Nghiên cứu phát triển và hoàn thiện quy trình pcr đa mồi phát hiện trực tiếp streptococcus suis từ dịch não tủy người

i trình tự gen đích khác nhau khi sử dụng hai hay nhiều loại mồi khác nhau (primers) với cùng một quy trình khuếch đại trong cùng một ống phản ứng. Do đó, sử dụng PCR đa mồi có thể tiết kiệm được thời gian, công sức xét nghiệm và có khả năng phát hiện được hai hay nhiều tác nhân gây bệnh trong cùng một lúc. Phân tích được các sản phẩm khuếch đại (sản phẩm PCR) của mỗi một cá thể (hay một tác nhân gây bệnh) từ hỗn hợp các sản phẩm PCR đã làm cho phương pháp PCR đa mồi trở thành một phương pháp sàng lọc nhanh chóng, tiện lợi cho cả lâm sàng và nghiên cứu. Trong lĩnh vực các bệnh nhiễm trùng, PCR đa mồi là công cụ có giá trị trong việc định danh vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng. 1.5.3.2. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR đa mồi Để có được hiệu quả cao nhất khi sử dụng PCR đa mồi trong phát hiện gen đích người ta phải chú ý nhiều hơn tới mọi khía cạnh của kỹ thuật PCR như mồi (vị trí, trình tự, hàm lượng, nhiệt độ bắt cặp); hàm lượng Taq polymerase; nồng độ MgCl2; sự tương quan giữa các thành phần phản ứng và gen đích thêm nữa là các loại thạch điện di và nồng độ thạch phối hợp. Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và ‘khuôn’ (DNA của tế bào đích hay ‘template’). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hình thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng ‘khuôn’ hoặc cho dư thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi vì các chuỗi đích mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer). Lựa chọn mồi: Chiều dài của mỗi mồi ở khoảng 18-24 bp, nếu mồi có độ dài lớn hơn (30-35bp) thì dường như cũng hoạt động trong điều kiện chu kỳ tương tự như mồi có độ dài ngắn, tuy vậy mồi ở độ dài lớn có khả năng tạo các sản phẩm chính, ngăn các sản phẩm phụ trong phản ứng đa mồi. Nếu có thể, trình tự của mỗi mồi nên được ‘bắt đầu’ và ‘kết thúc’ bởi 1-2 cặp GC. Hai mồi trong cặp cần phải có nhiệt độ tan chảy Tm gần nhau. Điều kiện chu kỳ và nồng độ đệm phải điều chỉnh cân xứng với mỗi cặp primer để việc khuếch đại các vùng đích được đặc hiệu. Nồng độ mồi Thông thường, trong mỗi phản ứng PCR đơn (khuếch đại một vùng), nồng độ phân tử dùng cho mỗi mồi từ 100 – 500 nM. Trong phản ứng PCR đa mồi, lượng mồi có thể thay đổi từ 500nM đến 15nM (trong nghiên cứu, kết quả cho thấy nếu nồng độ mồi ở 15nM sẽ không nhìn thấy sản phẩm, ở 30 nM cho sản phẩm ítvà sản phẩm PCR xuất hiện rõ nhất ở nồng độ 200nM). Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nên tránh sử dụng lượng mồi quá cao hoặc quá thấp. Lượng mồi quá cao có thể gây ức chế phản ứng PCR đa mồi, nhưng ngược lại lượng mồi quá ít thì không đủ để có sản phẩm khuếch đại. Khi phản ứng khuếch đại diễn ra không đạt yêu cầu, sản phẩm ít nên khó nhận thấy mặc dù đã tối ưu các điều kiện của chu kỳ phản ứng thì việc thay đổi tỷ lệ các mồi khác nhau trong phản ứng là cần thiết, bằng cách tăng lượng mồi cho sản phẩm yếu hơn (vùng yếu) và giảm lượng mồi cho sản phẩm mạnh hơn (vùng mạnh). Nồng độ cuối cùng của các mồi (từ 40 -500nM) có thể thay đổi đáng kể trong vòng vùng này và thường được thiết lập theo kinh nghiệm [24]. Với DNA có số copy thấp hoặc có tính phức tạp cao thì nồng độ mồi nên dùng từ 300nM - 500nM (0,3 – 0,5µM). Đối với DNA có số copy cao hoặc tính phức tạp thấp nồng độ mồi được khuyên là từ 40nM – 400nM (0,04-0,4µM) [38]. Sự cân xứng giữa lượng mồi và lượng DNA khuôn (DNA đích) Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là sự phù hợp tối ưu của tỷ lệ mồi (primer) và ‘khuôn’ (DNA của tế bào đích hay ‘template’). Nếu tỷ lệ này quá cao, sản phẩm trùng hợp mồi được hình thành, như vẫn xảy ra khi ta pha rất loãng ‘khuôn’ hoặc cho dư thừa mồi. Mồi luôn phải ở trong mức dư thừa 107 phân tử đối với khuôn. Trong hầu hết các áp dụng, không kể đến nồng độ của khuôn, nồng độ mồi không được tăng vượt quá 0,5µM vì sản phẩm trùng hợp mồi sẽ được tạo nên. Tỷ lệ mồi – khuôn quá thấp, sản phẩm sẽ không được tăng lên theo số mũ bởi vì các chuỗi đích mới được tổng hợp sẽ trở lại bản chất gốc ban đầu sau quá trình biến tính (hiện tuợng này làm giảm sản lượng một cách đáng kể) hoặc ức chế sự hình thành sản phẩm PCR. Do đó, điều quyết định tỷ lệ mồi-khuôn là lượng và phức hợp của khuôn được đưa vào phản ứng PCR để tránh sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu (các dimer). Nồng độ mồi và nồng độ DNA đích: Trong giới hạn, khi tăng nồng độ mồi có thể tăng kết quả phát hiện gen đích của phản ứng PCR. Do vậy, tăng nồng độ mồi cũng được coi như một cách tối ưu phản ứng PCR. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 .VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1. Chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu Chủng vi khuẩn Streptococcus suis Để hoàn thiện và chuẩn hoá các điều kiện của phản ứng PCR, trong đề tài đã sử dụng chủng vi khuẩn Streptococcus suis typ 2 phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng của người (từ máu và dịch não tủy) được lưu giữ tại Phòng thí nghiệm “ Vi khuẩn Hô hấp” khoa Vi khuẩn, Viện VSDTTW để tạo bệnh phẩm mô phỏng phục vụ thực nghiệm. Vi khuẩn S. suis gây bệnh được kiểm tra dựa trên: Tính chất bắt màu trong nhuộm Gram; Thử nghiệm Catalaze; Phân nhóm huyết thanh Lancefield: S. suis phải thuộc liên cầu nhóm D; Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng bộ sinh phẩm ‘API 20 Strep’ (Bio Mérieux); Xác định typ huyết thanh phổ biến gây bệnh cho người: ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2. Một số chủng vi khuẩn khác để đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp phát hiện Một số chủng vi khuẩn gây viêm màng não mủ điển hình như Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae typ b và một số vi khuẩn khác cùng nhóm liên cầu nhưng không phải S. suis (Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae) và tế bào bạch cầu người. 2.1.2. Dịch não tủy nền Là loại dịch não tủy được thu thập từ những bệnh nhân có hội chứng não cấp hoặc viêm não vô khuẩn: 100 mẫu dịch não tủy thu được từ bệnh nhân có hội chứng não cấp (HCNC) hoặc viêm não vi rút, đã được khẳng định âm tính với vi khuẩn để tạo bệnh phẩm nền và sử dụng như mẫu chứng âm tính thật với S. suis. 2.1.3. Dịch não tủy của bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não cấp tính do S. suis (để đánh giá hiệu quả của quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong đề tài): 53 mẫu bệnh phẩm từ 53 bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng viêm màng não mủ do S. suis. 44 mẫu đã được khẳng định chắc chắn là vi khuẩn S. suis bằng nuôi cấy phân lập. 09 mẫu âm tính trong NCPL nhưng dương tính với S. suis trong PCR đơn mồi 100 mẫu bệnh phẩm âm tính thực sự với vi khuẩn S. suis (cả bằng phương pháp nuôi cấy và phương pháp PCR), gồm: 29 mẫu từ bệnh nhân người lớn có các dấu hiệu thần kinh – liệt chi không rõ nguyên nhân/ hội chứng não cấp). 71 mẫu DNT của TE ≤ 24 tháng tuổi không có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/có chẩn đoán xác định VN vi rút hoặc vi khuẩn khác không phải S. suis như Hib, phế cầu và não mô cầu (được lấy trong CT giám sát VMN mủ ở TE của PTN VKHH). 2.1.4. Sinh phẩm nghiên cứu: Môi trường và sinh phẩm nuôi cấy định danh vi khuẩn S. suis: Môi trường thạch máu cừu 5% (Columbia sheep blood agar plate, BD [Cat. 251165]). Dung dịch H2O2 3% Bộ API Rapid ID 20 Strep (BioMérieux). Bộ kháng huyết thanh Lancefield (BioMérieux)/Streptex (Remel Cat: 30950501]) Kháng huyết thanh đặc hiệu S. suis typ 2 (serology, Đan Mạch) Bộ nhuộm Gram (DIFCO- Becton Dickinson, USA) Lam kính và lá kính phủ Sinh phẩm tách chiết DNA của vi khuẩn: High pure PCR Purification Kit (Roche Co.,) Lysozyme (MP Biomedicals, Inc. Cat 100834). Mutanolysin (Sigma Co.,). Triton X 100 Sinh phẩm PCR: Ready-To-Go PCR Mastermix Kit (Amersham Co.,) hoặc Hotstartaq Master Mix Kit (QIAgen), mỗi phản ứng bao gồm: Taq poly 2,5 units; 200µM mỗi loại dNTP; 1,5mM MgCl2; 10mM Tris-HCl [pH9,0]; 50mM KCl; BSA [Bovine Serum Albumine]. 25 mM MgCl2 (Invitrogen/Fermentas) Nước tinh sạch (Sartorius). Thạch Seakem GTG Agarose và Nusieve GTG Agarose (Cambrex Bio Science Rockland, Inc. USA). Đệm điện di: TAE 10x (Promega Corporation USA) Chất nhuộm sản phẩm điện di: ethidiumbromide Loading buffer (Novagen Co.) 100bp ladder (Markers) Novagen Co.. Các cặp mồi: Đề tài sử dụng các cặp mồi từ tài liệu tham khảo, đánh giá lại từng cặp, tạo tổ hợp các cặp mồi thoả mãn các yêu cầu nghiên cứu. Bảng 1 trình bày tên và trình tự các cặp mồi được sử dụng. Bảng 2.1. Một số trình tự mồi chủ yếu (primer) được sử dụng trong nghiên cứu [11,25,39,41] Loại gen Ký hiệu Trình tự Vị trí Sản phẩm PCR (bp) 16S-rDNA 195s & 489as2 5′- CAG TAT TTA CCG CAT GGT AGA TAT -3′ 5′- GTA AGA TAC CGT CAA GTG AGA A-3′ 172-195 469-490 294 Gdh gdh1 &gdh2 5’-AAG TTC CTC GGT TTT GAG CA-3’ 5’-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3’ 631-650 1196-1177 566 Gdh Str2-F Str2-R 5’-GCA GCG TAT TCT GTC AAA CG-3’ 5’-CCA TGG ACA GAT AAA GAT GG-3’ 1177-1196 508-527 688 Epf epf-F epf –R 5’-CGC AGA CAA CGA AAG ATT GA-3’ 5’- AAG AAT GTC TTT GGC GAT GG-3’ 2401-2419 3143-3124 744 Suilysin Sly-F Sly-R 5’-GCT TGA CTT ACG AGC CAC AA-3’ 5’-CCG CGC AAT ACT GAT AAG C-3’ 115-134 344-362 248 Arginine deminase arcA-F arcA-R 5’-TGA TAT GGT TGC TGC TGG TC-3’ 5’-GGA CTC GAG GAT AGC ATT GG-3’ 1225-1244 1342-1324 118 Protein được giải phóng bởi muramidase – MRP mrp-F1 mrp-F2 mrp-R 5’-GAC AGA TGG TGA GGA AAA TGG-3’ 5’-ATT GCT CCA CAA GAG GAT GG-3’ 5’-TGA GCT TTA CCT GAA GCG GT-3’ 3636-3655 3823- 3804 188 Cấu trúc vỏ polysaccharide (typ HT) cps2J-F cps2J-R 5’-TTT GTC GGG AGG GTT ACT TG-3’ 5’-TTT GGA AGC GAT TCA TCT CC-3’ 13918-13937 14415-14396 498 cps2JJ-F cps2JJ-R 5’- GTT GAG TCC TTA TAC ACC TGT T-3’ 5’- CAG AAA ATT CAT ATT GTC CAC C-3’ 498 2.1.5. Trang thiết bị, dụng cụ Tủ ấm CO2; Máy đo DNA (nanodrop); Máy ủ nhiệt (Wise Therm) PCR Mastercycler epgradient S (Eppendorf) Máy điện di (Weal Tec) Máy chụp ảnh điện di (UVP) Các loại máy ly tâm: Máy ly tâm lạnh 14000 vòng (BioFuge) Spin down (của Eppendorf và Nhật Bản) Lam kính và lá kính phủ Ống nghiệm 1.5 ml Eppendorf; ống chạy PCR 0,2ml Các loại đâu tip có màng lọc chuyên dụng cho SHPT Micropipet, Pipet Pasteur Que cấy 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.2.1. Nghiên cứu tạo bệnh phẩm mô phỏng Tạo huyền dịch vi khuẩn thuần nhất, chuẩn bị DNA của vi khuẩn S. suis làm chứng dương và tạo mô hình thử nghiệm. 2.2.1.1. Khẳng định các đặc tính của vi khuẩn tạo mẫu: Cấy mới Tính chất bắt màu Gram Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield Xác định tính chất sinh học 2.2.1.2. Nghiên cứu tạo mô hình bệnh phẩm với vi khuẩn S. suis: Chọn 10 mẫu DNT của những bệnh nhân viêm não vi rút hoặc hội chứng não cấp (được khẳng định không phải viêm màng não do vi khuẩn), hỗn hợp lại (đây là dịch não tủy nền) Gặt vi khuẩn S. suis (đã được cấy mới và kiểm tra ở trên) từ môi trường thạch máu 5% pha vào 1ml hỗn hợp dịch não tủy đã chuẩn bị ở trên. Điều chỉnh độ đục ngang với thang chuẩn 0,5 Mc Farland.Tính lại số vi khuẩn/ml (vì theo quy định của bộ so độ đục Mc Farland thì 1,5 x 108 tương đương độ đục 0,5 Mc Farland, thực tế đối với vi khuẩn S. suis sẽ là bao nhiêu ở độ đục 0,5 Mc Farland?) bằng cách pha loãng tiếp bậc 10, lấy 1ml ở nồng độ pha loãng thấp nhất (thường tương đương 102/ml) láng đều lên đĩa thạch máu 5%, Ủ qua đêm và đếm số khuẩn lạc. Kết quả cho thấy số lượng vi khuẩn S. suis tương đương là 1,21 x 107 vk/ µl Từ canh khuẩn có độ đục 0,5 Mc Farland, sẽ thực hiện 2 việc: Chia nhỏ thể tích huyền dịch vi khuẩn vào các ống Eppendorf (0,1ml/1ống): để thực hiện mục đích“Xây dựng phương pháp xử lý dịch não tủy đơn giản không dùng kit và đảm bảo hiệu quả”. Pha các nồng độ vi khuẩn hơn kém nhau 10 lần như sau Sử dụng 0,5ml hỗn dịch để tách DNA bằng bộ sinh phẩm ‘High Pure PCR product purification’ và enzyme mutanolysin. Sau đó đo lượng DNA thu được bằng máy đo “DNA Nano drop” và pha thành các nồng độ nhỏ hơn nhau 10 lần (pha loãng bậc 10) với dịch não tủy nền: loạt nồng độ này sử dụng để xác định giới hạn phát hiện (độ nhạy) của quy trình PCR đa mồi. 2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn tổ hợp mồi đại diện cho S. suis và một số yếu tố chủ yếu liên quan đến độc lực của vi khuẩn Yêu cầu về tổ hợp mồi: Thành phần của tổ hợp mồi có thể có ít nhất 3 cặp mồi của 3 gen khác nhau luôn phải có cặp mồi đặc hiệu chung cho vi khuẩn S. suis Kích thước sản phẩm PCR khác nhau để có thể phân biệt được Có cùng nhiệt độ bắt cặp Khả năng cạnh tranh thấp Đạt độ nhạy và đặc hiệu Thực hiện theo yêu cầu trên, cụ thể trong nghiên cứu này, mỗi tổ hợp mồi bao gồm 1 cặp đặc hiệu cho S. suis + 1 cặp đặc hiệu cho typ huyết thanh 2 + 1 cặp đặc hiệu cho Suilysin/ hoặc 1,2 yếu tố độc lực phổ biến khác. Bảng 2.2. Các tổ hợp mồi được sử dụng trong thử nghiệm Tổ hợp Các loại mồi Đặc hiệu cho S. suis Typ huyết thanh 2 Enzym ly giải tế bào Enzym khác Protein ngoại bào Tổ hợp 1 16S rDNA Cps2J Sly - - Tổ hợp 2 16S rDNA Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 3 16S rDNA Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 4 16SrDNA Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 5 Gdh Cps2J Sly - - Tổ hợp 6 Gdh Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 7 Gdh Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 8 Gdh Cps2J Sly arcA Mrp Tổ hợp 9 Strep2 Cps2J Sly - - Tổ hợp 10 Strep2 Cps2J Sly arcA - Tổ hợp 11 Strep2 Cps2J Sly - Mrp Tổ hợp 12 Strep2 Cps2J Sly arcA mrp Tổ hợp 13 16S rDNA Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 14 16S rDNA Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 15 16S rDNA Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 16 16SrDNA Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 17 Gdh Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 18 Gdh Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 19 Gdh Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 20 Gdh Cps2JJ Sly arcA Mrp Tổ hợp 21 Strep2 Cps2JJ Sly - - Tổ hợp 22 Strep2 Cps2JJ Sly arcA - Tổ hợp 23 Strep2 Cps2JJ Sly - Mrp Tổ hợp 24 Strep2 Cps2JJ Sly arcA Mrp Kỹ thuật sử dụng để đánh giá: Kỹ thuật PCR thông thường (đơn mồi và đa mồi được xây dựng trong đề tài) Kỹ thuật điện di 2.2.3. Nghiên cứu tối ưu chu trình nhiệt Thực nghiệm thay đổi các điều kiện về nhiệt độ biến tính, thời gian biến tính, nhiệt độ bắt cặp, thời gian bắt cặp, thời gian kéo dài, số chu kỳ, bổ sung thêm chu trình nhiệt phụ... để chọn ra chương trình PCR đa mồi thích hợp với mục tiêu “phát hiện S. suis và một số yếu tố độc lực phổ biến” Kỹ thuật sử dụng trong suốt nghiên cứu là PCR với các chương trình nhiệt thay đổi để lựa chọn những điều kiện cho hiệu quả cao nhất. Bảng 2..3. Các chu trình PCR đa mồi được thử nghiệm TT Giai đoạn đầu Giai đoạn chính Giai đoạn sau cùng Ghi chú 1 960C (3’) 940C (30”); 550C (30”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (5’) Thêm giai đoạn nhiệt độ cao lúc khởi đầu 2 960C (3’) 940C (30”);550C (30”); 720C (1’)40 chu kỳ 720C (5’) CT1+Tăng số chu kỳ chính 3 960C (3’) 940C (30”);550C (30”); 720C (1’); 35 chu kỳ 720C (5’) CT1+Tăng thời gian bắt cặp 4 960C (3’) 940C (30”);550C (60”); 720C (1’); 40 chu kỳ 720C (5’) CT1+Tăng số chu kỳ chính + Tăng thời gian bắt cặp 5 960C (3’) 940C (30”); 550C (30”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (10’) CT1 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng 6 960C (3’) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (5’) CT1 + tăng nhiệt độ bắt cặp 7 960C (3’) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’)40 chu kỳ 720C (5’) CT2 + tăng nhiệt độ bắt cặp 8 960C (3’) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’); 35 chu kỳ 720C (5’) CT3 + tăng nhiệt độ bắt cặp 9 960C (3’) 940C (30”); 600C (60”); 720C (1’); 40 chu kỳ 720C (5’) CT4 + tăng nhiệt độ bắt cặp 10 960C (3’) 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (10’) CT5 + tăng nhiệt độ bắt cặp 11 950C (3’); 600C (30”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (5’) CT phụ + CK8 12 950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (5’) CT11+Tăng thời gian bắt cặp của chu trình phụ 13 950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1’);35 chu kỳ 720C (5’) CT12+ Tăng thời gian bắt cặp của chu trình chính 14 950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1’);40 chu kỳ 720C (5’) CT 13 + Tăng thêm chu kỳ chính 15 950C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1’);40 chu kỳ 720C (7’) CT14 + Tăng thời gian kéo dài cuối cùng 16 960C (3’); 600C (60”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (60”); 720C (1’);40 chu kỳ 720C (7’) CT15 + Tăng nhiệt độ chu trình phụ 17 960C (3’); 600C (30”); 720C (1’), 3 chu kỳ 940C (30”); 600C (30”); 720C (1’);40 chu kỳ 720C (7’) CT16 + Giảm thời gian bắt cặp 2.2.4. Nghiên cứu tối ưu các thành phần tham gia phản ứng Thực nghiệm đánh giá ảnh hưởng của hàm lượng các chất tham gia phản ứng và một số chất có thể gây ức chế phản ứng PCR có mặt trong mẫu bệnh phẩm dịch não tủy (các dNTP, Taq polymerase, muối MgCl2, NaCl, chất xử lý nhày...): thay đổi hàm lượng, đánh giá bằng PCR đa mồi đã được tối ưu điều kiện ở trên. Lựa chọn thạch điện di và nồng độ thạch điện di để đảm bảo phát hiện sản phẩm PCR đa mồi. 2.2.5. Nghiên cứu mức độ phát hiện vi khuẩn S. suis và một số yếu tố độc lực của vi khuẩn bởi quy trình PCR đa mồi được xây dựng trong nghiên cứu. Tính ổn định của PCR đa mồi. Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một dải nồng độ từ 106 đến 1 copy/µl (là sản phẩm của 2. 2. 1) Sử dụng tổ hợp mồi (là sản phẩm của 2.2. 2) Sử dụng chương trình PCR đa mồi được xây dựng (là sản phẩm của 2. 2. 3) Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ưu ((là sản phẩm của 2. 2. 4) Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di. Phản ứng được lặp lại 10 lần để đánh giá khả năng bền vững và ổn định của phương pháp phát hiện bằng PCR đa mồi. 2.2.6. Đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi (khả năng bắt cặp chéo) với những vi khuẩn phổ biến gây hội chứng lâm sàng viêm màng não giống S. suis Sử dụng bệnh phẩm mô phỏng chứa DNA đã tinh chế của vi khuẩn ở một nồng độ, chọn nồng độ 106 vk/µl. Sử dụng tổ hợp mồi được lựa chọn Sử dụng chương trình PCR đa mồi tối ưu được xây dựng Sử dụng các thành phần tham gia phản ứng PCR ở mức độ tối ưu Phát hiện sản phẩm PCR bằng phương pháp điện di trên thạch agarose. Phản ứng được thực hiện với mẫu tế bào đích của từng loại vi khuẩn khác nhau nhưng gây bệnh cảnh lâm sàng viêm màng não mủ giống S. suis hoặc có đặc điểm cấu tạo giống S. suis và của bạch cầu người để kiểm tra sự không bắt cặp chéo (đánh giá tính đặc hiệu của các cặp mồi sử dụng phát hiện vi khuẩn và đặc tính vi khuẩn S. suis). 2.2.7. Xây dựng quy trình xử lý bệnh phẩm để tách chiết DNA của S. suis Từ huyền dịch vi khuẩn S. suis thuần khiết đã được chuẩn độ ở trên, chúng tôi nghiên cứu các phương pháp tách chiết đơn giản DNA của vi khuẩn trực tiếp trong bệnh phẩm và đánh giá hiệu quả tách chiết DNA của S. suis bằng thực nghiệm phát hiện bởi PCR đa mồi được xây dựng dành cho vi khuẩn S. suis như sau: 2.2.7.1. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt độ có kết hợp enzyme (hỗ trợ phá vỡ tế bào): Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hình là ‘DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ’): Lấy 100µl vào ống Eppendorf + lysozym (nồng độ cuối 2mg/ml), ủ ở các thời gian như sau: ủ 370C/15’; ủ 370C/30’. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây: 560C/30’; 1000C/10’. Lấy 100µl vào ống Eppendorf + Mutanolysin (nồng độ cuối 1mg/ml), ủ ở các thời gian sau: ủ 370C/15’; ủ 370C/30’. Sau đó xử lý tiếp ở các nhiệt độ sau đây: 560C/30’; 1000C/10’. 2.2.7.2. Xử lý bệnh phẩm bằng nhiệt đơn thuần (đơn giản hơn): chọn nhiệt độ, chọn thời gian xử lý nhiệt. Trộn đều mẫu bệnh phẩm (mô hình là ‘DNT + vi khuẩn đã chuẩn độ’), lấy 500µl vào ống Eppendorf → ly tâm 15.000 vòng/10 phút, giữ lại 100 µl cặn +5µl Triton x 100. Xử lý nhiệt ở các loại nhiệt độ như sau: 1000C/10phút; 1000C/15 phút; 1000C/20 phút; 1000C/35 phút; 900C/30’; 900C/60’; 850C/35 phút; 850C/60 phút; 800C/35phút; 800C/60phút; 800C/75phút; 800C/90phút. 2.2.8. Áp dụng toàn bộ các quy trình đã xây dựng (xử lý bệnh phẩm, PCR đa mồi) để phát hiện vi khuẩn S. suis trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng. Sử dụng mẫu bệnh phẩm dịch não tủy từ bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng nghi viêm màng não mủ do vi khuẩn S. suis để đánh giá tính hiệu quả của kỹ thuật xử lý đơn giản và quy trình PCR đa mồi. Số lượng mẫu bệnh phẩm tùy thuộc điều kiện thực tế thu được trong thời gian nghiên cứu, cụ thể ở nghiên cứu (NC) này là 53 mẫu bệnh phẩm thu được từ người mắc bệnh nghi do S. suis So sánh kết quả phát hiện bằng PCR đa mồi với kết quả phát hiện bằng nuôi cấy phân lập và bằng PCR đơn mồi. Phân tích các giá trị dương tính thực và âm tính thực của phương pháp PCR đa mồi. 2.3. ĐÁNH GIÁ CÁC GIÁ TRỊ HỮU ÍCH CỦA PHƯƠNG PHÁP 2.3.1. Tiêu chuẩn xác định chẩn đoán dương tính và âm tính Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm màng não nghi do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis): Lâm sàng: có các dấu hiệu nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương – viêm màng não (sốt, đau đầu, buồn nôn, nôn, cứng gáy, lơ mơ, hôn mê, bầm tím, ban đỏ). Có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn/sản phẩm sống của lợn (giết mổ, bán, ăn tiết canh..) Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định viêm màng não do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis) nhằm mục đích phân tích so sánh kết quả của phương pháp nuôi cấy phân lập và phương pháp PCR đa mồi như sau: Lâm sàng: có dấu hiệu viêm màng não nói chung Có tiền sử dịch tễ liên quan đến lợn ốm/sản phẩm sống của lợn hoặc nghề nghiệp liên quan đến lợn/sản phẩm sống của lợn. Xác định được tác nhân gây bệnh bởi một trong hai phương pháp hoặc bằng nuôi cấy phân lập hoặc bằng việc phát hiện được gen đặc hiệu của vi khuẩn bởi kỹ thuật PCR (đơn mồi hay đa mồi) Viêm màng não không do vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn (S. suis): Mẫu âm tính do không phải vi khuẩn liên cầu khuẩn lợn khi cấy bệnh phẩm không có S. suis và/hoặc không phát hiện được vật liệu di truyền của vi khuẩn bởi PCR. Chú ý: Tiêu chuẩn trên được sử dụng trong trường hợp phân tích, so sánh kết quả của phương pháp nuôi cấy và PCR đa mồi (phương pháp thử nghiệm). Kết quả của PCR đa mồi cũng được so sánh với kết quả phát hiện của PCR đơn mồi (được tiến hành trên cùng 1 mẫu bệnh phẩm). 2.3.2. Các chỉ số tính toán độ tin cậy và giá trị của phương pháp [3, 4] Các chỉ số gồm: độ nhậy (Se), độ đặc hiệu (Sp), tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả, giá trị tiên đoán dương tính (PPV), giá trị tiên đoán âm tính (NPV), tỷ số dự báo khả năng mắc bệnh khi xét nghiệm dương tính (LR+), tỷ số dự báo khả năng không mắc bệnh khi xét nghiệm âm tính (LR–). Bảng 2.3. Bảng số liệu cơ bản để tính toán các chỉ số Phương pháp đã công bố Tổng Dương tính Âm tính Phương pháp thử nghiệm Dương tính a b a+b Âm tính c d c+d Tổng a+c b+d a+b+c+d Độ nhạy hay tỷ lệ dương tính thật = a/(a+c) Độ đặc hiệu hay tỷ lệ âm tính thật = d/(b+d) Tỷ lệ dương tính giả = b/(b+d) Tỷ lệ âm tính giả = c/(a+c) Tỷ số dương khả dĩ - Tỷ số dự báo khả năng bệnh khi xét nghiệm dương tính (LR+) LR+ = Độ nhạy/ (1- độ đặc hiệu) Tỷ số âm khả dĩ - Tỷ số dự báo không mắc bệnh khi xét nghiệm âm tính (LR̶) LR- = (1- độ nhạy)/ độ đặc hiệu Giá trị dự đoán dương tính (PPV) = a/ (a+b) Giá trị dự đoán âm tính (NPV) = d/ (c+d) Bảng 2.4. Mức độ LR+, LR - liên quan đến khả năng mắc bệnh và không mắc bệnh Mức độ LR+ Khả năng mắc bệnh . Mức độ LR- Khả năng không mắc bệnh > 10 Cao < 0.1 Cao 5-10 Trung bình 0.1-0.2 Trung bình 2-5 Thấp 0.2-0.5 Thấp < 2 Rất thấp > 0.5 Rất thấp 1 Vô dụng 1 Vô dụng CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI PHÁT HIỆN TRỰC TIẾP Streptococcus suis VÀ MỘT SỐ ĐỘC LỰC PHỔ BIẾN CỦA VI KHUẨN 3.1.1. Tạo bệnh phẩm mô phỏng Bảng 3.1. Kết quả khẳng định lại đặc tính của vi khuẩn dùng làm mẫu TT Phương pháp thử nghiệm Kết quả thử nghiệm 1 Tính chất bắt màu Gram Gram (+) 2 Phản ứng catalase Âm tính 3 Xác định nhóm kháng nguyên theo Lancefield Nhóm D 4 Xác định tính chất sinh học Typ huyết thanh 2 3.1.2. Lựa chọn các cặp mồi và tổ hợp mồi phù hợp: bp M TH1 TH2 TH3 TH4 TH5 TH6 TH7 TH8 500 200 100 Hình 3.1. Thử nghiệm các tổ hợp mồi phù hợp (từ tổ hợp 1 đến tổ hợp 8) M: thang chuẩn DNA cỡ 100bp; TH: Tổ hợp mồi Ở tất cả các tổ hợp mồi, các băng DNA đều hiện rõ ở vị trí 498 bp (tương ứng với sản phẩm của cặp mồi Cps2J, đặc hiệu cho týp huyết thanh 2), và vị trí 248 bp (tương ứng với sản phẩm của cặp mồi đặc hiệu cho enzym ly giải tế bào sly. Như vậy hai cặp mồi Cps2J và Sly đều hoạt động rất tốt trong cả 8 tổ hợp. Đối với các tổ hợp mồi từ 1 đến 4, các vạch DNA là sản phẩm của mồi đặc hiệu cho S.suis 16S rDNA đều biểu hiện tốt.Tuy nhiên ở TH3 và TH4, cả 2 sản phẩm của cặp mồi Mrp có kích thước 188 bp đều không biểu hiện. Tất cả các tổ hợp từ