5) chứa 1mM SDS và 0,01% trietylamine (TEA). Tại các điều kiện tối ƣu, 10 carbamat đã đƣợc tách nhanh trong vòng 20 phút. Các mẫu rau đƣợc làm sạch qua SPE. Phƣơng pháp có giới hạn phát hiện từ 0,05 - 1,6mg/kg và hiệu suất thu hồi từ 51,3 - 109,2% với độ lệch chuẩn RSD < 11,4%. Phƣơng pháp đã đƣợc áp dụng để xác định 10 loại carbamat trong một số loại rau.  Các tác giả Yugui Tao, Yaoming Wang, Lianbin Ye, Hefei Li, Qiang Wang (2008) [67] đã sử dụng phƣơng pháp điện di mao quản và phƣơng pháp tối ƣu hóa mặt mục tiêu để phát hiện đồng thời của omethoate và dichlorvos. Kết quả cho thấy các điều kiện tối ƣu cho omethoate và xác định dichlorvos là: pH 7,64; nồng độ SDS 67,5mM, tách điện áp 19,0 KV. Khoảng tuyến tính định lƣợng 1,0-300 ng/mL omethoate và dichlorvos với hệ số tƣơng quan tƣơng ứng là 0,9967 và 0,9965. 24 Hình 1.3. Sắc đồ của Omethoat và Dichlovos Các giới hạn phát hiện là 0,046 ng/mL và 0,031ng/mL cho omethoate và dichlorvos, với độ lệch tiêu chuẩn tƣơng đối 3,6% (RSD). Hiệu suất thu hồi của omethoate và dichlorvos từ 94,1% đến 106,0% (Bảng 1.2). Bảng 1.2. Hiệu suất thu hồi của Omethoate và Dichlorvos 1.3.4. Phƣơng pháp phổ UV-VIS Phƣơng pháp phổ UV-VIS là một trong những phƣơng pháp chính để xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu. Tuy nhiên phƣơng pháp này đã không còn đƣợc sử dụng nhiều trong những năm gần đây. Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc sự hấp thụ của các chất. Việc sử dụng phƣơng pháp phổ UV-VIS để xác định dƣ lƣợng thuốc BVTV bị giới hạn bởi độ nhạy và độ chọn lọc thấp.  Tác giả Turner [63] đã sử dụng 4-(4-nitro-benzyl)-pyridine để làm thuốc thử cho hầu hết các loại thuốc trừ sâu. Tuy nhiên độ nhạy của phƣơng pháp thấp cỡ microgam.  Các tác giả Sunitha B. Mathew, Ajai K. Pillai, Vinay K [60] đã dùng phƣơng pháp phổ UV-VIS để xác định các thuốc trừ sâu loại OP nhƣ malthion, 25 dimethoate và phorate. Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa trên quá trình oxy hóa của thuốc trừ sâu nhóm OP với sự có mặt dƣ của N-bromosuccinimide (NBS) và đƣợc xác định với Rhodamine B (max: 550nm). Khoảng nồng độ của các chất tuân theo định luật Beer lần lƣợt là phorate (0,108-1,08)g/ml; malathion (0,056-0,56)g/ml; Dimethoate (0,028-0,28)g/ml với độ lệch chuẩn <2% (RSD) . Phƣơng pháp này đạt đƣợc hiệu suất thu hồi rất tốt từ 94% đến 96%. 1.3.5. Phƣơng pháp cực phổ Trong phƣơng pháp này, ngƣời ta phân cực điện cực giọt thủy ngân bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với thời gian để nghiên cứu các quá trình khử cực của chất phân tích trên điện cực đó. Vì vậy, thiết bị cực phổ gồm hai phần chính là máy cực phổ và hệ điện cực bao gồm điện cực giọt thuỷ ngân và điện cực so sánh. Đƣờng cực phổ biểu diễn sự phụ thuộc của chiều cao cƣờng độ dòng với nồng độ chất phân tích. Để xác định các lƣợng nhỏ chất thƣờng dùng cực phổ cổ điển. Để xác định các lƣợng chất cực nhỏ thƣờng dùng các phƣơng pháp cực phổ hiện đại nhƣ cực phổ sóng vuông, cực phổ xung vi phân [14].  Các tác giả Yongnian Ni, Ping Qiu, Serge Kokot (2004) [68], đã xác định 3 loại thuốc trừ sâu là methyl parathion (PTM), fenitrothion (FT) và parathion (PT) bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với một điện cực thả treo thủy ngân (HMDE). Các mẫu sau khi đƣợc xử lý sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ với các điều kiện nhƣ sau: tốc độ quét 20mV/s, trong khoảng từ -10 mv đến - 1000mV, đỉnh pic của các chất lần lƣợt đối với Methyl parathion -458mV, fenitrothion -461mV và parathion -509mV. Khoảng tuyến tính của 3 loại OP trên từ 0,01 đến 0,12mg/l với độ lệch chuẩn tƣơng đối là 2,1; 1,8 và 1,9 cho lần lƣợt các chất. Giới hạn phát hiện lần lƣợt là 4,8; 4,5 và 4,5 đối với Methyl parathion, fenitrothion và parathion. Hiệu suất thu hồi nằm trong khoảng 75% đến 125%.  Các tác giả Guiberteau, Galeano Diáz, Salinas và J.M. Ortiz [29] đã xác định carbaryl và carbofuran bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân. Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng xác định các mẫu nƣớc sông. Các mẫu nƣớc sau khi xử lí sẽ đƣợc xác định bằng phƣơng pháp cực phổ xung vi phân với các điều kiện sau: tốc độ quét 26 20mV/s (bƣớc nhảy thế: 5mV, khoảng thời gian 0,25s), biên độ xung 50mV trong khoảng từ + 0,4V đến + 0,8V. Khoảng tuyến tính của carbaryl từ 5.10-7 đến 10-4M và của carbofuran từ 5.10-7 – 5.10-5M với độ lệch chuẩn tƣơng đối tƣơng ứng là 1,62 và 1,86%. 1.3.6. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp đơn giản, rẻ tiền, có thể tiến hành ở mọi phòng thí nghiệm, định tính và bán định lƣợng đƣợc hầu hết các loại hóa chất BVTV. Bản mỏng để phân tích thuốc BVTV làm bằng thủy tinh phẳng, kích thƣớc 20x20 cm hay 20x10 cm, đƣợc rải lớp huyền phù silicagel, oxit nhôm, than hoạt tính v.v Sấy khô bản mỏng, chấm dịch chiết lên bản mỏng cách mép dƣới 1,5 cm. Đợi bay hết dung môi. Đặt thẳng đứng bản mỏng vào bình chứa dung môi, có chiều cao lớp dung môi 1cm. Đậy kín bình để phát triển dung môi. Khi dung môi lan lên cách mép trên bản mỏng 2cm, đƣa ra ngoài chờ bay hết dung môi. Phun lên bản mỏng thuốc thử để nhận biết chất cần phân tích. Dung môi chạy bản mỏng thƣờng là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi hữu cơ. Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các hoạt chất có trong mẫu đƣợc tách ra khỏi nhau, đƣợc đặc trƣng bằng hệ số chạy Rf. Giá trị Rf là tỉ số chiều cao hoạt chất di chuyển đƣợc trên bản mỏng (tính từ tâm vết) so với chiều cao dung môi di chuyển, đặc trƣng cho sự tƣơng tác giữa hoạt chất - dung môi - chất hấp phụ. Thông qua giá trị Rf có thể định tính và qua diện tích vết để bán định lƣợng chất cần phân tích. Để có thể kết luận chính xác cần phải chạy 2 đến 3 hệ dung môi khác nhau. Thuốc thử nhận biết các hóa chất BVTV nhóm clo hữu cơ là dung dịch bạc pha trong aceton. Sau đó soi bản mỏng dƣới ánh đèn tử ngoại, nhận biết các chất qua vết màu nâu đen. Dung dịch p-Nitrobenzylpyridine, Tetraacetylenpentamine, Paladiclorua là những thuốc thử thông dụng đối với nhóm lân hữu cơ đƣợc phun lên bản mỏng sau khi oxi hóa chúng trong hơi benzen. Có nhiều loại thuốc thử cho nhóm carbamat, những thuốc thử nhạy là: p- Dinitro diazonium fluoborate pha trong etanol. Sau khi chạy bản mỏng, phun lên 27 một lớp dung dịch KOH. Các chất carbamat bị thủy phân phản ứng với p-Dinitro diazonium fluoborate cho các hợp chất phức huỳnh quang màu hồng. Ở nƣớc ta, phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng đã đƣợc áp dụng để phân tích BHC, Methyl parathion, Dimethoate trong gạo, đậu tƣơng, chè [19],[20],[24]. 1.3.7. Xử lý mẫu (các kỹ thuật chiết, làm sạch và làm giàu hóa chất BVTV) 1.3.7.1. Chiết thông thường: a, Chiết lỏng - lỏng Nguyên tắc: Sử dụng dung môi hữu cơ để chiết đối tƣợng phân tích tan trong dung môi ở nhiệt độ thƣờng những mẫu đã làm nhỏ. Có thể dùng thêm một số tác nhân bổ trợ nhƣ: lắc cơ học, khuấy trộn siêu tốc, sóng siêu âm . Áp dụng và ưu nhược điểm: chiết lỏng - lỏng đƣợc sử dụng phổ biến để chiết các hóa chất BVTV từ nông sản. Để chiết các hợp chất cơ phốt pho, cơ clo, trong các mẫu nông sản thƣờng dùng các loại dung môi ít phân cực nhƣ aceton, acetonitril, ethyl acetate Kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên là sử dụng dung môi hữu cơ, ít nhiều ảnh hƣởng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời.  Tác giả Leoni (1991) [50] đã sử dụng acetonnitril để chiết 7 loại hóa chất bảo vệ thực vật cơ phốt pho trong rau quả. Sasaki (1987) trong báo cáo của mình đã sử dụng aceton và benzen để chiết các 23 loại OP trong mẫu rau quả. Blaha (1985) [31] cũng đã sử dụng aceton, methylen clohexan. Leoni (1992) [50] đã dùng aceton để chiết OP ra khỏi mẫu rau quả. b, Chiết Soxhlet: Nguyên tắc: dùng dung môi ở nhiệt độ cao sẽ chiết liên tục và chiết kiệt đối tƣợng phân tích trong mẫu đã làm nhỏ. Thời gian chiết phụ thuộc bản chất mẫu. Áp dụng và ưu, nhược điểm: một số tác giả đã sử dụng chiết Soxhlet để chiết hóa chất BVTV trong nông sản [8], chè, dƣợc liệu [24]. Đây là kỹ thuật chiết kinh điển nhƣng khá hiệu quả. Nhƣợc điểm là thƣờng tốn dung môi hữu cơ và thời gian chiết dài. 28 Hình 1.4. Mô hình chiết Soxhlet 1.3.7.2. Chiết pha rắn (SPE) [12][25][48] SPE là kỹ thuật xử lý mẫu dựa trên nguyên tắc sắc ký lỏng nhằm loại các ảnh hƣởng của nền mẫu hoặc làm giàu đối tƣợng phân tích trƣớc phân tích. * Một số loại cột và pha tĩnh thƣờng dùng Thân cột: thƣờng làm bằng thủy tinh hoặc chất dẻo tinh khiết chịu dung môi (polypropylen), có dạng hình trụ (hình 1.4). Pha tĩnh: pha tĩnh thƣờng dùng: C18, C8, C4, C2, Cyclohexan, Phenyl (Pha đảo); Silica, Florisil, Amino, Cyano, Diol, Alumina (Pha thƣờng); SAX (Trao đổi anion); SCX (Trao đổi catrion) * Cơ chế chiết: tƣơng tự sắc ký lỏng - rắn - Hấp phụ (pha thuận): sử dụng ngay các nhóm chức trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ. Về cơ bản, sử dụng các điều kiện sắc ký pha thuận. Chất hấp phụ hay đƣợc dùng nhiều nhất là silicagel, magie silicat (Florisil), nhôm oxit. - Phân bố trên pha liên kết (pha đảo): bề mặt chất hấp phụ đã thay đổi, đƣợc gắn thêm các nhóm chức hóa học khác nhau tạo ra cơ chế chiết theo kiểu sắc ký phân bố. Kiểu pha thuận: pha tĩnh phân cực giữ lại các chất phân tích phân cực, cho phép các chất phân tích không phân cực đi qua cột. Kiểu này thƣờng sử dụng các 29 dung môi ít hoặc không phân cực. Kiểu pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngƣợc lại với kiểu trên, dung môi sử dụng thƣờng có độ phân cực nhất định. - Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đƣợc gắn với các nhóm chức có thể ion hóa. Cơ chế tách chiết tƣơng tự sắc ký trao đổi ion. Hình 1.5. Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung môi nƣớc Hình 1.6. Cơ chế SPE phân tích mẫu trong dung môi khác nƣớc ít và không phân cực 30  Các bước thực hiện: Hình 1.7. Các bƣớc thực hiện của phƣơng pháp SPE  Chọn cột chiết pha rắn: tùy thuộc kiểu chiết mô tả ở trên, thể tích mẫu, mức độ tạp chất, mà chọn cột có thể tích, lƣợng và loại pha tĩnh khác nhau.  Luyện cột: cho dung môi đi qua chất hấp thu để thấm ƣớt và solvat hóa các nhóm chức, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là dung môi.  Nạp mẫu vào cột chiết: chuyển mẫu lên cột, sau đó sử dụng áp suất giảm hoặc để mẫu tự chảy.  Rửa loại tạp chất: đây là giai đoạn rửa giải cá tạp chất. Điều quan trọng nhất của quá trình này là chất phân tích không đƣợc tan trong dung dịch rửa.  Rửa giải chọn lọc lấy chất phân tích: dùng dung môi thích hợp để lấy chất cần phân tích. * Áp dụng và ưu nhược điểm: một số tác giả đã sử dụng kỹ thuật SPE để chiết và làm sạch hóa chất BVTV trong rau quả. Ƣu điểm là lƣợng dung môi sử dụng thƣờng nhỏ (< 10 ml), thời gian chiết nhanh, tỷ lệ thu hồi cao, không tạo nhũ tƣơng, độ lặp lại tốt. Tuy nhiên cột SPE nhồi sẵn có giá thành tƣơng đối cao.  Các tác giả Fillion (2000) [37] đã sử dụng cột C18 và aminopropyl để làm sạch các thuốc trừ sâu dạng OP trong rau quả, hiệu suất thu hồi đạt 80% đến Hoạt hóa cột Nạp mẫu Rửa tạp chất Rửa chất phân tích 31 125%. Cook (1990) [33] đã sử dụng cột C18 để làm sạch các OP trong mẫu nho, cam, xà lách, cà chua, hiệu suất thu hồi đạt 82% đến 112%. Alvin Chai L.K. và Lau Seng (2004) [27] đã sử dụng cột C18 để làm sạch các OP trong các mẫu rau cải, dƣa chuột và đậu xanh với hiệu suất thu hồi đạt 71% đến 107%. 1.3.7.3. Vi chiết pha rắn (SPME) Nguyên tắc: SPME là quá trình chiết và tự làm giàu một cách chọn lọc chất phân tích không phân cực từ mẫu lỏng phân cực lên pha tĩnh lỏng không phân cực phủ trên bề mặt sợi vi chiết. SPME là quá trình chiết đạt tới cân bằng tuân theo định luật phân bố, trong quá trình chiết thì mẫu luôn đƣợc khuấy trộn [24][39] Thiết bị: Sợi làm bằng silica nung chảy phủ lớp pha tĩnh mỏng (carbowax, PDMS), đặt trong lòng một chiếc kim gắn với một pít - tông làm bằng thép không gỉ. Tổ hợp này đƣợc đặt trong bộ phận bảo vệ (sy-ranh). Hình 1.8. Mô hình phƣơng pháp SPME Áp dụng và ưu nhược điểm: ban đầu SPME đƣợc áp dụng để chiết các chất cơ clo trong môi trƣờng [53]. Gần đây SPME đã đƣợc áp dụng trong nhiều lĩnh vực nhƣ dƣợc phẩm, sinh học Ƣu điểm của phƣơng pháp là rất nhạy, không sử dụng dung môi hữu cơ. Nhƣợc điểm là giá thành còn đắt, thời gian chiết kéo dài. 32  Các tác giả Magdic S., Pawliszyn J (1996) [53] đã xây dựng thành công phƣơng pháp vi chiết pha rắn để chiết 8 loại thuốc trừ sâu cơ clo ra khỏi nƣớc với khoảng nồng độ của các chất 0,001ng/ml đến 100ng/ml. Độ lặp lại của phƣơng pháp rất tốt với độ chính xác giữa các lần đo dƣới 20% RSD. 1.3.8. Phƣơng pháp phân tích định tính và định lƣợng [25] a, Định tính: Có thể dựa vào thời gian lƣu (tR), sử dụng các detecto có tính chọn lọc nhƣ ECD, NPD, FPD hay dùng detecto khối phổ để định tính các chất. b, Định lượng: * Chuẩn hóa diện tích: chuẩn hóa theo diện tích là cách tính theo tỷ lệ phần trăm diện tích pic đƣợc coi tƣơng ứng với tỷ lệ phần trăm trọng lƣợng. Phƣơng pháp này không sử dụng trong phân tích dƣ lƣợng. * Ngoại chuẩn: tiến hành sắc ký mẫu thử song song và đồng thời với dung dịch chuẩn (chuẩn 1 điểm) hoặc dựng đƣờng chuẩn. Hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu thử đƣợc xác định dựa vào đƣờng chuẩn. * Nội chuẩn: phƣơng pháp này thƣờng đƣợc sử dụng khi độ lặp lại của hệ thống không tốt hoặc hệ thống không đƣợc chuẩn hóa thƣờng xuyên. Sau khi tiến hành sắc ký, đƣờng chuẩn đƣợc xác định dựa vào tỷ số giữa diện tích pic các chất chuẩn và chất nội chuẩn, nhƣ vậy các sai số về thể tích đƣợc loại bỏ. * Thêm chuẩn: chất chuẩn giống nhƣ chất cần phân tích đƣợc thêm vào mẫu thử. Thêm chuẩn thƣờng nhằm hai mục đích: làm tăng độ nhạy của phƣơng pháp hoặc khảo sát độ đúng của phƣơng pháp. 33 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG P ƢƠNG TIỆN VÀ P ƢƠNG P P NG IÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu Hiện nay, nhiều ngƣời nông dân đã lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật làm cho dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật trong nhiều mẫu rau vƣợt giới hạn cho phép hàng chục lần; nhất là các loại rau ăn lá nhƣ: cải ngọt, mồng tơi, cải bẹ xanh, cải bắp, dƣa leo Dƣ lƣợng hóa chất bảo vệ thực vật trong các loại rau quả quá cao đã gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời, là nguyên nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm. Do đó, đối tƣợng nghiên cứu là một số loại rau nhƣ rau, củ, quả. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp xác định đồng thời dƣ lƣợng các thuốc trừ sâu cơ phốt pho trong rau, quả bằng phƣơng pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS). Trong luận văn này, chúng tôi sẽ tiến hành xác định các loại thuốc trừ sâu hữu cơ là Methyl parathion (Vofatox) và Parathion (Thiophot) là chính, bởi vì hai loại thuốc này vẫn đƣợc sử dụng khá phổ biến và có ảnh hƣởng rất lớn đến môi trƣờng cũng nhƣ sức khỏe con ngƣời. 2.1.2. Nội dung nghiên cứu Để đạt đƣợc mục tiêu đề ra, cần nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau: 2.1.2.1. Xây dựng phƣơng pháp a) Khảo sát phƣơng pháp bao gồm: - Điều kiện chạy sắc ký GC/MS - Điều kiện tách chiết mẫu b) Thẩm định phƣơng pháp: - Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lƣợng LOQ - Khoảng tuyến tính - Độ chụm (độ lặp lại) - Độ đúng (độ chệch, độ thu hồi) 34 2.1.2.2. Ứng dụng phƣơng pháp trong phân tích mẫu thật Áp dụng phƣơng pháp mới xây dựng để xác định dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật cơ phốt pho trong một số loại rau và quả trên địa bàn Hà Nội. 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 2.2.1. Thiết bị a, Máy SKK Agilent 6890 plus b, Máy ly tâm Hettich 220 R c, Dụng cụ SPE Hình 2.1. Các thiết bị và dụng cụ cơ bản sử dụng trong nghiên cứu  Hệ thống sắc ký khí GC 6790 Plus và detector MS 5790 Agilent.  Máy lắc vortex.  Máy đồng nhất mẫu Ultra Turax T25.  Máy li tâm Hettich.  Cân phân tích (có độ chính xác 0,1mg và 0,01mg).  Cân kĩ thuật (có độ chính xác 0,01g).  Máy cất quay chân không Buchi.  Bộ chiết pha rắn 2.2.2. Dụng cụ  Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml. Bình định mức: 5, 10, 50, 100ml. 35  Ống li tâm 50ml  Cột chiết pha rắn C18 Bond Elute Agilent  Vial loại 1,8ml.  Pipet pasteur.  Ống đong, phễu, giấy lọc. 2.2.3. Dung môi hóa chất Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết của Merk.  Chuẩn OPs gồm: Thionazin, Sulfotep, Phorate, Disulfoton, Methyl parathion, Parathion của hãng Dr. Ehrenstorfer GmbH, Đức.  Methanol  n-hexan  Diclometan  Ete dầu hỏa  Toluen  Na2SO4  NaCl  Nƣớc cất 2 lần, deion. 2.3. Xây dựng các qui trình xử lý mẫu để phân tích các hóa chất BVTV 2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu Áp dụng TCVN 5139 : 2008 và tham khảo thêm quy định của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn về phƣơng pháp lấy mẫu [3],[18]. Quá trình lấy mẫu dựa vào mục đích của quá trình phân tích để chọn phƣơng thức lẫy mẫu, vận chuyển và bảo quản, đảm bảo mẫu là đại diện. Quá trình phân tích trở nên không có ý nghĩa và khó lý giải nếu quá trình lấy mẫu không tuân thủ các nguyên tắc lấy mẫu hoặc sơ xuất trong quá trình lấy mẫu. Ngƣời phân tích có thể lấy mẫu ngoài cánh đồng hoặc lấy mẫu lô hàng. Nếu lấy mẫu lô hàng thì mẫu phải đại diện cho một lô hàng. Mục đích của quá trình lấy 36 mẫu này là kiểm tra mức dƣ lƣợng hóa chất BVTV có vƣợt quá MRLs không. Trong quá trình lấy mẫu tránh làm nhiễm bẩn. Mẫu lấy ngẫu nhiên ở các vị trí khác nhau. Mẫu đƣợc đựng trong túi PE sạch, mã hóa và mang về bảo quản trong tủ lạnh ở dƣới 5oC. 2.3.2. Phƣơng pháp phân tích mẫu (a) Lựa chọn phương pháp: Tùy theo tính chất của đối tƣợng nghiên cứu (rau, quả) và của đối tƣợng phân tích (hóa chất BVTV) mà sử dụng phƣơng pháp xử lý mẫu thích hợp. - Chiết, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích: + Chiết đối tƣợng phân tích bằng dung môi hữu cơ. + Nếu dung môi chiết ít hoặc không phân cực, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE sử dụng Silica hoặc Florisil. + Nếu dung môi chiết phân cực hoặc trung bình, làm sạch và làm giàu đối tƣợng phân tích bằng phƣơng pháp chiết pha rắn SPE trên cột C18. - Kỹ thuật bổ trợ làm tăng hiệu quả chiết: nhiệt độ (chiết nóng cách thủy, chiết Soxhlet); siêu âm; ly tâm; khuấy trộn siêu tốc; vi sóng hỗ trợ (b), Một số thực nghiệm khảo sát: - Khảo sát lựa chọn dung môi chiết: acetonitril và aceton. Khảo sát so sánh hiệu suất chiết trên mẫu thử đƣợc thêm chuẩn. - Khảo sát so sánh dung môi rửa giải về hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột là hexan : petroleum ete (1:1); acetone : petroleum ete (1:1); hexan : aceton (5:1). - Cách tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi trên mẫu chuẩn khi cho qua cột: chuyển 6 ml dung dịch chuẩn có chứa các chất phân tích (pha trong nền mẫu trắng - dƣa chuột) cần khảo sát vào cột. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó rửa giải với các dung môi cần khảo sát. Thu hồi dung môi rửa giải, chia thành 2 đến 3 phân đoạn và hứng vào các ống nghiệm khác nhau. Làm bay hơi bằng khí nitơ tới cặn. Hòa tan cắn trong 1 ml n-hexan và chạy theo chƣơng trình sắc ký đã chọn. 37 - Khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn khi qua cột sẽ ghi đƣợc số ml dung môi rửa giải đủ để lấy hết chất phân tích và dung môi rửa giải thích hợp. (c), Đánh giá phương pháp chiết và làm sạch: dựa vào hiệu suất chiết (tỷ lệ) thu hồi (%R) trên mẫu nhiễm. Mẫu nhiễm đƣợc tạo ra từ mẫu trắng bằng phƣơng pháp thêm chuẩn. Chiết và làm sạch mẫu nhiễm theo phƣơng pháp đã nêu, phân tích bằng sắc ký xác định hiệu suất thu hồi. Phân tích sắc ký định tính và định lƣợng hóa chất BVTV 2.3.3. Quy trình phân tích mẫu Xây dựng quy trình chiết và làm sạch hóa chất BVTV trong mẫu rau quả 2.3.3.1. Chiết mẫu [8][11][12][23][24][27][31][35][50]: Cân 10g mẫu (m) chính xác tới 0,1mg vào ống ly tâm. Cho vào 40 ml acetone (V1), đồng nhất bằng thiết bị Ultra-Turrax với tốc độ 13500 vòng/phút trong 3 phút. Thêm lần lƣợt 20ml petroleum ether (V2), 20ml dichloromethane (V3) và cho 10g natri sulphat khan, đồng nhất 1 phút, ly tâm 30 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút. Lƣu dịch chiết. 2.3.3.2. Làm sạch dịch chiết bằng SPE pha đảo[8][11][12][23][27][32][33][37]: Sử dụng cột SPE C18: đổ 10 ml dung môi n-hexan cho chảy qua cột với tốc độ 1 ml/phút. Chuyển 8 ml dịch chiết (V4) trên cho vào cột đã hoạt hóa. Để dịch chảy tự nhiên, sau đó dùng 10 ml hỗn hợp dung môi n-hexan : acetone (5:1) (chia làm 2 lần) để rửa giải. Thu hồi dịch rửa giải, làm bay hơi dƣới luồng khí nitơ ở nhiệt độ 30 o C tới cắn. Hòa tan cắn trong 1 ml n-hexan (VE) rồi đem phân tích bằng GC-MS. 2.3.3.3. Tính toán kết quả Dùng đƣờng chuẩn để tính nồng độ của mẫu thử khi bơm vào máy (Cm) Dƣ lƣợng từng hóa chất thuốc BVTV (C) trong mẫu đƣợc tính theo công thức: P m V V VVV CkgmgC Em    4 321 )()/( Trong đó: Cm: Nồng độ của mẫu thử khi bơm vào máy, mg/ml 38 VE: Thể tích cuối dung dịch mẫu thử, ml V1: Thể tích dung môi acetone, ml V2 : Thể tích dung môi petroleum ether , ml V3 : Thể tích dung môi dichloromethane, ml V4: Thể tích pha hữu cơ đƣợc lấy ra để làm sạch, ml m : Khối lƣợng mẫu thử, g P: Độ tinh khiết của chất chuẩn, % 39 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ T ẢO LUẬN 3.1. Tối ƣu các điều kiện xác định OPs bằng GC-MS 3.1.1. Chọn điều kiện bơm mẫu Dựa vào các tài liệu tham khảo [38],[39],[42],[53],[58],[59] với hệ thống GC 6890 Plus ghép nối với khối phổ MS 5973N (Agilent), để phù hợp cấu hình máy và đạt đƣợc yêu cầu về độ chính xác, độ lặp lại của thiết bị, phù hợp với phân tích xác định dƣ lƣợng các hóa chất BVTV trong rau quả ở hàm