Luận văn Xây dựng cơ sở dữ liệu sinh học phân tử trong nhận dạng các loài động vật hoang dã phục vụ thực thi pháp luật và nghiên cứu đa dạng sinh học tại Việt Nam

vật hoang dã hoặc từ những người nuôi động vật làm cảnh trái phép. Một nỗ lực lớn khác của trung tâm là giáo dục người dân về tầm quan trọng của các loài linh trưởng bị nguy cấp, về sinh thái, tập tính và môi trường sống trong tự nhiên cũng như tính cấp bách của việc bảo tồn. Các nhân viên của Trung tâm phối hợp chặt chẽ với lực lượng kiểm lâm để thi hành luật bảo vệ động vật hoang dã. Vào năm 2004, Trung tâm cứu hộ có hơn 110 cá thể voọc, vượn và cu li thuộc 14 loài và phân loài. Sáu loài trong số này không được nuôi ở bất kỳ nơi nào trên thế giới và gần như cả 6 loài này rất khó bắt gặp trong tự nhiên.[3] *Tuyên truyền giáo dục và huy động sự hỗ trợ của người dân Hoạt động trên cơ sở tình nguyện, các thành viên của Mạng lưới Bảo vệ động vật hoang dã đã nỗ lực và tích cực tham gia tất cả các vấn đề liên quan đến lĩnh vực này. Một trong những trọng tâm của việc thực hiện bảo vệ động vật hoang dã là điều tra, kiểm tra, giám sát các cơ sở kinh doanh, nhằm đảm bảo làm cho họ tuân thủ đúng các quy định pháp luật về bảo vệ động vật hoang dã. Đồng thời nếu phát hiện các vi phạm nghiêm trọng, các thành viên sẽ thông báo ngay cho các cơ quan chức năng địa phương hoặc đường dây nóng miễn phí 1800-1522 để có biện pháp xử lý. Từ khi thành lập đến nay, Mạng lưới Bảo vệ động vật hoang dã đã phối kết hợp với Phòng bảo vệ động vật hoang dã của Trung tâm Giáo dục Thiên nhiên phát hiện, xử lý và thông báo tới cơ quan chức năng trên 3.000 vụ việc vi phạm về bảo vệ động vật hoang dã, hợp tác với các cơ quan chức năng giải cứu được hàng ngàn cá thể động vật, trong đó có nhiều loài đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam như: gấu, vượn hay voọc mũi hếch, vọc quần đùi....Hiện tại, Mạng lưới đã có hơn 2.800 tình nguyện viên, đa số là các bạn trẻ trên 32 tỉnh thành và 8 Câu lạc bộ thành viên đang hoạt động tại các thành phố lớn, các điểm nóng về buôn bán động vật hoang dã trên cả nước.[10] *Phối hợp và học hỏi kinh nghiệm của các tổ chức bảo vệ động vật hoang dã trên thế giới Bất chấp những biện pháp này, việc buôn bán động vật và thực vật hoang dã vẫn đang tiếp tục. Điều này là do thiếu những cán bộ thi hành luật được đào tạo, thiếu những nỗ lực về chính trị cũng như xã hội và thiếu nguồn lực, không có đủ luật pháp ở cấp nhà nước, và còn do lợi ích về kinh tế do nó đem lại quá lớn. Để đối phó với thực tế này, TRAFFIC- một chương trình giám sát buôn bán động vật và thực vật hoang dã thuộc Quỹ Động vật hoang dã Thế giới và IUCN, và Cục Kiểm lâm của Việt Nam thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã xây dựng một khung hành động chung vào đầu năm 2001 nhằm kiểm soát hoạt động về buôn bán động vật và thực vật hoang dã ở Việt Nam. Hơn 16 hoạt động đã xác định được đưa ra và được nhóm lại vào 4 mục tiêu chính: (1) củng cố khả năng của Chính phủ trong việc thực hiện và thi hành CITES và các luật có liên quan ở cấp nhà nước; (2) giảm nhu cầu sử dụng đối với các loài thuộc nhóm nguy cấp và bị đe dọa, chủ yếu thông qua giáo dục và nâng cao nhận thức của người dân; (3) nâng cao kiến thức về giám sát hoạt động buôn bán động vật và thực vật hoang dã, và (4) mở rộng việc khuyến khích về phát triển kinh tế hoặc những giải pháp thay thế đối với việc buôn bán động vật và thực vật trái phép và không bền vững. Những biện pháp có sự phối hợp giữa trong nước và quốc tế là cần thiết để đạt được mục tiêu cuối cùng: bảo vệ đa dạng sinh học của Việt Nam không bị khai thác quá mức do buôn bán động và thực vật hoang dã gây ra. [3] Việc tăng cường nỗ lực thực thi pháp luật trong thời gian thực hiện dự án đã đem lại kết quả đáng khích lệ: 88 vụ vi phạm pháp luật về buôn bán, tiêu thụ bị bắt giữ, 731 cá thể động vật rừng còn sống được giải cứu và thả lại về rừng, hơn 900kg thịt động vật hoang dã bị tịch thu và tiêu huỷ, xử phạt 178 triệu đồng (gần 9.000 USD), 1 giấy phép kinh doanh và nhiều tang vật khác bị thu giữ.[9] 1.3.2.Một số khó khăn trong việc thực hiện Mặc dù đã thực hiện nhiều biện pháp như trên nhưng vấn đề này hiện vẫn đang là đề tài nóng bỏng, đòi hỏi chúng ta có những hoạt động tích cực hơn để ngăn chặn hiệu quả tình trạng săn bắt, buôn bán động vật, thực vật hoang dã quý hiếm, bảo vệ môi trường. Những nỗ lực nhằm làm giảm hoạt động buôn bán này đang gặp trở ngại vì không có đủ nguồn lực tài chính, không đủ kiến thức để nhận biết các hoạt động trái phép và những loài thuộc nhóm nguy cấp và cả nhận thức hạn chế đối về tính chất nghiêm trọng của vấn đề này như thế nào. Theo báo cáo của WWF về số lượng cá thể tê giác, hổ và voi tại 23 quốc gia thuộc khu vực châu Á và châu Phi, Việt Nam là nước đứng đầu danh sách tội phạm buôn bán động vật hoang dã. Bà Elisabeth McLellan, Quản lý Chương trình Loài Toàn cầu của WWF phát biểu: “Đây là thời điểm mà Việt Nam cần phải nhận ra rằng chính việc tiêu thụ bất hợp pháp sừng tê giác đã gây ra nạn săn bắn trộm tại châu Phi và rằng chính phủ cần phải phá bỏ các đường dây buôn bán sừng tê giác bất hợp pháp. Việt Nam nên xem xét lại khung hình phạt đối với loại tội phạm này và ngay lập tức ngăn chặn thị trường tiêu thụ, bao gồm cả việc dỡ bỏ quảng cáo bán sừng tê giác trên Internet.” Có một số khó khăn chính khiến cho công tác ngăn chặn chưa đạt hiệu quả cao là: *Ý thức người dân còn thấp Nói về nhận thức của người dân ở đây chúng ta cần đề cập đến cả hai đối tượng là bọn buôn bán và những người tiêu thụ. Rõ ràng nếu không có một nguồn tiêu thụ khổng lồ là các nhà hàng và thực khách thì việc buôn bán động vật hoang dã sẽ không ác liệt như thế. Theo chị Nguyễn Vân Anh (điều phối viên động vật hoang dã, Trung tâm Giáo dục Thiên nhiên Việt Nam) thì có đến 50% sản lượng động vật hoang dã được tiêu thụ trong nước, còn lại chủ yếu xuất sang Trung Quốc và các nước Châu Âu khác. Đối tượng tiêu thụ đương nhiên là những người rất giàu và họ có thể là những cán bộ cấp cao nhưng có thể khẳng định một điều là họ có nhận thức kém và thiếu ý thức về việc bảo vệ động vật hoang dã. Các sản phẩm từ động vật hoang dã được tiêu thụ mạnh nhất là: sừng tê giác, mật gấu, cao hổ, thịt rùa, ba ba Không những thế nhiều người còn sử dụng để làm đồ trang trí, thể hiện đẳng cấp của mình. Theo báo cáo mới nhất của WWF về 23 quốc gia của châu Phi và châu Á vào nhóm các quốc gia đang phải đối mặt với mức báo động cao nhất của nạn săn bắn, vận chuyển và tiêu thụ bất hợp pháp ngà voi, sừng tê giác và các bộ phận của hổ thì Việt Nam được đánh giá là thị trường tiêu thụ sừng tê giác mạnh nhất. Năm 2011, có đến 448 cá thể Tê giác đã bị giết hại để lấy sừng tại Việt Nam, và đã mất thêm 262 cá thể khác cho đến thời điểm này năm nay.[6] Điều này có lẽ là do người dân Việt Nam tin rằng các sản phẩm này có tác dụng tăng cường sức khỏe và chữa trị một số bệnh nan y mặc dù chưa có nghiên cứu khoa học nào khẳng định điều này. *Công tác quản lý còn nhiều thiếu sót Có thể nói là mặc dù đã thực hiện nhiều biện pháp nhưng dường như vấn đề này vẫn chưa được các cơ quan chức năng quan tâm thích đáng tương ứng với tính cấp thiết của nó. Thứ nhất là việc tuyên truyền nhằm nâng cao ý thức người dân chưa được thực hiện thường xuyên và đúng mức.Bởi vậy người dân cũng chưa nhận thức được tầm quan trọng của việc bảo vệ. Ngoài ra chúng ta cũng mới chú trọng tới nguồn cung mà chưa chú trọng tới nguồn cầu. Đó chính là các nhà hàng và các thực khách. Trong khi việc tiêu dùng các sản phẩm từ thú hoang dã là vi phạm pháp luật, thì các nhà hàng bán thịt thú rừng vẫn mọc lên ở khắp nơi. Loại hình du lịch trang trại gấu ở Quảng ninh vẫn tiếp tục ngang nhiên hoạt động trong một thời gian dài, đón tiếp hàng trăm khách du lịch người Hàn Quốc đến xem chọc hút mật gấu và bán mật gấu cho họ để mang ra ngoài Việt Nam. Cho đến giờ các trang trại này vẫn không bị đóng cửa, các con gấu không bị tịch thu và các chủ trang trại không bị truy tố.[5] Thứ hai là việc xử lý các đối tượng vi phạm chưa nghiêm minh và triệt để, đôi khi đã vô tình tiếp tay cho bọn tội phạm. Hồi giữa năm 2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ban hành một công văn nhằm hướng dẫn chính quyền cấp tỉnh xử lý các vụ liên quan đến gấu, hổ và các loại động vật hoang dã nguy cấp khác đang bị nuôi nhốt trái phép trên cả nước. Theo một số chuyên gia, thì công văn này có thể được hiểu là cơ quan chức năng đã bật đèn xanh cho việc hợp pháp hóa hành vi sở hữu, nuôi nhốt các loài động vật hoang dã tại Việt Nam, kể cả những loài được bảo vệ trong nhóm 1B, tức là cực kỳ nguy cấp, theo nghị định 32 của Bộ. Căn cứ vào công văn này, người săn bắt hổ trái phép có thể hiểu là nếu anh ta thành công trong việc săn bắt và vật chuyển những con thú đó về nhà thì hình phạt nặng nhất anh ta có thể phải chịu là mức phạt tiền 30 triệu đồng khung hình phạt hành chính cao nhất do pháp luật quy định. Ngoài ra, chính phủ Việt Nam cũng cho thực hiện một số trường hợp bán đấu giá các loài động vật hoang dã nguy cấp tịch thu được. Việc này đã vô tình tiếp tay cho hoạt động buôn bán trái phép các loài thú quý hiếm.[5] Như vậy có thể thấy rằng chính ý thức kém của người dân và sự thiếu quan tâm của các cơ quan chức năng là trở ngại lớn nhất khiến cho công tác ngăn chặn buôn bán động vật hoang dã tại Việt Nam còn chưa đạt hiệu quả cao. Các loài động vật quí hiếm vẫn đang đứng trước nguy cơ bị săn bắt và tiêu thụ bất cứ lúc nào. Để khắc phục tình trạng này Đảng và nhà nước ta cần quan tâm và đầu tư hơn nữa cho công tác bảo vệ các loài động vật hoang dã. Đi đôi với việc tuyên truyền giáo dục để nâng cao ý thức người dân thì nhà nước cũng cần đầu tư nhiều hơn cho việc nghiên cứu các phương pháp để nhận dạng các loài bị cấm buôn bán cũng như kiểm soát chặt chẽ hơn các nguồn tiêu thụ để xử lý một cách triệt để. Liên quan tới vấn đề này thì có một khó khăn là làm sao để nhận biết được các loài khi nó đã không còn hình dạng ban đầu. Nếu không nhận dạng được thì chắc chắn chúng ta đã bỏ sót một lượng lớn tội phạm. 1.4.Tổng quan về phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nhận dạng loài 1.4.1. Giới thiệu phương pháp mã vạch ADN Nhằm tạo ra một công cụ hỗ trợ việc nhận dạng các loài phục vụ nghiên cứu đa dạng sinh học và ngăn chặn buôn bán trái phép động vật hoang dã các nhà khoa học thuộc nhóm nghiên cứu của dự án Mã vạch sự sống quốc tế (iBOL) đã thiết lập một thư viện các loài sinh vật có nhân chuẩn dựa trên một dạng phân tích mới gọi là mã vạch ADN. Công nghệ mã vạch ADN ra đời sẽ hứa hẹn một tương lai mới, nơi mà con người có thể cập nhật nhanh chóng các thông tin như tên, thuộc tính sinh học của bất cứ loài sinh vật nào trên trái đất. Phương pháp phân tích mã vạch ADN cũng sẽ là một công cụ quan trọng trong việc bảo tồn và theo dõi các loài có tác động xấu đến sức khỏe của con người cũng như lợi ích kinh tế từ chúng. Hiện tại, các nhà nghiên cứu đã thu thập được mã ADN của hơn 80.000 loài. Dự kiến đến năm 2015, thư viện sẽ có được danh mục ADN của khoảng năm triệu mẫu sự sống, đại diện cho 500.000 loài trên trái đất. Đây chỉ là một nhóm đáng kể trong tổng số 1,7 triệu loài mà con người biết đến hiện nay. Hy vọng công nghệ này sẽ thúc đẩy việc khám phá ra rất nhiều loài còn chưa được biết đến trên trái đất.[15] Phương pháp mã vạch phân tử là một kỹ thuật dùng để xác định đặc điểm của các loài sinh vật bằng cách sử dụng một trình tự ADN ngắn từ một vị trí gen tiêu chuẩn đã được kiểm chứng. Cũng giống như mô hình độc đáo của mã vạch trong nhận dạng sản phẩm, một mã vạch ADN là một mô hình duy nhất của trình tự ADN có thể sử dụng để nhận diện một thực thể sống. Mã vạch ADN ngắn, khoảng 700 nucleotit, có thể được sản xuất nhanh từ hàng nghìn mẫu vật và được phân tích rõ ràng trên các phần mềm máy tính. [15] Mã vạch ADN cho phép những người không phải chuyên gia nhận dạng các loài một cách khách quan, thậm chí từ những vật liệu nhỏ, bị hư hỏng và đã được chế biến công nghiệp. 1.4.2. Các ứng dụng của phương pháp mã vạch ADN Mã vạch ADN có thể giúp chúng ta đạt được nhiều mục tiêu phát triển thiên niên kỷ và đạt tới mục tiêu của công ước đa dạng sinh học. *Kiểm soát côn trùng trong nông nghiệp, giảm nghèo và đói Những mối hại do côn trùng làm cho người nông dân trên thế giới tiêu tốn hàng tỷ đô la mỗi năm. Phương pháp mã vạch ADN có thể cho phép xác định sâu bệnh ở bất kỳ giai đoạn nào của vòng đời, làm cho chúng ta dễ dàng kiểm soát chúng. Sáng kiến mã vạch Tephritid toàn cầu sẽ góp phần vào việc quản lý loài ruồi giấm và sẽ cung cấp cho thanh tra biên giới các công cụ để nhận dạng và dừng dịch ruồi qua biên giới.[14] *Nhận dạng vectơ bệnh tật Nhiều loại bệnh tật truyền nhiễm nguy hiểm nhất của con người và động vật như sốt sét lây truyền qua máu và các loài trung gian. Mã vạch ADN cho phép chúng ta không cần sử dụng phân loại học để nhận dạng các loài trung gian này, qua đó giúp chúng ta hiểu và kìm hãm sự phát triển của các loài côn trùng mang bệnh và các mầm bệnh. Một sáng kiến mã vạch toàn cầu về muỗi đang xây dựng một thư viện mã vạch tham khảo cái mà có thể hỗ trợ các cơ quan y tế công cộng trong việc khống chế các loài vật trung gian gây bệnh này tốt hơn và phụ thuộc ít hơn vào thuốc diệt côn trùng.[14] *Tính bền vững của môi trường Việc khai thác quá mức các nguồn tài nguyên như cá và cây lấy gỗ đang dẫn đến sự cạn kiệt, sự tuyệt chủng của các loài cũng như sự sụp đổ của các ngành kinh tế dựa vào chúng. Các nhà quản lý tài nguyên thiên nhiên có thể kiểm soát việc buôn bán bất hợp pháp các sản phẩm được chế biến từ chúng thông qua việc sử dụng mã vạch ADN.[14] *Bảo vệ các loài nguy cấp Việc thi hành pháp luật có thể sử dụng mã vạch ADN để nhận dạng các loài bị đe dọa đang được mua bán trái phép. Do vậy, mã vạch ADN đã góp phần quan trọng vào bảo tồn đa dạng sinh học.[14] *Kiểm soát chất lượng nước Nước uống đang ngày một trở thành nguồn tài nguyên quý giá. Chất lượng của các ao, hồ, sông, suối thường được ước lượng bằng cách nghiên cứu các vi sinh vật sống trong đó. Mã vạch ADN đang được sử dụng để xác định các loài chỉ thị này nếu không thì thật khó để xác định. Cơ quan môi trường có thể sử dụng phương pháp mã vạch để nâng cao việc đánh giá chất lượng nước, tạo ra và thực thi tốt hơn các chính sách đảm bảo cung cấp bền vững nguồn nước uống an toàn cho sức khỏe con người.[14] 1.4.3. Phương pháp mã vạch ADN ứng dụng trong nhận dạng các loài động vật hoang dã Ứng dụng công nghệ dựa trên ADN vào việc điều tra tội phạm buôn bán và tiêu thụ động vật hoang dã đã mở ra khả năng tăng cường hiệu quả thực thi pháp luật. Ví dụ trong trường hợp sử dụng kính kiển vi để xác định loài được cho là Linh dương Tây Tạng từ những chiếc khăn quàng được dệt, việc xác định tới cấp độ loài có thể được thực hiện bằng cách sử dụng việc xác định kiểu ADN nơi mà kết quả không dựa vào phán đoán chủ quan của người kiểm tra. [13] *Các bước thực hiện - Thu thập mẫu vật động vật hoang dã trong khu vực hoặc vùng lân cận. - Chiết xuất và tinh chế ADN từ mẫu mô hoặc vật liệu được chế biến. - Khuếch đại một khu vực cụ thể của gen lục lạp hoặc ty lạp thể bằng cách PCR và phân tích sản phẩm PCR bằng phản ứng điện li keo. - Sử dụng Blast (Basic Local Alignment Search Tool  ) để nhận diện các trình tự trong cơ sở dữ liệu. - Sử dụng các công cụ sắp xếp nhiều trình tự và xây dựng cây để phân tích các mối quan hệ phát sinh loài. * Vai trò của ADN Bộ gen ty thể ở tế bào nhân chuẩn có 37 gen, 22 gen mã hóa ARN vận chuyển (tARN), 2 gen mã hóa ARN ribosomal (rARN) và 13 gen khác mã hóa protein chủ yếu liên quan đến quá trình hô hấp oxi hóa. Số lượng gen trên hệ gen ty thể phần lớn là bất biến cho tất cả các hệ gen ty thể của các loài động vật có xương sống nhưng thứ tự của các gen có thể thay đổi. Thứ tự của các vị trí trên hệ gen ty thể thì tương tự nhau trong các loài động vật có vú nhưng có thể khác nhau giữa các bậc phân loại: ví dụ thứ tự khác nhau giữa gen ty thể của gia cầm và động vật có vú. [13] Một lý do chính cho việc sử dụng ADN ty thể (mtADN) là không có một sự tái tổ hợp của mtADN. Với tất cả các thành phần mã hóa của hệ gen ty thể mã hóa cho protein hoặc phân tử ARN liên quan đến hô hấp, người ta hi vọng rằng sẽ có một sự bảo vệ các trình tự khi bất kỳ một sự thay đổi nào ở protein hoặc phân tử ARN có thể tác động tiêu cực đến sinh vật. Không giống như hạt nhân, không có lỗi xảy ra trong việc đọc enzyme tồn tại trong ty thể để sữa chữa những gốc ADN được thêm vào một cách không chính xác trong suốt quá trình sao chép. Do vậy, sự tích tụ của những thay đổi cơ sở riêng lẻ trong ty thể là cao hơn gấp 5 lần so với những lỗi do sự sao chép trong hạt nhân. Ngoài ra có nhiều bản sao của ADN ty thể trên 1 tế bào so với 2 bản sao của ADN hạt nhân. Trong mỗi tế bào có nhiều ty thể phụ thuộc vào loại tế bào và trong mỗi ty thể có nhiều ADN ty thể. Các ty thể có một lớp protein để bảo vệ các mtADN khỏi sự phân hủy. Các vật liệu sinh học đã bị phân hủy cao , do đó, có khả năng tuân theo việc xác định kiểu mtADN nhiều hơn là sự cần thiết sinh ra một hồ sơ di truyền từ ADN hạt nhân khi xác định kiểu răng, xương hoặc tóc.[13] *Vị trí gen được sử dụng trong phân loại Các vị trí gen của sự lựa chọn cho nhận dạng pháp y các loài được dựa vào các nghiên cứu có nguồn gốc từ phân loại và cây phát sinh loài và chủ yếu được tìm thấy ở bộ gen ty thể. Trong phạm vi mtADN một số trình tự gen được cho là thể hiện ít sự biến đổi trong cùng chủng loại (trong các thành viên của cùng một loài) nhưng lại thể hiện đầy đủ sự biến đổi không trong chủng loại (giữa các loài khác nhau) để cho phép ước lượng về mức độ liên quan và số lần sai khác qua đồng hồ phân tử được hiệu chỉnh. Vị trí chính được sử dụng trong các nghiên cứu về phân loại và phát sinh chủng loại cho đến gần đây là gen cytocrome b (cyt b) cái mà xuất hiện giữa hai bazo 14747 và 15887 trong mtADN của người và mã hóa 1 protein có chiều dài 380 amino axit. Vị trí cyt b đã được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại và pháp y, bao gồm các bộ phận cơ thể của hổ, trứng rùa, vỏ và da cá sấu, sừng tê giác, ngà voi, con công trống , mật gấu. Gần đây hơn, việc sử dụng gen cytochrome c oxidase I (COI) đã tăng lên chủ yếu do sự thông qua của tổ chức mã vạch của sự sống (Barcod of life consortium- CBOL). COI được tìm thấy giữa các bazo 5904 và 7945 ở mtADN người. COI ban đầu được sử dụng để nhận dạng các loài động vật không xương sống. Chẳng bao lâu sau nó đã trở thành vị trí lựa chọn trong côn trùng học pháp y để nhận dạng ấu trùng bọ cánh cứng trên xác chết. Vì đây là một vị trí có thể nhận dạng những loài này, nó đã được sử dụng nhiều hơn với mục tiêu trở thành vị trí được lựa chọn cho nhận dạng tất cả các loài động vật.[13] Các vị trí gen khác trên hệ gen ty thể cũng đã được sử dụng trong nhận dạng một số loài. Chúng bao gồm các vị trí rARN 12s và 16s và họ gen NDH. D- loop (Displacement- loop) được sử dụng ít trong nhận dạng các loài nhưng nhiều hơn trong nhận dạng các loài trong cùng chủng loại. Bởi vì sự biến đổi lớn hơn ở các trình tự không được mã hóa, nó bây giờ đang được sử dụng như một công cụ để nhận dạng sự có mặt của một loài đặc biệt trong hỗn hợp nhiều loài khác nhau.[13] *Các vị trí gen ty thể sử dụng trong phân loại Quá trình nhận dạng các loài trong khoa học pháp y đang trở nên thường xuyên hơn nhưng vẫn chưa được chuẩn hóa tới một vị trí gen duy nhất. Bất chấp vị trí gen được sử dụng, quá trình tương tự không được biết, hoặc được đặt câu hỏi, mẫu vẫn được phân tích bằng cách khuếch đại một phần của gen, chủ yếu là một phần gen cyt b hoặc COI. Đoạn PCR (polymerase chain reaction) này sau đó được chạy trình tự một cách trực tiếp và trình tự ADN sẽ được so sánh với các trình tự ADN từ một ngân hàng dữ liệu mở như Genbank. Không chắc chắn rằng sẽ có một mẫu tham khảo từ một loài đã biết cho việc so sánh trực tiếp, vì vậy có một sự phụ thuộc vào dữ liệu trình tự ADN trên cơ sở dữ liệu. Genbank hiện có hơn 108 triệu trình tự (tháng 08/2009), và do đó, có một khả năng cao là mẫu chưa được biết sẽ phù hợp với một trình tự ADN từ một mẫu tham khảo được gửi lên cơ sở dữ liệu. Trong trường hợp có 100% sự tương đồng thì chúng ta có thể chắc chắn rằng mẫu không được biết là một thành viên của loài mà có trình tự ADN phù hợp với nó. Hình dưới đây chỉ ra sự tương thích của một trình tự của mẫu lấy từ khăn choàng được dệt từ lông của Linh Dương Tây Tạng (P. hodgsonii) với trình tự trên cơ sở dữ liệu của Genbank. Hình 14a và 14b dưới đây chỉ ra một phần nhỏ trình tự ADN gen cyt b và sự khác nhau cho 4 loài của chúng. Hình 14a chỉ ra cặp bazo 121- 241 của gen cyt b cho loài linh dương Tây Tạng (accession number AF034724) so với các loài động vật có vú với sự tương đồng gần nhất với một phần của trình tự; là cừu (Ovis aries: accession AB0068000), the Pyrenean Chamoix (Rupicapra pyrenaica: accession number AF034726) và một con dê (Capra sumatrensis: accession number AY669321). Trình tự chưa được biết đến từ một chiếc khăn choàng bị nghi ngờ là lấy từ bộ lông của linh dương Tây Tạng.[13] Hình 14b cho thấy số lượng cặp bazo sai khác giữa bốn loài (đáy của hình tam giác) và tỷ lệ phần trăm tương tự qua 120 cặp. Thông thường người ta thường sử dụng trên 400 cặp bazo để tìm kiếm sự tương tự nhưng trên đây là nghiên cứu thử nghiệm nên chỉ sử dụng 120 cặp. 121 131 141 151 161 171 181 Unknown1 TTGGTTTTACAAATCCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCTGATACAACA Pantholops TTGGTTTTACAAATCCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCTGATACAACA Ovis TTAATTTTACAGATTCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCCGACACAACA Rupricapra TTAATTTTACAGATCCTAACGGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCTGACACAACA Capra CTAATTCTACAAATCCTAACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGATACAACG 182 191 201 211 221 231 241 Unknown1 ACAGCATTCTCTTCTGTAACCCACATTTGCCGAGATGTTAACTATGGCTGAATTATTCGA Pantholops ACAGCATTCTCTTCTGTAACCCACATTTGCCGAGATGTTAACTATGGCTGAATTATTCGA Ovis ACAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGACGTGAACTATGGCTGAATTATCCGA Rupricapra ATAGCATTCTCCTCTGTAACCCACATTTGCCGAGATGTAAACTACGGCTGAATCATCCGA Capra ACAGCATTTTCTTCTGTAACACACATTTGCCGAGACGTAAACTATGGCTGAATTATCCGA Hình14a: Đoạn gen cyt b từ cặp bazo 121-241 của bốn loài và loài chưa biết. Pantholops Ovis Rupricapra Capra Unknown 1 Pantholops 90.00 91.67 90.84 100.00 Ovis 12 91.67 90.84 90.00 Rupricapra 10 10 88.33 91.67 Capra 11 11 14 90.84 Unknown 1 0 12 10 11 Hình 14b: So sánh số cặp bazo sai khác và % tương đồng qua 120 cặp bazo Sự sẵn có của những cơ sở dữ liệu ADN được truy cập mở đã mang đến nhiều thuận lợi nhưng cũng luôn tồn tại những rủi ro nhất định. Điều này là bởi vì những trình tự ADN được đăng ký ở Genbank đã không yêu cầu rằng mẫu trước tiên phải đến từ mẫu vật chứng từ ví dụ như các mẫu từ viện bảo tàng cái mà được coi như mẫu chứng từ đã đã được phát hiện là nhầm lẫn. Chẳng hạn như trong một nghiên cứu về nấm người ta đã phát hiện ra rằng có khoảng 20% các trình tự được đăng ký có thể bị xác định nhầm. Tuy nhiên các cơ sở dữ liệu trực tuyến và công cộng đang phát triển theo một tốc độ cấp số nhân, nhiều trình tự hơn sẽ được thêm vào cơ sở dữ liệu.và quan trọng hơn nhiều trình tự từ các loài giống nhau được thêm vào, điều này làm cho chúng ta dễ dàng nhận dạng hơn và có thể loại bỏ các trình tự nhầm lẫn. Nếu bất kỳ trình tự nào có sự sai khác lớn nhất với các trình tự khác thì trình tự khác thường này sẽ nằm ở cuối trong danh sách. Điều này không chỉ cho thấy lợi ích của việc có nhiều trình tự khác nhau cho cùng một loài mà còn chỉ ra khả năng sẽ nhận dạng nhầm nếu chỉ có một trình tự cho một loài cụ thể ở một vị trí gen cụ thể.[13] Nếu các trình tự ADN từ các mẫu không được biết cho thấy một sự phù hợp 100% với trình tự tham khảo cho P. hodgsonii và 84% với loài gần nhất tiếp theo thì có thể chắc chắn rằng mẫu chưa được biết chính là Linh Dương Tây Tạng. Sự chắc chắn này đã đặt ra câu hỏi mẫu đến từ Linh dương Tây Tạng và không phải là một số loài khác giả sử như: (1) tất cả các loài được đưa ra trên cơ sở dữ liệu và không có một loài nào có cùng trình tự ADN được phân tích, (2) tất cả các thành viên của Linh dương Tây Tạng có cùng một trình tự ADN như đã được đăng ký trên Genbank (không có biến dị trong cùng loài) và (3) dữ liệu trình tự cho loài gần nhất tiếp theo (theo hình trên là loài dê) cũng là đại diện cho loài này và không một thành viên nào của loài này, ngẫu nhiên, có trình tự tương tự như trình tự của mẫu được yêu cầu. Cho đến gần đây vẫn chưa có một nghiên cứu nào định lượng biến thể trong loài trong phạm vi các vị trí gen được sử dụng cho nhận dạng loài. Một nghiên cứu như vậy sẽ giải quyết các giả định trên và cung cấp một giá trị cho sự chắc chắn về sự phù hợp 100%. Nó cũng sẽ giải quyết vấn đề liên quan tới sự phù hợp 99% hoặc nhỏ hơn để xác định liệu bất kỳ sự biến đổi trình tự có phải là do biến dị trong loài hay không.[13] Trường hợp của cyt b và COI các việc thực hành nhìn chung là để khuếch đại một phần gen cho việc phân tích trình tự. Hơn nữa, nhiều mẫu được kiểm tra có thể ở dạng vết, có nhiều chất ức chế quá trình PCR, và bị phân hủy cao. Trong trường hợp đoạn cyt b của gen được sử dụng thông thường là 400 bazo đầu tiên và trong trường hợp sử dụng COI là khoảng 600 cặp và không ít hơn 500 bazo. *Sự biến đổi trong loài và khác loài gen Cyt b và COI Bằng cách sử dụng mô hình2 tham số Kimura (K2P- Kimura 2-parameter model), nhìn ch