Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC.i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.iv

DANH MỤC CÁC BẢNG.vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.viii

DANH MỤC PHỤ LỤC.ix

MỞ ĐẦU.1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN.3

2.3. RONG BIỂN.3

1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển .3

1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển.4

1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển .5

1.2 FUCOIDAN .6

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan .6

2.3.1. Thành phần của fucoidan trong rong nâu .7

1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan.9

1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu.13

1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan .15

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN.20

1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường .20

1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết.21

1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR).22

1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).23

pdf120 trang | Chia sẻ: mimhthuy20 | Lượt xem: 550 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan [5, 69]. Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate và axít uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 3.1), dao động trong khoảng 20,40-33,15% so với lượng mẫu phân tích, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong S.mcclurei (33,15%) và nhỏ nhất là fucoidan chiết từ rong S.swartzii (20,40%), theo các tài liệu 50 đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường,... trong đó hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của fucoidan [34,38,69]. So với fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc,... [23,24,48,92,129,142] thì fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn và hàm lượng uronic axít cao hơn. Fucoidan phân lập từ rong Turbinaria ornata có hàm lượng fucose cao nhất là 55,8%, trong khi đó fucoidan phân lập từ một số loài rong nâu của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica và Laminaria cichorioides có hàm lượng fucose lần lượt là 88%, 86% và 100% [142], hay fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80% [109], fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brasil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại fucoidan duy nhất được bán thương mại bởi hãng hóa chất Sigma (Mỹ) được chiết từ rong Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100% [69]. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brasil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác [23-25,42,142]. Trong khi đó fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose, [27,48,55,56,72,96,110,122]. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysacarit của rong nâu. 51 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn Fucoidan chiết từ hai loài rong S.denticapum và S.binderi có tỉ lệ các gốc đường fucose/galactose/mannose/xylose gần giống nhau và không có gốc đường glucose trong phân tử điều này có thể dự đoán về khung monosacarit trong hai loại fucoidan này là giống nhau, các mẫu fucoidan đều có chứa đồng thời cả 5 gốc đường với các tỉ lệ khác nhau chứng tỏ các fucoidan này có cấu trúc rất phức tạp và độ lặp lại không cao. Theo cách phân loại mới nhất về fucoidan thì các mẫu fucoidan này được gọi là fucogalactose sulfate [69,98,109]. Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác định các đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trưng cấu của chúng. 3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbinaria ornata được chúng tôi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân tích các đặc trưng 52 cấu trúc của chúng. Vì đây là những loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và có khả năng khai thác ở quy mô công nghiệp. Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) được chỉ ra trên hình 3.2-hình 3.6. Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%)* Tổng carbohydrate (%)* SO4 2- (%)* Fuc Man Gal Xyl Glc SdF1-0,5 М NaCl 17,2 48,04 23,67 38,6 22,1 24,6 14,7 nd SdF2-1,0 М NaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 nd SdF3-1,5 М NaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 nd *: tính theo khối lượng mẫu fucoidan nd: không phát hiện thấy Kết quả phân đoạn fucoidan của rong S.denticapum trên hình 3.2 cho thấy có 03 phân đoạn SdF1, SdF2 và SdF3 được tách ra theo các gradient nồng độ muối NaCl khác nhau tương ứng là 0,5M; 1,0M và 1,5M. Hàm lượng mỗi phân đoạn 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml D O , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SdF1 SdF2 SdF3 Hình 3.2. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.denticapum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose 53 được tính theo khối lượng mẫu fucoidan đưa lên cột tách, trong đó phân đoạn cao nhất là SdF2 chiếm 45,7% và thấp nhất là phân đoạn SdF3 15,3%. Kết quả phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn này (bảng 3.2) cho thấy cả 03 phân đoạn đều chứa 4 gốc đường đơn là fucose, mannose, galactose, xylose với các tỉ lệ khác nhau trong đó fucose chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần của cả 3 phân đoạn, chúng dao động trong khoảng 38,6-51,9% cao nhất là phân đoạn SdF3 (51,9%) và thấp nhất là phân đoạn SdF1 (38,6%), các gốc đường rhamnose và glucose không được phát hiện thấy trong các phân đoạn của loại fucoidan này, hàm lượng mannose và xylose giảm dần từ phần đoạn SdF1 đến SdF3. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn SdF1 đến SdF3 chúng dao động từ 23,67% - 39,14% điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, nên để giải phóng phân đoạn fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Với kết quả này, ta thấy fucoidan của rong S.denticapum có thể tồn tại 03 loại cấu trúc khác nhau, phân đoạn SdF3 chứa lượng lớn sulfate, fucose, galactose và một lượng nhỏ hơn mannose, xylose phân đoạn này được gọi là sulfate galactofucan. Hai phân đoạn SdF1 và SdF2 ngoài 2 thành phần chính là sulfate và fucose, chúng còn chứa một hàm lượng đáng kể galactose, mannose và xylose nên có thể gọi với tên chung là fucoidan. 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V, ml D O , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SwF1 SwF2 SwF3 SwF4 SwF5 Hình 3.3. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.swartzii bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose 54 Kết quả tách phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii (hình 3.3) ta thấy có 05 phân đoạn SwF1, SwF2, SwF3, SwF4 và SwF5 được tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,5M; 0,8M; 1,0M; 1,2M và 1,5M. So với kết quả 03 phân đoạn thu được của fucoidan từ rong S.denticapum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích (nhóm sulfate). Chính vì lý do này mà các phân đoạn fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau. Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.swartzii thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%) SO4 2- (%) Fuc Man Gal Xyl Rham Glc SwF1-0,5 М NaCl 2,0 5,6 nd nd nd nd nd nd SwF2-0,8 М NaCl 20,2 14,6 49,5 4,7 29,4 2,7 2,7 3,0 SwF3-1,0 М NaCl 33,3 18,4 56,0 3,0 28,9 1,9 1,9 3,2 SwF4-1,2 М NaCl 26,2 28,0 55,6 3,6 27,9 2,4 3,3 2,8 SwF5-1,5 М NaCl 16,0 42,3 57,1 4,0 27,4 0,9 2,0 2,0 Hàm lượng và thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan rong S.swartzii được trình bày trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy hàm lượng của các phân đoạn fucoidan SwF1-SwF5 dao động từ 2,0-33,3%, trong đó cao nhất là phân đoạn SwF3 (33,3%) và thấp nhất là phân đoạn SwF1 (2,0%). Với 05 phân đoạn thu được sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.swartzii sinh tổng hợp nên 5 loại fucoidan khác nhau, kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó đã được công bố cho loài rong này của tác giả (Nguyễn Duy Nhất) [5]. Kết quả phân tích thành phần hóa học (bảng 3.3) cho thấy thành phần đường đơn chính của các 55 phân đoạn là fucose (4,95-57,1 %) tăng dần từ phân đoạn SwF2 đến SwF5 và galactose giảm dần tỉ lệ nghịch với chiều tăng của fucose từ (27,4-29,4%), riêng phân đoạn SwF1 do hàm lượng thu được rất thấp (2%) nên chúng tôi không tiến hành phân tích thành phần hóa học của phân đoạn này. Hàm lượng sulfate cũng tăng dần từ phân đoạn SwF2 đến SwF5 (14,6-42,3%). Phân đoạn SwF5 được rửa giải với nồng độ muối NaCl (1,5M) có hàm lượng sulfate 42,3% cao hơn rất nhiều so với phân đoạn được rửa giải với cùng nồng độ muối NaCl của fucoidan phân lập từ rong S.swartzii đã được công bố trước đó của tác giả (Nguyễn Duy Nhất, Luận án Tiến sĩ) hàm lượng sulfate chỉ đạt 25,24% [5]. Điều này có thể được giải thích là do sự khác nhau về phương pháp phân đoạn cũng như phương pháp chiết tách. Chúng tôi tiến hành tách phân đoạn fucoidan trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE- Cellulose, trong khi đó tác giả Nguyễn Duy Nhất đã sử dụng phương pháp tách phân đoạn bằng nhựa lỏng Cetavlon, sự khác nhau này cũng tương tự với các loài rong khác của thế giới đã công bố trước đó [21,55,101,103]. Như vậy, thành phần của các phân đoạn của fucoidan được phân lập từ rong nâu S.swartzii tồn tại đồng thời cả 6 gốc đường với các tỉ lệ mol khác nhau chứng tỏ fucoidan này có cấu trúc rất phức tạp, độ lặp lại không cao. Điều này sẽ gây ra nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc chi tiết của chúng. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 100 200 300 400 500 600 700 V, ml A , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SpF1 SpF2 SpF3 Hình 3.4. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.polycystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose 56 Với fucoidan được chiết từ rong nâu S.polycystum, kết quả tách phân đoạn cho ra 03 phân đoạn SpF1, SpF2 và SpF3 tương ứng với nồng độ tăng dần của dung dịch rửa giải muối NaCl lần lượt là 0,5M; 1,0M và 1,5M (hình 3.4). Kết quả phân tích thành phần đường và hiệu suất thu các phân đoạn được đưa ra trong bảng 3.4. Phân đoạn SpF2 đạt hiệu suất cao nhất chiếm (42,3%) và thấp nhất là phân đoạn SpF1 (18,3%). Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy có sự khác biệt rất lớn trong tỉ lệ thành phần các đường đơn giữa 03 phân đoạn, với phân đoạn SpF1 hàm lượng fucose (28,0%) và mannose (26,7%) gần tương đương nhau và chiến tỉ lệ gấp 2 lần so với hàm lượng của galactose (12,7%), xylose (11,3%) và rhamnose (13,1%), hàm lượng glucose thấp nhất (8,2%). Với phân đoạn SpF2 hàm lượng fucose và galactose cao hơn gấp 2 lần so với phân đoạn SpF1 lần lượt là 59,2% và 26,6%, hai thành phần mannose và xylose chỉ chiếm một lượng nhỏ, trong khi đó glucose không được tìm thấy trong phân đoạn này. Phân đoạn SpF3 có thành phần monosacarit đơn giản hơn nhiều so với hai phân đoạn SpF1 và SpF2, ngoài fucose và glactose là hai thành phần chính với tỉ lệ fucose : glactose = 2 : 1 thành phần đường đơn còn lại là xylose chỉ chiếm 4,5%, các gốc đường đơn khác như mannose, rhamnose và xylose không tồn tại trong phân đoạn fucoidan này. Tương tự như các phân đoạn fucoidan từ các loài rong S.denticapum và S.swartzii, hàm lượng sulfate trong các phân đoạn của fucoidan từ rong nâu S.polycystum cũng tăng dần (tăng tuyến tính với nồng độ của dung dịch rửa giải NaCl) từ phân đoạn SpF1 đến SpF2 (20,11 - 33,9 %) (bảng 3.4). Bảng 3.4: Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.polycystum thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit của fucoidan, mol % Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%) Tổng carbohydrate (%) SO4 2- (%) Fuc Man Gal Xyl Rham Glc SpF1-0,5 М NaCl 18,3 56,43 20,11 28,0 26,7 12,7 11,3 13,1 8,2 SpF2-1,0 М NaCl 43,2 59,15 25,67 59,2 6,0 26,6 0,2 8,0 nd SpF3-1,5 М NaCl 21,0 54,97 33,99 68,6 nd 26,9 4,5 nd nd 57 Như vậy, với 03 phân đoạn thu được bằng tách sắc ký và kết quả phân tích thành phần đường cho thấy fucoidan được phân lập từ loài rong nâu S.polycystum có thể tồn tại 3 dạng cấu trúc với bộ khung monosacarit rất khác nhau. So với kết quả đã được công bố về fucoidan của loài rong này, Bilan và cộng sự đã thu nhận được 04 phân đoạn fucoidan khi tách trên cột DEAE-Sephacel [27]. Theo nhóm tác giả này, thành phần đường của các phân đoạn của fucoidan rong S.polycystum không chứa gốc đường rhamnose, trong khi đó thành phần của hai phân đoạn SpF1 và SpF2 đã phân tích ở trên gốc đường rhamnose chiếm từ 8,0-13,1%. Tuy nhiên, tỉ lệ thành phần giữa các gốc đường cũng như hàm lượng sulfate trong phân đoạn F4 có sự tương đồng so với phân đoạn SpF3. Phân đoạn F4 ngoài fucose và galactose là hai thành phần chính với tỉ lệ fucose : galactose ≈ 2 : 1, chỉ còn lại hàm lượng rất nhỏ đường xylose. Hàm lượng sulfate chiếm 33,70% so với 33,99% trong phân đoạn SpF3. Sự khác nhau về kết quả tách phân đoạn cũng như thành phần của các phân đoạn fucoidan rong S.polycystum so với công bố [27] có thể được giải thích do sự khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu, cũng như phương pháp chiết tách và phân tích thành phần đường của fucoidan. Tác giả Bilan và cộng sự tiến hành chiết rong trong dung môi chứa 2% CaCl2 ở 85 oC để thu nhận fucoidan, thành phần đường của chúng được phân tích bằng phương pháp GC sau khi thủy phân và aditol hóa. Trong khi đó fucoidan được chúng tôi thu nhận bằng cách chiết rong trong dung môi axít HCl loãng ở 60oC, thành phần đường của chúng được phân tích bằng phương pháp HPLC. Các kết quả tương tự cũng đã được công bố với fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới [101,125]. Fucoidan từ rong nâu S. mcclurei được tách phân đoạn bằng sắc ký trên cột trao đổi anion DEAE-MacroPrep (Diethylaminoethyl-MacroPrep) (hình 3.5) 03 phân đoạn fucoidan SmF1, SmF2 và SmF3 được thu nhận tương ứng với các nồng độ rửa giải của muối NaCl là 0,8M; 1,2M va 1,6M; về bản chất không có sự khác nhau giữa loại nhựa này so với nhựa trao đổi anion DEAE-cellulose với chung tâm hoạt động là nhóm amin mang điện tích dương (+1). Sự khác nhau về nồng độ dung dịch rửa giải muối NaCl so với các phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum, 58 S.swartzii và S.polycystum như đã được giải thích ở trên có thể là do sự khác nhau về đặc điểm cấu trúc của mỗi loại fucoidan. Kết quả phân tích hàm lượng và thành phần hóa học của các phân đoạn SmF1, SmF2 và SmF3 được đưa ra trong bảng 3.5. Hàm lượng của phân đoạn SmF1 là 8,4%, phân đoạn SmF2 chiếm 18,2% và phân đoạn SmF3 là 10,5%. Kết quả phân tích thành phần đường trong bảng 3.5 cho thấy hàm lượng fucose và galactose tăng dần theo nồng độ muối rửa giải NaCl, ngược lại các gốc đường mannose, xylose, glucose hàm lượng giảm dần và không xuất hiện trong phân đoạn SmF3. Tỉ lệ phần trăm mol của các gốc đường trong các phân đoạn cũng rất khác nhau, nhưng đều có đặc điểm chung là hàm lượng fucose và galactose là hai thành phần chiếm hàm lượng chủ yếu và đây cũng là đặc điểm chung của fucoidan rong nâu Việt Nam [5,27,122]. Phân đoạn SmF1 và SmF2 có thành phần đường đơn phức tạp hơn khi trong phân tử có chứa đồng thời cả 05 gốc đường khác nhau, hàm lượng sulfate tương ứng là 16,8 và 25,7% điều này cho thấy mức độ phức tạp trong cấu trúc của các phân đoạn fucoidan này. Phân đoạn SmF3 có thành phần đường đơn giản nhất khi chỉ chứa hai gốc đường là fucose (58,5%) và galactose (41,5%), hàm lượng sulfate (35%) với thành phần như vậy nó được xếp vào nhóm galactofucan sulfate hóa cao. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 V (ml) A 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, M SmF1 SmF2 SmF3 Hình 3.5. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong S.mcclurei bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Macroprep 59 Bảng 3.5. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit, (% mol) Phân đoạn fucoidan - NaCl Hàm lượng (%)* Tổng carbohydrate (%)* SO4 2- (%)* Fuc Man Gal Xyl Gluc SmF1-(0,8M NaCl) 8,4 44,65 16,8 27,2 34,0 19,6 6,4 12,8 SmF2-(1,2M NaCl) 18,2 64,59 25,7 44,8 5,4 34,1 5,3 10,4 SmF3-(1,6M NaCl) 10,5 55,62 35,0 58,5 nd 41,5 nd nd * % tính theo trọng lượng của mẫu fucoidan * nd: không phát hiện thấy Kết quả tách phân đoạn fucoidan của rong Turbinaria ornata trên cột sắc ký trao đổi anion DEAE-cellulose 04 phân đoạn ToF1, ToF2, ToF3 và ToF4 được thu nhận tương ứng với các nồng độ giải hấp của muối NaCl là 1,15M, 1,25M, 1,50M và 1,80M (hình 3.6), kết quả này cho thấy fucoidan từ loài rong này tồn tại các kiểu cấu trúc rất khác so với fucoidan từ các loài rong S.denticapum, S.polycystum, S.mcclurei và S.swartzi thuộc chi rong Sargassum. Kết quả phân tích hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan này được đưa ra trong bảng 3.6. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 0 100 200 300 400 500 600 700 800 V, ml A , 4 9 0 n m 0 0,5 1 1,5 2 N a C l, N ToF1 ToF2 ToF3 ToF4 Hình 3.6. Phân đoạn fucoidan được chiết từ rong Turbinaria ornata bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose 60 Bảng 3.6. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong Turbinaria ornata thu được bằng sắc ký trao đổi anion Thành phần monosacarit , mol% Phân đoạn fucoidan Hàm lượng (%) SO4 2- (%) Fuc Man Gal Rham ToF1-1,15 М NaCl 6,6 23,87 71,9 4,5 23,6 nd ToF2-1,25 М NaCl 29,7 43,26 69,6 nd 27,7 2,7 ToF3-1,50 М NaCl 10,3 38,75 82,1 2,4 9,4 6,1 ToF4-1,80 М NaCl 18,4 32.36 75,6 2,9 18,8 2,7 Kết quả cho bảng 3.6 cho thấy hàm lượng của các phân đoạn fucoidan ToF1- ToF4 dao động trong khoảng từ 6,6-29,7 %, trong đó cao nhất là phân đoạn ToF2 chiếm 29,7%, thấp nhất là phân đoạn ToF1 (6,6%), hai phân đoạn ToF3 và ToF4 lần lượt chiếm 10,3% và 18,4%. Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy, tất cả các phân đoạn của fucoidan rong Turbinaria ornata đều có hàm lượng fucose rất lớn dao động từ 69,6% (ToF2) đến 82,1% (ToF3), hàm lượng galactose dao động từ 9,4% (ToF3) đến 27,7% (ToF2) và chỉ chứa một hàm lượng nhỏ các gốc đường mannose và rhamnose, đặc biệt các gốc đường xylose và glucose không có mặt trong tất cả các phân đoạn fucoidan của loài rong này. Hàm lượng rhamnose lớn nhất ở phân đoạn ToF3 (6,1%) và nhỏ nhất ở hai phân đoạn ToF2 và ToF4 cùng chiếm 2,7%, rhamnose không có trong phân đoạn ToF1. Hàm lượng mannose lớn nhất trong phân đoạn ToF1 (4,5%) và nhỏ nhất trong phân đoạn ToF3 (2,4%), phân đoạn ToF2 không tồn tại gốc đường này. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn ToF1 đến ToF2, dao động trong khoảng 23,87% - 43,26%. Như vậy, các phân đoạn fucoidan của rong nâu Turbinaria ornata với thành phần đường chính là fucose và galactose cùng một lượng lớn sulfate được gọi là các galactofucan sulfate hóa. Trong khi đó fucoidan của một số loài rong nâu khác thuộc cùng bộ Fucales sống ở 61 vùng ôn đới như Fucus evanescens, Fucus vesiculosus trong thành phần của chúng chỉ chứa fucose và sulfate được gọi là các fucan sulfate hóa [23,92]. So với công trình đã được công bố [11] về kết quả nghiên cứu fucoidan của loài rong này khi tách trên cột trao đổi aion dạng DEAE-Sephadex, các tác giả đã thu được 5 phân đoạn fucoidan khác nhau, phân đoạn rửa giải ở cùng nồng độ (1,5 M NaCl) cho thấy sự khác nhau đáng kể về tỉ lệ mol giữa fucose : galactose ≈ (1:0,28) và hàm lượng sulfate (28,2%) so với fucose : galactose ≈ (1:0,11) và hàm lượng sulfate (38,75%) mà chúng tôi thu được ở cùng phân đoạn rửa giải. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu fucoidan của các loài rong nâu khác trên thế giới [40,80] và được giải thích là do sự khác nhau về phương pháp tách chiết, phân đoạn cũng như phân tích [81]. Kết luận: Fucoidan phân lập từ loài rong nâu Sargassum swartzii sau khi tách phân đoạn bằng sắc ký trao đổi ion trên cột DEAE-cellulose, cho thấy tồn tại 5 dạng cấu trúc khác nhau. Trong khi đó với các loài rong còn lại là S.denticapum, S.polycystum và S.mcclurei chúng chỉ sở hữu 3 dạng cấu trúc fucoidan. Khác với các loài rong chi Sargassum, fucoidan chiết từ loài rong thuộc chi Turbinaria lại tồn tại 4 dạng cấu trúc khác nhau. Kết quả phân tích thành phần đường chỉ ra rằng fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của fucoidan vô cùng phức tạp. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong trên đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfate cao, hai đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfate hóa. Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và galactofucan sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi rút,... [81,98]. Do vậy, trước khi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc trưng cấu trúc của fucoidan rong nâu Việt 62 Nam nhằm mục đích ứng dụng chúng làm thực phẩm chắc năng và dược liệu. Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế một số dòng tế bào ung thư người. 3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan Theo các công trình đã công bố [38,39,52,62,69] fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rất đa dạng, đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư, do vậy nó đã trở thành đề tài thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các nguồn dược liệu mới. Vì vậy trong luận án này chúng tôi tiến hành thử nghiệm thăm dò hoạt tính gây độc tế bào ung thư người của fucoidan và các phân đoạn fucoidan chiết tách từ một số loài rong nâu Việt Nam. Fucoidan được chiết tách từ 06 loài rong nâu khác nhau được tiến hành thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào in vitro tại Viện Nghiên cứu sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology - Hàn Quốc), Phòng Thử nghiệm Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa học các Hợp chất Thiên nhiên - VAST và Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông - L.B.Nga. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan được tiến hành thử trên 05 dòng ung thư là Hep-G2 (ung thư gan), RD (ung thư màng tim), LU (ung thư phổi), MDA-MB-231(ung thư vú) và DLD-1 (ung thư ruột kết). Các kết quả thử nghiệm được trình bày trên bảng 3.7 Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan chiết từ rong nâu của Việt Nam Dòng tế bào ung thư của người Fucoidan Hep-G2* RD* MDA-MB-231** LU* DLD-1*** Kết luận F-Sp + + nd nd nd Dương tính 02 dòng F-Sm + - nd nd + Dương tính 02 dòng F-So + + nd nd nd Dương tính 02 dòng F-Ss + + + + - Dương tính 04 dòng F-Sd + + nd nd - Dương tính 02 dòng F-To + + nd nd nd Dương tính 02 dòng 63 * Thử nghiệm tại Phòng thử nghiệm sinh học - Viện Hóa học Các hợp chất thiên nhiên ** Thử nghiệm tại Viện Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc, Hàn Quốc *** Thử nghiệm tại Viện Hóa sinh hữ cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga +: dương tính; -: âm tính; nd: chưa xác định Kết quả bảng 3.7 cho thấy tất cả các mẫu fucoidan thử nghiệm đều có hoạt tính gây độc tế bào trên ít nhất 02 dòng tế bào ung thư. Cả 06 mẫu fucoidan đều có hoạt tính với tế bào ung thư gan (Hep-2), 05 mẫu có hoạt tính với tế bào ung thư màng tim (RD), ngoại trừ fucoidan chiết tách từ loài rong S.mcclurei không có hoạt tính với tế bào ung thư màng tim nhưng lại có hoạt tính với tế bào ung thư ruột kết (DLD-1), 02 mẫu fucoidan F-Sd và F-Ss của loài rong S.denticarpum và S.swartzii không có hoạt tính với dòng tế bào ung thư này. Trong số 06 mẫu fucoidan chỉ có duy nhất fucoidan được phân lập từ loài rong S.swartzii được tiến hành thử và có hoạt tính với 02 dòng tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) và ung thư phổi (LU). Từ các mẫu có hoạt tính sinh học đã được sàng lọc, chúng tôi tiến hành thí nghiệm đánh giá

Các file đính kèm theo tài liệu này:

  • pdfluan_an_pham_duc_thinh_doc_4882_2045293.pdf
Tài liệu liên quan