Luận văn Xây dựng phương pháp đo tƣơng tác thụ thể và phối tử đặc hiệu không sử dụng phóng xạ phục vụ định hướng phát triển thuốc ở Việt Nam

t peptid khác [28]. Các thuốc ACE ngăn cản hoạt tính của men chuyển qua đó ngăn angiotensin I chuyển hóa thành angiotensin II. Trong khi đó các thuốc chẹn thụ thể angiotensin II (ARB) cạnh tranh vị trí liên kết của angiotensin II tại thụ thể của nó. Các thuốc ức chế men chuyển có các tác dụng phụ đó là: tăng kali máu, qua đặc tính giảm tiết aldosterone của ức chế men chuyển. Hạ đƣờng huyết do đặc tính nhạy cảm với insulin của ức chế men chuyển. Tƣơng tác với erythropoietin, ức chế men chuyển có thể ngăn cản một phần hoạt tính của erythropoietin, do đó làm thiếu máu. Suy giảm chức năng thận. Ho và co phế quản, đặc điểm là ho khan, từng cơn thƣờng vào buổi tối kèm cảm giác ngứa ở cổ họng. Thuốc chẹn thụ thể angiotensin II đẩy angiotensin II ra khỏi thụ thể AT1 do đó làm mất tác dụng của angiotensin II làm hạ huyết áp, đồng thời trong khi nồng độ angiotensin II tăng cao trong tuần hoàn làm chúng tác động lên đích thụ thể AT2, gây ra tác dụng hạ huyết áp theo con đƣờng thụ thể này. Do nguyên nhân là ngoài còn đƣờng men chuyển, angiotensin I còn có thể chuyển thành angiotensin II qua đƣờng men chymase và vài đƣờng khác; do đó thuốc chẹn thụ thể angiotensin II sẽ ngăn chặn angiotensin II hoàn toàn hơn so với ức chế men chuyển. Đồng thời có ít các tác dụng phụ hơn [4]. 1.5. Các phƣơng pháp nghiên cứu tƣơng tác thụ thể và phối tử 1.5.1. Tương tác phân tử thụ thể và phối tử Nhiều quá trình sinh hóa, thiết yếu cho hoạt động chức năng và tồn tại của tế bào và cơ thể, đƣợc điều khiển bởi hormone, các chất dẫn truyền thần kinh, cytokine và các phân tử truyền tin khác. Sự điều hòa bắt nguồn bởi sự tƣơng tác của các phân tử đƣợc tìm thấy trong tự nhiên với các thụ thể có trên màng tế bào hoặc có ở trong tế bào chất hoặc nhân tế bào. Trong các thí nghiệm in-vitro, thụ thể đƣợc sử dụng với các mục đích khác nhau, liên quan tới sàng lọc các thành phần hóa học mới hoặc để xác định và định lƣợng các thuốc trong mẫu sinh phẩm. Kỹ thuật này đƣợc gọi là receptor assay (phép thử thụ thể- hay thí nghiệm thụ thể). Các thụ thể trong các phân tích này có thể dễ dàng thu đƣợc từ các nguồn động vật khác nhau. Trong phép thử thụ thể, một phối tử đƣợc đánh dấu và chất phân tích sẽ cạnh tranh liên kết với thụ thể. Sau khi cân bằng, các phần liên kết và không liên kết của phối tử đánh dấu phải đƣợc phân tách. Có thể là bằng cách lọc hoặc bằng ly tâm, sau đó các phần đã liên kết và/hoặc phần không liên kết sẽ đƣợc định lƣợng. Với các nồng độ tăng dần của chất cần phân tích, lƣợng phối tử đánh dấu liên kết với thụ thể sẽ giảm. Đồ thị biểu diễn phần đã liên kết của phối tử đánh dấu với các nồng độ chất cần phân tích tƣơng ứng tạo nên đƣờng đồ thị ức chế, từ đó ái lực của chất phân tích với thụ thể có thể xác định đƣợc cũng nhƣ các nồng độ chƣa biết của chất phân tích đó cũng có thể xác định đƣợc. Một thông số định lƣợng cho thấy mối quan hệ về ái lực của các phối tử đánh dấu với một thụ thể đặc trƣng là hằng số phân ly cân bằng (Kd). Kd, cũng nhƣ số vị trí liên kết có ở trong vật liệu thụ thể - Bmax có thể đƣợc xác định bằng các thí nghiệm bão hòa (saturation experiment). Trong các thí nghiệm đó, nồng độ của phối tử đánh dấu tăng dần đƣợc ủ với một lƣợng protein xác định. Tƣơng tác của một phối tử đánh dấu với thụ thể đƣợc mô tả bằng phƣơng trình sau: L * + R ⇄ L* R (phƣơng trình 1.1) Trong đó L* là lƣợng phối tử đánh dấu, R là lƣợng thụ thể và L*R là lƣợng phức hợp đƣợc hình thành của phối tử đánh dấu với thụ thể. Từ đồ thị bão hòa, có thể tính đƣợc Bmax và nồng độ phối tử ở trạng thái bão hòa 50% của các vị trí liên kết của thụ thể là Kd. Bmax và Kd có thể tính đƣợc theo phƣơng trình: (phƣơng trình 1.2) Khi có một phối tử thứ 2, ví dụ nhƣ một chất phân tích, đƣợc thêm vào, tƣơng tác có thể đƣợc mô tả bằng phƣơng trình sau đây: A + L * + R ⇄ AR + L*R (phƣơng trình 1.3) Trong đó, A là lƣợng chất phân tích, và AR là lƣợng phức hợp đƣợc tạo thành của chất phân tích với thụ thể. Với các nồng độ khác nhau của chất phân tích (A), đồ thị tính toán đƣợc xác định. Lƣợng chất phân tích mà thay thế 50% phối tử liên kết với thụ thể thì đƣợc gọi là giá trị IC50. Giá trị này tỉ lệ nghịch với ái lực của chất phân tích với thụ thể. Hằng số ái lực của chất phân tích (Ki) có thể tính từ giá trị IC50 với phƣơng trình Cheng- Prusoff [15]: (phƣơng trình 1.4) 1.5.2. Các phương pháp nghiên cứu tương tác thụ thể - phối tử Receptor-ligand binding assays có thể đƣợc phân loại dựa theo sự cần hay không cần sự phân tách của các phối tử liên kết với các phối tử tự do hoặc dựa theo kỹ thuật xác định phối tử liên kết. Dựa theo tiêu chí đầu, có các loại phép thử đồng nhất và không đồng nhất. Các phép thử không đồng nhất (heterogeneous assays) đòi hỏi sự phân tách các phối tử tự do ra khỏi phần liên kết bằng cách lọc, ly tâm hoặc thẩm tách trƣớc khi đo. Trong khi đó các phép thử đồng nhất (homogeneous assays) không cần phân tách hoặc các bƣớc rửa trƣớc khi đo. Cách phân loại thứ 2, đƣợc chia thành kỹ thuật đo dựa vào đồng vị phóng xạ hay không sử dụng phóng xạ. Các kỹ thuật liên kết thụ thể-phối tử hoạt tính phóng xạ Các phép thử liên kết thụ thể - phối tử phổ biến nhất là dạng không đồng nhất và đã đƣợc phát triển sử dụng các phối tử đƣợc đánh dấu phóng xạ để liên kết với thụ thể màng. Phƣơng pháp định lƣợng sử dụng phóng xạ đầu tiêu đƣợc phát triển bởi Lefkowitz và cộng sự [29]. Nguyên lý là dựa trên tƣơng tác cạnh tranh giữa một phối tử đƣợc đánh dấu phóng xạ và chất phân tích với cùng một vị trí liên kết với thụ thể. Một thuận lợi chính của các phép thử liên kết thụ thể sử dụng phóng xạ là độ nhạy cao, tính đặc hiệu và dễ thực hiện. Phép thử chỉ đòi hỏi một bƣớc đánh dấu phóng xạ cho phối tử đặc hiệu, thƣờng không làm giảm ái lực với thụ thể. Các phối tử có ái lực cao với thụ thể có sẵn trên thị trƣờng cho phép xây dựng một phép thử một cách nhanh chóng. Tuy vậy, hạn chế chính của những phép thử này là sử dụng đồng vị phóng xạ và cần tách phối tử tự do ra khỏi phần đã liên kết, điều này làm cho những thí nghiệm này tốn công sức và khá chậm. Hơn nữa, chúng đòi hỏi rằng sự phân ly của phối tử diễn ra chậm hơn nhiều so với thời gian thực hiện bƣớc phân tách (nhƣ lọc). Để không phải thực hiện bƣớc phân tách phối tử tự do, hiên nay đã phát triển đƣợc kỹ thuật đồng nhất (homogeneous assay) dựa trên scintillation proximity [16]. Tuy vậy, việc sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ có những nhƣợc điểm cố hữu, đó là chi phí cao, có hại đến sức khỏe, vấn đề về chất thải phóng xạ đòi hỏi yêu cầu giấy phép đặc biệt, và đặc biệt là ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Việt Nam, các vấn đề đó càng trở nên rõ nét. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã cố gắng để phát triển các phép thử thụ thể đánh dấu không sử dụng đông vị phóng xạ. 1.5.3. Các phép thử thụ thể - phối tử không sử dụng phóng xạ Nhiều phƣơng pháp khác nhau đã đƣợc sử dụng để phát triển các phép thử không sử dụng đồng vị phóng xạ, bao gồm các các phép thử không đồng nhất cho đến các phép thử đồng nhất. Nhƣ dựa trên chuyển năng lƣợng cộng hƣởng huỳnh quang (fluorescence resonance energy transfer - FRET), phân cực huỳnh quang (fluorescence polarization - FP) và đếm tế bào theo dòng (flow cytometry). Hầu hết các phép thử này đều đòi hỏi một số loại phân tử đánh dấu, gắn vào để đo liên kết phối tử - thụ thể. Do vậy điều mấu chốt là tìm đƣợc các điều kiện gắn nhãn (đánh dấu) mà không làm ảnh hƣởng đến sự tƣơng tác phân tử. Trong trƣờng hợp phối tử đƣợc gắn nhãn không có hoạt tính phóng xạ, phối tử phải đƣợc chứng minh là có các đặc tính liên kết tƣơng tự (về tính đặc hiệu với thụ thể, và ái lực) là tƣơng tự hoặc đƣợc cải tiến về độ nhạy nhƣ là các phối tử đƣợc đánh dấu phóng xạ. Các phép thử không đồng nhất. Một trong những phép thử đầu tiên sử dụng chất đánh dấu huỳnh quang đƣợc mô tả bởi McCabe, Takeuchi và Janssen [26, 44] đã sử dụng RP-HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo) với đầu dò huỳnh quang. Phƣơng pháp của Takeuchi đo phân đoạn tự do của phối tử với RP-HPLC ngay sau khi ly tâm. Điều này cần một lƣợng lớn thụ thể để đạt đƣợc mức liên kết đặc hiệu cho phép có thể đo đƣợc sự thay đổi trong tín hiệu huỳnh quang. Phƣơng pháp của Janssen và cộng sự thực hiện đo phần phối tử đã liên kết với thụ thể, do đó cần thêm bƣớc phá vỡ liên kết thụ thể và phối tử sau khi ly tâm để thu đƣợc phối tử gắn huỳnh quang từ thụ thể trƣớc khi đo bằng RP-HPLC. Việc đo trực tiếp phần phối tử liên kết thì đem lại kết quả chính xác hơn, và không đòi hỏi lƣợng lớn thụ thể và phối tử. Cách khác để giảm tín hiệu nền đƣợc trình bày bởi Takeuchi [44], ngƣời đã sử dụng time-resolved fluorescence (TRF), bằng cách gắn nhãn europium chelate cho phối tử benzodiazepine. Sau khi ly tâm, dịch nổi đƣợc chuyển tới 1 vi phiến và fluorescence đƣợc tăng cƣờng và ổn định, trƣớc khi đo, bằng cách bổ sung phối tử huỳnh quang tăng cƣờng. Các ví dụ khác của phƣơng pháp không sử dụng phóng xạ dựa trên gắn nhãn enzym và đo tƣơng tác của thụ thể-phối tử thông qua hoạt tính của enzym liên kết với phối tử. Mahoney [33] đã gắn biotin vào thụ thể yếu tố tăng trƣởng có nguồn gốc tiểu cầu (PDGF-R platelet-derived growth factor receptor), thụ thể này đƣợc gắn vào đáy đĩa, và đƣợc xác định thông qua sự bổ sung neutravidin-HRP vào đĩa, thực hiện phản ứng kháng nguyên – kháng thể và phản ứng màu enzym để thu kết quả. Hiện nay, phƣơng pháp sử dụng phối tử đƣợc đánh dấu huỳnh quang trong các nghiên cứu liên kết thụ thể ngày càng đƣợc sử dụng phổ biến. Bên cạnh các phối tử đặc hiệu đánh dấu huỳnh quang còn các chất đánh dấu khác nhƣ biotin. Các phối tử này đã đƣợc sử dụng rất thành công trong các nghiên cứu về tƣơng tác thụ thể - phối tử nói chung và trong các nghiên cứu sàng lọc thuốc nói riêng. 1.5.4. Sử dụng phối tử đánh dấu fluorescein Fluorescein là một chất hữu cơ tổng hợp, đƣợc sử dụng rộng rãi trong sinh học để làm chất đánh dấu cho các phân tử trong nhiều ứng dụng. Fluorescein cũng đƣợc gắn vào các phân tử có hoạt tính sinh học (nhƣ kháng thể), cho phép các nhà nghiên cứu có thể nghiên cứu đƣợc các protein đích đặc hiệu hoặc nghiên cứu các cấu trúc trong tế bào. Fluorescein cũng có thể đƣợc gắn với các nucleotide triphosphate để tạo thành probe trong lai tại chỗ. Các ứng dụng khác có thể kể tên là mốc hiệu phân tử (molecular beacon), hoặc làm đích của các kháng thể sử dụng hóa miễn dịch [36]. Trong miễn dịch, các phân tử kháng nguyên đánh dấu fuorescein cũng đƣợc sử dụng, và cho kết quả tốt. Hệ thống kháng nguyên – kháng thể kháng fluorescein và các dẫn xuất của fluorescein (nhƣ FITC) đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học, với rất nhiều ứng dụng nhƣ trong kết tủa miễn dịch (Immunoprecipitation), lai Western Blotting [27, 41] cùng các kỹ thuật trong miễn dịch huỳnh quang. Fluorescein đƣợc đánh giá là một phân tử đánh dấu không có hoạt tính phóng xạ mới, có thể sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp giúp thay thế cho các chất đánh dấu có hoạt tính phóng xạ truyền thống [31]. Hệ thống kháng nguyên kháng thể này đã đƣợc công nhận là có độ nhạy cao và thay thế cho các phƣơng pháp sử dụng biotin-streptavidin sử dụng cho các phân tích miễn dịch hấp thụ liên kết enzym (ELISA - enzym-linked immunosorbent assays) [23]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu thực hiện phép thử không sử dụng phối tử đánh dấu phóng xạ. Angiotensin II gắn thêm gốc fluorescein (F-AT II) (hợp chất này đƣợc cung cấp bởi nhiều công ty hóa chất trên thế giới) đƣợc chúng tôi sử dụng để thực hiện nghiên cứu này để thay thế cho phối tử đánh dấu phóng xạ đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu trƣớc đó. Đầu N của phân tử angiotensin II đƣợc đánh dấu (gắn thêm) gốc huỳnh quang fluorescein (fluorescein- angiotensin II hay viết tắt là F-AT II). Đây là một hợp chất là công cụ hữu ích ứng dụng trong nghiên cứu sinh học, giúp hiển thị sự phân bố của các thụ thể angiotensin II [30] cũng nhƣ trong phân tích đếm tế bào theo dòng (flow cytometric) của quá trình nhập bào (endocytosis) của angiotensin II [21]. Các nghiên cứu trên cũng chỉ ra rằng tƣơng tác tác của phối tử đƣợc gắn thêm gốc fluorescein cho kết quả không khác biệt nhiều về mặt ái lực của phối tử với đích thụ thể. Phƣơng pháp để xác định F-AT II đã liên kết với thụ thể trong các thí nghiệm là phƣơng pháp ELISA cạnh tranh, với kháng thể là kháng thể kháng fluorescein. Trong đó, kháng nguyên fluorescein-BSA (F-BSA) đƣợc cố định trên bề mặt đĩa 96 giếng, và sự cạnh tranh giữa F-AT II với F-BSA với kháng thể kháng fluorescein sẽ giúp xác định đƣợc lƣợng F-AT II trong các phản ứng liên kết thụ thể angiotensin II và phối tử của nó (F-AT II). Sơ đồ thí nghiệm ELISA cạnh tranh đƣợc mô tả trong hình 1.7 [14]. Hình 1.7. Minh họa phản ứng ELISA cạnh tranh. (Ag: kháng nguyên, Ab: kháng thể, E: enzym). (Nguồn: Current Protocols in Molecular Biology). 1.6. Y học cổ truyền và tài nguyên dƣợc liệu Những hóa thạch ghi lại thời gian con ngƣời sử dụng thực vật làm thuốc ít nhất là ở giữa thời kỳ Đồ đá cũ (Middle Paleolithic) khoảng 60.000 năm trƣớc [43]. Theo WHO, 65% dân số thế giới sử dụng phƣơng thức chăm sóc sức khỏe chính là sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên, đƣợc sử dụng trong đời sống hằng ngày, trải qua lịch sử lâu đời và đƣợc truyền lại qua các thế hệ với nền văn hóa riêng; đƣợc gọi là y học cổ truyền. Vậy y học cổ truyền là gì? 1.6.1. Vài nét về y học cổ truyền Có kháng nguyên cạnh tranh Không có kháng nguyên cạnh tranh Phủ đĩa với kháng nguyên (F-BSA) Ủ kháng thể gắn enzyme, có hoặc không có kháng nguyên cạnh tranh (F-AT II) Bổ sung cơ chất và đo tín hiệu màu Kháng nguyên cần đo (F-AT II) Kháng nguyên phủ đĩa (F-BSA) Ag Theo WHO [48], Y học cổ truyền là tổng hợp của kiến thức, kỹ năng và thực hành dựa trên các lý thuyết, niềm tin và kinh nghiệm bản địa với các nền văn hóa khác nhau đƣợc sử dụng để duy trì sức khỏe, cũng nhƣ để ngăn ngừa, chẩn đoán, cải thiện hoặc điều trị các bệnh về thể chất và tinh thần. Y học cổ truyền đƣợc sử dụng bởi những quần thể khác nhau (bên cạnh văn hóa bản địa) sử dụng sản phẩm thảo dƣợc gồm có các thảo dƣợc, các vật liệu thảo dƣợc, dƣợc thảo và các sản phẩm thành phẩm có chứa các bộ phận của thực vật hay các vật liệu thực vật khác làm thành phần hoạt tính. Nền y học cổ truyền là một thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ nền y học truyền thống nhƣ y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn Độ, Ả rập và các hình thức khác nhau của y học bản địa. Các liệu pháp y học cổ truyền bao gồm các liệu pháp y dƣợc nếu chúng sử dụng thuốc có nguồn gốc thực vật, các bộ phận của động vật hoặc chất khoáng – và các liệu pháp không sử dụng thuốc – nhƣ châm cứu, các liệu pháp bằng tay, và tâm linh. Ở nhiều nƣớc có hệ thống chăm sóc sức khỏe phát triển mạnh dựa trên thuốc tân dƣợc hoặc nơi mà y học cổ truyền không đƣợc hợp thành vào hệ thống chăm sóc sức khỏe quốc gia, y học cổ truyền thƣờng đƣợc gọi là thuốc bổ trợ, thay thế hoặc không phổ biến (CAM – complementary and alternative medicine). Ở một số quốc gia châu Á và châu Phi, 80% dân số phụ thuộc vào y học cổ truyền để chăm sóc sức khỏe ban đầu. Ở châu Á và Mỹ La tinh, ngƣời dân tiếp tục sử dụng YHCT nhƣ là kết quả của lịch sử và tín ngƣỡng văn hóa. Ở Trung Quốc, YHCT chiếm khoảng 40% tổng số các hoạt động chăm sóc sức khỏe. Trong khi đó, ở nhiều nƣớc phát triển, CAM đang trở nên ngày càng phổ biến. Tỉ lệ phần trăm trong dân số sử dụng CAM ít nhất một lần là 48% ở Úc, 70% ở Canada, 42% ở Mỹ, 38% ở Bỉ và 75% ở Pháp. Phƣơng pháp điều trị thảo dƣợc là những hình thức phổ biến nhất của y học cổ truyền, và sinh lợi cao trên thị trƣờng quốc tế. Doanh thu hàng năm ở Tây Âu đạt 5 tỷ USD trong năm 2003-2004. Ở Trung Quốc doanh số bán hàng của các sản phẩm đạt 14 tỷ USD vào năm 2005. Doanh thu thuốc thảo dƣợc ở Brazil là 160 triệu USD trong năm 2007 [18]. 1.6.2. Y học cổ truyền và nguồn tài nguyên thiên nhiên trong nền y học hiện đại Số lƣợng các loài thực vật bậc cao trên hành tinh này đƣợc ƣớc tính khoảng 250.000 loài [5]. Mới chỉ khoảng 6% đƣợc sàng lọc hoạt tính sinh học, và khoảng 15% đã đƣợc đánh giá về mặt hóa học thực vật. Thực vật có 1 lợi thế to lớn trong lĩnh vực này dựa trên việc sử dụng lâu dài của chúng trong lịch sử loài ngƣời, với nền y học cổ truyền hàng nghìn năm. Trong lịch sử, thực vật là nguồn cung cấp cho các chất làm thuốc mới, vì thuốc có nguồn gốc thực vật có những đóng góp lớn tới chăm sóc sức khỏe và làm cho cuộc sống tốt đẹp lên. Vai trò của chúng trong việc phát triển thuốc mới có thể bằng cách cung cấp các hợp chất tự nhiên, hoặc là các thuốc thực vật đƣợc sử dụng để điều trị bệnh tật. Ngƣời ta ƣớc tính rằng, các nguyên liệu thực vật đã cung cấp mô hình cho 50% các thuốc tây. Nhiều loại thuốc đã đƣợc chứng minh thƣơng mại đƣợc sử dụng trong y học hiện đại đã bƣớc đầu đƣợc sử dụng ở dạng thô trong thực tế chữa bệnh truyền thống hoặc dân gian. Từ đầu thế kỷ 19, một số lƣợng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật đã đƣợc tìm thấy để có ứng dụng thƣơng mại làm thuốc. Gần đây, đã có một sự bùng nổ quan tâm trong việc sử dụng thực vật đƣợc sử dụng dân gian nhƣ là nguồn của các hợp chất có khả năng hữu ích. Một số phân tử nhỏ mới của các thuốc có nguồn gốc tự nhiên đã đƣợc đƣa vào điều trị ở các nƣớc phƣơng Tây trong những năm gần đây, bao gồm acarbose, artemether, capsaicin, docetaxel, dronabinol, galanthamine, irinotecan, paclitaxel, tacrolimus, and topotecan. Xu hƣớng này tiếp tục đƣợc quan tâm trong tƣơng lai, ít nhất trong điều trị các bệnh nhƣ ung thƣ, bệnh truyền nhiễm. Trong một thống kê gần đây, chỉ ra là nguồn gốc của hơn 30000 các sản phẩn tự nhiên có hoạt tính sinh học có thể đƣợc phân loại giữa các động vật (31%), vi khuẩn (13%), nấm (33%) và thực vật bậc cao (27%) [17]. Các bằng chứng về tầm quan trọng của cá sản phẩm tự nhiên đƣợc cung cấp bởi thực tế rằng, một nửa trong số các dƣợc phẩm bán chạy nhất vào năm 1999 là các sản phẩm từ tự nhiên hoặc dẫn xuất của chúng. Hiện nay, chiến lƣợc sàng lọc thuốc mới dựa trên nguồn tài nguyên thiên nhiên đang là hƣớng đi thành công nhất, thực vật chính là nguồn quan trọng nhất giúp cho các nhà khoa học nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học mới. Tìm kiếm thuốc mới từ thực vật đòi hỏi sự phối hợp giữa các nhà thực vật học, dƣợc học thực vật và các khoa học khác, đƣợc bổ sung những lợi thế của các quan sát về thực vật bản địa (ethonobotanical), vì nhiều loài thực vật đã đƣợc sử dụng trong nền YHCT. Đó là sự kết hợp của chọn lọc tự nhiên trải qua hàng triệu năm tồn tại cùng với lịch sử kinh nghiệm sàng lọc, thử nghiệm của con ngƣời trong tƣơng tác với tự nhiên thể hiện qua y học cổ truyền. 1.6.3. Y học cổ truyền Việt Nam và nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam là một quốc gia với nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú và đa dạng, Việt Nam xếp thứ 16 trong 25 quốc gia có mức độ đa dạng sinh học cao nhất thế giới, chiếm 6,5% số loài thực vật trên toàn thế giới, với nhiều nhóm sinh vật có tính đặc hữu cao, có giá trị khoa học và thực tiễn lớn. Theo thống kê, hơn 13.200 loài thực vật và khoảng 10.000 loài động vật đã đƣợc xác định [20]. Đó là nguồn tài nguyên vô tận, có tiềm năng rất lớn nếu chúng ta biết sử dụng hợp lý chúng. Theo điều tra của Viện dƣợc liệu (NIMM), giai đoạn 1961-2005, Việt Nam có 3.948 loài thực vật, 408 loài động vật, 75 khoáng vật và 52 loài tảo đã đƣợc sử dụng là nguồn nguyên liệu làm thuốc. Những nguyên liệu làm thuốc đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong nền y học cổ truyền tại Việt Nam, với hơn 3800 bài thuốc đã biết, và còn hàng nghìn bài thuốc lƣu truyền trong dân gian, đặc biệt là trong cộng đồng các dân tộc thiểu số. Hiện nay, 75% ngƣời Việt Nam sử dụng y học cổ truyền nhƣ là nguồn điều trị chính cho vấn đề sức khỏe thông thƣờng [37]. Tuy nhiên, gần nhƣ tất cả các loại thuốc truyền thống chƣa đƣợc đánh giá chính xác về mặt khoa học, và các thành phần cũng nhƣ cơ chế hoạt động của chúng đã không đƣợc phát hiện rõ ràng. Đây cũng là một tiềm năng để đi sâu nghiên cứu sàng lọc và xác định các chất hoạt động sinh học, qua đó tạo ra các loại thuốc mới có tác dụng điều trị tốt. Với lịch sử lâu dài trong sử dụng thuốc YHCT, sự đa dạng rất lớn nguồn thực vật, động vật và khoáng vật làm thuốc cùng với các hợp chất có hoạt tính sinh học có thể có ý nghĩa vô cùng quan trọng, là nguồn tài nguyên vô giá trong nghiên cứu phát triển thuốc trong tƣơng lai. 1.6.4. Bệnh cao huyết áp trong YHCT, và một số loài cây thuốc được sử dụng Trong YHCT, tăng huyết áp là một chứng bệnh thuộc phạm vi chứng huyễn vựng, đầu thống, can dƣợng vƣợng [3]. Nguyên nhân và cơ chế sinh bệnh: là do các yếu tố chính sau: - Yếu tố tình chí: do tình chí căng thẳng lâu ngày, tình chí không thƣ thái, lo nghĩ tức giận khiến can khí nội uất, uất hóa hỏa làm hoa tổn can âm. Am không liễm đƣợc dƣơng, can dƣơng nhiễu loạn lên trên làm đau đầu, mắt đỏ, xuất hiện những cơn bốc hỏa. Can và thận có quan hệ mật thiết với nhan, hỏa nung đốt phần âm của can thận dẫn đến can thận âm hƣ, can dƣơng vƣợng. - Yếu tố về ăn uống: do ăn uống nhiều chất các chất ngọt béo làm tổn thƣơng tì vị khiến chức năng vận hóa của tì suy giảm dẫn tới đàm thấp nội sinh nên phát bệnh, hoặc uống nhiều rƣợu làm thấp trọc sinh ra lâu ngày hóa nhiệt, nhiệt nung nấu tân dịch thành đàm, đàm lại làm rối loạn chức năng kiện vận của tì vị làm thanh dƣơng bất thăng, trọc âm bất giáng mà gây nên chứng huyễn vựng. Phƣơng pháp chữa tăng huyết áp dựa vào các nguyên nhân bệnh gây ra: hạ hƣng phấn (bình can tiềm dƣơng, an thần), giãn mạch (hoạt huyết), lợi niệu. Các bài thuốc, cây thuốc chữa cao huyết áp trong YHCT trích từ “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” của Đỗ Huy Bích và cộng sự [1]. 1.6.4.1. Cỏ mần trầu Cỏ mần trầu có tên khoa học là Eleusine indica (L.) Gaerth., các tên gọi khác của cỏ mần trầu là màng trầu, thanh tâm thảo, cỏ chỉ tía, Là cây thân thảo nhỏ, sống hằng năm, mọc sum suê thành cụm. Thân phân nhánh, mọc bò dài sau thẳng đứng, cao 30 – 50 cm. Lá mọc so le, hình dải hẹp, xếp thành hai dãy cách nhau, đầu thuôn nhọn. Cụm hoa mọc trên một cán dài ở ngọn thân, gồm 5 -7 bông xếp toả tròn và 1 – 2 bông khác tách rời, mọc thấp hơn; bông mảnh phẳng, mang hai dãy bong nhỏ xếp đều đặn, bông nhỏ không có cuống, nhẵn, có 3 – 5 hoa. Hình 1.8. Cỏ mần trầu - Eleusine indica (L.) Gaerth. (Nguồn: Internet). Phân bố rộng, từ vùng đồng bằng, trung du đến vùng núi cao hơn 1600 m. Là loại cây ƣa ẩm, ƣa sáng và có thể hơi chịu bóng, thƣờng mọc thành đám trong các bãi đất thấp ở thung lũng, ruộng ngô và quanh làng bản. Thành phần hóa học: có chứa 3 – 0 – β – D – glucopy ranosyl - β – sitosterol và dẫn chất 6‟ – 0 – palmitoyl ( CA 123: 76.639y). Cành, lá tƣơi có flavonoid (TDTH, I, 1073). Cỏ mần trầu đƣợc dùng theo kinh nghiệm dân gian chữa cao huyết áp, cảm nắng, nổi mẩn, đái són, lợi tiểu. 1.6.4.2. Hạ khô thảo Tên khoa học là Prunella vulgaris L., thuộc họ bạc hà. Là cây thân thảo, sống nhiều năm, cao 20 – 30 cm. Thân đứng hình vuông, màu đỏ tím. Lá mọc đối, hình trứng hoặc mác, gốc thuôn, đầu nhọn hoặc hơi tù dài 4 – 5 cm, rộng 1,2 – 1,5 cm, có ít lông, mép nguyên hoặc hơi có răng cƣa. Cụm hoa mọc ở đầu cành thành bông xim co, hình trụ dài 2 - 3 cm, lá bắc có màu tím đỏ ở mép; hoa nhỏ mọc thành nhiều vòng sít nhau; đài hình chuông chia hai môi, môi trên rộng, có 3 răng, môi dƣới xẻ sâu thành hai thùy; tràng màu tím cũng có 2 môi, môi trên nhƣ cái mũ, môi dƣới xẻ 3 thùy, thùy giữa lớn hơn hơi có răng; nhị 4, 2 dài, 2 ngắn mọc thò ra ngoài tràng. Quả nhỏ, cứng, mùa hoa quả tháng 4 – 6. Chỉ gặp ở một số nơi thuộc vùng núi cao, từ 1000 m trở lên nhƣ Tam Đảo (Vĩnh Phúc); Sa Pa, Mƣờng Khƣơng, Bát Sát, Bắc Hà (Lào Cai); Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ (Hà Giang). Hình 1.9. Hạ khô thảo - Prunella vulgaris L. (Nguồn : internet). Hạ khô thảo là cây ƣa ẩm và ƣa sáng, thƣờng mọc thành đám trên đất ẩm nhiều mùn gần bờ suối, trong thung lũng. Cây thích nghi với điều kiện khí hậu ẩm mát quanh năm, ở vùng nhiệt đới núi cao có nhiệt đới trung bình dƣới 200C. Mùa đông, phần thân cành trên mặt đất tàn lụi, phần thân rễ nằm sát mặt đất có thể chịu đựng đƣợc nhiệt độ tới 00C, đến thàng 3 -4 năm sau tái sinh chồi trở lại. Hạ khô thảo ra hoa quả hàng năm. Hạ khô thảo có tác dụng hạ huyết áp khá mạnh trên động vật bình thƣờng hoặc đã đƣợc gây cao huyết áp thực nghiệm, đồng thời có tác dụng co mạch. Các muối vô cơ trong nƣớc sắc hạ khô thảo tiêm tĩnh mạch cho thỏ, gây hạ huyết áp, kích thích hô hấp và lợi tiểu. Các chất tan trong nƣớc của hạ khô thảo có tác dụng hạ huyết áp lâu dài trên bệnh nhân và làm hết các triệu chứng của bệnh cao huyết áp. 1.6.4.3. Hòe – tên khoa học Sophora japonica L. Còn có tên gọi khác là hòe hoa,