Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra (pangasius hypophthalmus)

hồi trứng, cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi bạc, cá trồng. Ngoài trypsin và chymotrypsin, các nghiên cứu cũng đặc biệt quan tâm đến protease kiềm từ nội tạng cá. Nghiên cứu về các enzyme protease trong hệ tiêu hoá của các loài cá khác nhau đã cho thấy rằng các serine protease từ cá cũng tương tự với các enzyme này ở động vật máu nóng về kích thước phân tử, thành phần acid amin và sự nhạy cảm với các chất có tác động ức chế các serine protease. Một số lipase từ nội tạng cá khác đã được nghiên cứu như lipase cá mập, cá tuyết, cá tráp, cá đối, cá rô. Jonh S. Patton tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ ở dạng hoạt hoá ở cá mập, một loại lipase được hoạt hoá bởi muối mật có thể đặc hiệu cho các acid béo không bão hoà bất kể vị trí cũng như tính đặc hiệu nhóm cho các ester. Lie và Lambertsen cho thấy các enzyme lipase thu được từ cá tuyết Đại Tây Dương (Gadus morhua) thuỷ phân chủ yếu các PUFA và cho thấy chúng có tính đặc hiệu acid béo hoàn toàn đối lập với các enzyme lipase vi sinh vật. Alberta N.A. Aryee đã thu nhận phân đoạn lipase từ nội tạng cá đối (Mugil cephalus). Poonsuk Prasertsan đã khảo sát hoạt độ của lipase trên đối tương nghiên cứu là nội tạng của 3 loại cá ngừ. Nguồn enzyme tiêu hóa tiềm năng từ nội tạng cá tra Cá tra (Pangasius hypophthalmus) là loài cá có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam. Riêng phần nội tạng, là phế liệu của ngành chế biến cá tra, ước tính khoảng 100.000 tấn/ năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các enzyme tiêu hóa như lipase, protease ứng dụng trong y học, công nghệ thực phẩm. Việc thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra được đánh giá là mang tính khả thi cao do có những điểm mạnh như: (1) nội tạng cá tra là nguồn nguyên liệu giàu enzyme; (2) trữ lượng nguồn nguyên liệu này ở nước ta rất lớn; (3) có cơ sở lý thuyết về enzyme tiêu hóa, có thể ứng dụng các kỹ thuật hiện đại trong nghiên cứu và thu nhận enzyme từ nội tạng cá tra; (4) giá trị sản phẩm cao; (5) dự đoán nhu cầu sử dụng enzyme 5 tiêu hóa tăng cao trong tương lai; (6) khác với tụy tạng lợn, bò hay gia cầm, sử dụng chế phẩm enzyme từ cá không gặp cản trở về tôn giáo hay dịch bệnh. 1.2. Phƣơng pháp thu nhận và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá Cho đến nay các chế phẩm enzyme tiêu hóa chủ yếu được thu nhận và tinh sạch theo phương pháp truyền thống qua các công đoạn trích ly, kết tủa và tinh sạch. Nhưng xu hướng mới để thu nhận enzyme công nghiệp hiện nay là phương pháp lọc màng (membrane). Ưu điểm của phương pháp lọc màng là ít gây ô nhiễm môi trường hơn phương pháp kết tủa truyền thống vì không sử dụng hóa chất là muối trung tính hay dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, hoặc isopropanol (thể tích gấp 3 - 4 lần thể tích dịch enzyme) để kết tủa enzyme. Nhược điểm của phương pháp lọc màng là kích thước phân tử phân riêng giao động trong khoảng lớn, do đó phương pháp lọc màng không tách riêng hoàn toàn được các protein. Kỹ thuật lọc màng vì vậy được ứng dụng hiệu quả trong công nghiệp thu nhận chế phẩm thô, nhưng kém hiệu quả trong việc thu nhận chế phẩm tinh khiết. 1.3. Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá được nghiên cứu ứng dụng trong xử lý thịt, trích ly dầu cá từ nguyên liệu thô, sản xuất acid béo ω-3 dạng concentrate, dùng làm enzyme chống oxy hóa, tách loại da cá, tinh sạch trứng cá, tách bỏ vỏ của động vật có vỏ, sản xuất nước chấm từ cá, sản xuất thức ăn gia súc từ cá, sản xuất protein thủy phân từ cá, tận thu các hợp chất màu từ phế phẩm của động vật có vỏ, khử mùi ôi do oxy hoá ở sữa. CHÖÔNG 2 ĐỐI TƢỢNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) do công ty chế biến thủy sản ở Vĩnh Long cung cấp. Ngay sau khi giết mổ, nội tạng được bảo quản ở -20 0C để hạn chế sự biến tính enzyme. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp xác định đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng 6 Nguyên liệu nội tạng được chia thành 3 loại sau: (1) gan tụy, (2) ruột, (3) nội tạng hỗn hợp. pH trích ly từ 6-11. Các enzyme khảo sát: lipase, protease và amylase. Mục tiêu: chọn thành phần nội tạng, pH trích ly tối ưu để hoạt độ protease, lipase, amylase tính trong 1g chất khô nguyên liệu cao nhất. Phương pháp trích ly enzyme từ nội tạng cá tra Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự hòa tan enzyme: (1) tỷ lệ nguyên liệu/dung môi từ 1/1 – 1/5; (2) nhiệt độ từ 5 - 450C; (3) thời gian từ 0,5 – 2,5 giờ. Hàm mục tiêu: hoạt độ, hoạt độ riêng protease, lipase/g chất khô nguyên liệu cao nhất. Phương pháp lọc màng trong thu nhận protein enzyme Trong dịch trích ly enzyme thô, ngoài enzyme còn có các chất hòa tan, protein tạp, các hạt lipidĐể thu nhận enzyme, chúng tôi sử dụng kết hợp 02 kỹ thuật lọc màng là: (I) vi lọc (MF) với màng 1 và 0,1 μm và (II) siêu lọc (UF). Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lọc UF: (1) nồng độ chất tan trong dòng nhập liệu với tỷ lệ pha loãng dịch enzyme từ 1/1 -1/3; (2) áp suất lọc từ 4 -8 psi; (3) thời gian lọc từ 90 -150 phút. Hàm mục tiêu: hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch củ sau lọc UF đạt giá trị cao nhất. Phương pháp kết tủa trong thu nhận protein enzyme Từ dịch trích ly enzyme thô, sử dụng tác nhân dung môi hữu cơ (aceton, ethanol, isopropanol) hoặc muối amoni sulfate bổ sung vào dịch enzyme để kết tủa protein. Ứng với mỗi tác nhân kết tủa, khảo sát (1) các tỷ lệ dung môi và dịch trích enzyme từ 1/1 – 5/1 (v/v) hoặc (2) nồng độ bão hòa muối amoni sulfate từ 40 – 80% bổ sung vào dịch enzyme. Hàm mục tiêu: chọn tác nhân cho hiệu suất thu hồi cao để thu nhận chế phẩm enzyme; chọn tác nhân cho độ tinh sạch cao để tiếp tục tách riêng các enzyme tinh sạch. Phương pháp tinh sạch enzyme Chế phẩm enzyme thô gồm hỗn hợp nhiều enzyme, thông thường phải 7 kết hợp 2-3 phương pháp tinh sạch mới tách riêng được các enzyme. Sử dụng kết hợp các phương pháp như: (1) Thẩm tích để loại muối và các chất có phân tử lượng nhỏ; (2) Sắc ký trao đổi ion; (3) Sắc ký lọc gel Sephadex. Trong nghiên cứu này, enzyme được chọn tinh sạch bằng thẩm tích; sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; sắc ký lọc gel Sephadex G-75/ G-100. Mục tiêu: thu nhận protease/ lipase tinh sạch từ hỗn hợp enzym ban đầu. Phương pháp xác định tính chất các enzyme tinh sạch Các enzyme tinh sạch được xác định thành phần cấu tạo, phân tử lượng; xác định các thông số động học như pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ bền pH, độ bền nhiệt theo thời gian, các chất làm tăng hoặc làm giảm hoạt độ enzyme; xác định giá trị Km và Vmax. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme Chế phẩm enzyme được ứng dụng trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa. 2.3 Công thức tính toán Hoạt độ riêng là số đơn vị hoạt độ enzyme được tính trên 1mg protein của chế phẩm. Hoạt độ tương đối là tỷ lệ phần trăm giữa hoạt độ enzyme còn lại và hoạt độ enzyme ban đầu. Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ giữa tổng hoạt độ enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt độ enzyme trong mẫu trước khi đem tinh sạch. Độ tinh sạch được tính theo tỷ lệ giữa hoạt độ riêng của enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và hoạt độ riêng của mẫu enzyme trước khi đem tinh sạch. Sử dụng phần mềm Stargaphic Plus 4.0 để xử lý thống kê. CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra 3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra Nội tạng cá tra theo kết quả nghiên cứu, chiếm tỷ lệ khối lượng 5,83%, cao hơn so với cá ngừ (5,44%) nhưng thấp hơn so với cá thu (8%) ở các nghiên cứu khác, nội tạng các loại cá này là phế liệu ngành chế biến thủy sản và cũng đang được nghiên cứu tận thu enzyme. 8 3.1.2 Sự phân bố lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng Hoạt độ của các enzyme tiêu hóa phụ thuộc vào bản chất của nguyên liệu nội tạng, do mỗi enzyme tập trung ở một số cơ quan nhất định. pH trích ly thì ảnh hưởng lên sự hòa tan của enzyme. Trong nghiên cứu này đã khảo sát ảnh hưởng của loại nguyên liệu nội tạng (nội tạng hỗn hợp, gan tụy, ruột) và pH dung môi (6-11) đến hoạt độ của các enzyme lipase, protease, amylase. Kết quả tổng hợp thể hiện ở bảng 1. Bảng 1: Hoạt độ lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu Thành phần pH trích ly tối ưu Lipase Hoạt độ (U/g ck) Hoạt độ riêng (U/mg pr) Nội tạng 8 491,33b 13,44b Gan tụy 8 674,02a 18,44a Ruột 8 364,61c 12,02b Protease Hoạt độ (U/g ck) Hoạt độ riêng (U/mg pr) Nội tạng 8 29,43b 0,80b Gan tụy 8 84,28a 2,30a Ruột 10 9,86c 0,37c Amylase Hoạt độ (U/g ck) Hoạt độ riêng (U/mg pr) Nội tạng 8 252,25b 6,89b Gan tụy 8 419,69a 11,47a Ruột 8 152,62c 5,03c Các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05; ck: chất khô nguyên liệu 9 Theo kết quả bảng 1, tại giá trị pH trích ly tối ưu, cho thấy trong các thành phần nội tạng, mẫu gan tụy có hoạt độ enzyme lipase, protease và amylase cao hơn mẫu nội tạng hỗn hợp và mẫu ruột, khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức p < 0,05, có thể do tụy tạng là cơ quan chính sản sinh các enzyme tiêu hóa. Hoạt độ riêng của các enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra là khá cao khi so sánh với các loài cá khác. Trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm chủ yếu đến hai loại enzyme chính là lipase và protease. Từ kết quả thí nghiệm này chọn nguyên liệu là gan tụy, pH trích ly là pH8 cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme Kết quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tốt nhất để trích ly enzyme protease và lipase từ gan tụy cá tra như sau: với dung môi là đệm Tris-HCl (0,05N) pH 8, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly là 1/2, nhiệt độ trích ly 5 0 C, thời gian trích ly là 1 giờ. 3.3 Khảo sát quá trình thu nhận enzyme bằng công nghệ lọc màng Kết quả khảo sát cho thấy công nghệ lọc màng chỉ đạt hiệu quả cao trong thu nhận lipase và không hiệu quả đối với protease. Nên từ dịch trích enzyme, tiến hành các bước sau: (1) lọc thô; (2) ly tâm; (3) lọc MF với 2 màng kích thước lần lượt 1 và 0,1 µm; (4) lọc UF, phân đoạn 10 KDa, vật liệu màng polysunfone, mô hình lọc cross-flow. Đánh giá hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase trong dòng retentate sau lọc UF. Bảng 2: Kết quả thu lipase sau quá trình lọc MF Giai đoạn xử lý Nồng độ protein (mg pr/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) Hoạt độ riêng lipase (U/mg pr) Tổng hoạt độ lipase (U) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) Pha loãng 1,09 a - 20,76 b 43424 100 1 1 µm 1,06 a 23,11 a 21,83 b 39056 89,94 1,05 0,1 µm 0,79 b 20,15 b 25,47 a 31636 72,85 1,23 10 Từ kết quả bảng 2 cho thấy độ tinh sạch lipase tăng sau khi lọc MF qua 2 màng kích thước 1 và 0,1 µm chứng tỏ quá trình lọc MF hiệu quả. 3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF Bảng 3: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ Nồng độ protein (mg pr/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) Hoạt độ riêng lipase (U/mg pr) Tổng hoạt độ lipase (U) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) 1:2 0,90 a 32,59 a 36,19 a 7040 87,34 ab 1,42 b 1:3 0,73 b 24,89 b 34,07 a 7516 93,26 a 1,57 a 1:4 0,52 c 14,52 c 27,94 b 5159 63,95 c 1,19 c Kết quả bảng 3 chọn tỷ lệ pha loãng 1/3 cho nghiên cứu tiếp theo. 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF Bảng 4: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành Áp suất (psi) Nồng độ protein (mg pr/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) Hoạt độ riêng lipase (U/mg pr) Tổng hoạt độ lipase (U) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) 4 0,37 b 17,78 b 48,44 ab 6364 78,97 b 1,90 ab 6 0,41 ab 21,04 a 51,31 a 7216 89,52 a 2,01 a 8 0,44 a 19,26 ab 43,70 b 5913 73,36 b 1,72 bc Kết quả bảng 4 chọn áp suất 6 psi cho nghiên cứu tiếp theo. 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase sau lọc UF Bảng 5: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo thời gian lọc Thời gian (phút) Nồng độ protein (mg pr/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) Hoạt độ riêng lipase (U/mg pr) Tổng hoạt độ lipase (U) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) 90 0,40 bc 18,67 bc 46,86 c 6888 85,46 ab 1,84 b 120 0,42 ab 22,22 a 52,70 a 7466 92,64 a 2,07 a 150 0,45 a 20,15 b 44,55 bc 6306 78,24 b 1,75 b 11 Kết quả bảng 5 chọn thời gian lọc 120 phút. Hiệu quả của quá trình lọc UF trong tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 6. Bảng 6: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của lipase sau lọc UF Công đoạn Xử lý Nồng độ protein (mg pr/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) Hoạt độ riêng lipase (U/mg pr) Tổng hoạt độ lipase (U) Hiệu suất thu hồi (%) Độ tinh sạch (lần) 0,1 µm 0,79 a 20,15 b 25,47 b 8060 100 1 UF 0,42 b 22,22 a 52,70 a 7466 92,6 2,07 Trên mỗi bảng 2, 3, 4, 5, 6, các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05 Kết quả chọn thông số quá trình lọc UF phân đoạn 10 KDa là tỷ lệ pha loãng dịch enzyme/nước cất 1/3, áp suất lọc 6psi, thời gian lọc 120 phút. Bên cạnh những thế mạnh phương pháp lọc màng vẫn còn những thiếu sót như: (1) do pha loãng dịch enzyme gây bất lợi cho qua trình tạo chế phẩm; (2) phương pháp chỉ có hiệu quả cao đối với quá trình tinh sạch enzyme lipase. Trong khi protease trong dịch enzyme cũng rất đáng được quan tâm. Do đó, ở nội dung thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi nghiên cứu tinh sạch cả protease và lipase theo phương pháp kết tủa truyền thống. 3.4 Khảo sát quá trình kết tủa enzyme Khảo sát quá trình kết tủa với 4 loại tác nhân là: amoni sulfate, ethanol, aceton và isopropanol với các nồng độ và tỷ lệ khác nhau bổ sung vào dịch enzyme. Đánh giá hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzyme đối với mỗi tác nhân kết tủa. Kết quả nghiên cứu cho thấy với tác nhân kết tủa là amoni sunfate, chọn nồng độ muối amoni sulfate bão hòa 60% cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease, lipase cao nhất. Với tác nhân kết tủa là ethanol, chọn tỷ lệ ethanol/ dịch trích ly là 3/1 (v/v). Với tác nhân kết tủa là aceton, chọn tỷ lệ aceton/dịch trích ly là 4/1. Với tác nhân kết tủa là isopropanol, chọn tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly là 4/1 cho hiệu quả kết tủa tốt nhất. 12 So sánh kết quả của các phương pháp kết tủa Hình 1: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch protease của các tác nhân kết tủa Hình 2: So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch lipase của các tác nhân kết tủa Trên các hình 1,2, các chữ số khác nhau trong cùng một hệ trục thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức p < 0,05 88.33 84.40 91.43 87.78 88.80 2.21 3.07 2.02 1.87 2.09 80.00 82.00 84.00 86.00 88.00 90.00 92.00 SA SA+ thaåm tích Ethanol aceton isopropanol taùc nhaân keát tuûa H ie äu s u a át t h u h o ài ( % ) 0 1 2 3 4 5 6 Ñ o ä t in h s a ïc h ( la àn ) Hieäu suaát thu hoài lipase (%) Ñoä tinh saïch (laàn) ab bc c cd a b bc d b a 86.3 81.71 90.72 88.54 86.67 2.15 2.97 1.94 1.89 2.04 80.0 82.0 84.0 86.0 88.0 90.0 92.0 SA SA+ thaåm tích Ethanol aceton isopropanol taùc nhaân keát tuûa H ie äu s u a át t h u h o ài ( % ) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Ñ o ä t in h s a ïc h ( la àn ) Hieäu suaát thu hoài protease (%) Ñoä tinh saïch (laàn) ab a b bc cd a b bc d c 13 Từ kết quả hình 1-2 chọn phương pháp kết tủa bằng ethanol cho hiệu suất thu hồi cao để sản xuất chế phẩm enzyme; chọn phương pháp kết tủa bằng amoni sunfate cho độ tinh sạch cao để nghiên cứu tiếp thu nhận protease, lipase tinh sạch. Chế phẩm enzyme có hoạt độ protease: 49,26 U/g chế phẩm; Hoạt độ riêng protease 1,42 U/mg protein; Hoạt độ lipase: 587,85 U/ g chế phẩm; Hoạt độ riêng lipase: 16,91 U/mg protein. 3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy Kết quả khảo sát cho thấy quá trình tinh sạch protease từ dịch trích ly enzyme bao gồm các bước sau: (1) kết tủa phân đoạn bằng muối amoni sunfate 60% nồng độ bảo hòa; (2) thẩm tích bằng màng cellophane 12 KDa; (3) tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; (4) kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75. Kết quả sắc ký đồ thể hiện ở hình 3, 4. Hình 3: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M Từ kết quả hình 3 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất thể hiện hoạt độ protease gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 phân đoạn (3ml/ống) H à m l ư ợ n g p ro te in ( m g /m l) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 H o ạ t đ ộ p ro te a s e ( U /m l) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (U/ml) NaCl 0.3 M 14 protease cao nhất là 4,86 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện hoạt độ lipase, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử lượng khác nhau (hình 5). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại protease và một loại lipase. Các peak còn lại hầu hết chỉ là các protein tạp thể hiện hoạt độ lipase, protease rất thấp. Từ kết quả hình 4 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra thành 3 peak, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ protease gồm 10 phân đoạn (ống 16-26) với hoạt độ protease cao nhất là 2,33 U/ml. Vậy sau khi qua cột sắc ký lọc gel sephadex G75 đã tách được protease ra khỏi lipase, kết quả kiểm tra độ tinh sạch và phân tử lượng protease thể hiện ở hình 5. Hình 4: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên Sephadex G-75 Hiệu quả quá trình tinh sạch protease thể hiện ở bảng 7. Kết quả bảng này cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận protease có hoạt độ riêng 28,59 U/mg, độ tinh sạch cao gấp 22,41 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu suất thu hồi protease đạt 23,67%. 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 phân đoạn (3ml/ống) H à m l ư ợ n g p ro te in ( m g /m l) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 H o ạ t đ ộ p ro te a s e ( U /m l) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ protease (U/ml) 15 Bảng 7: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra Công đoạn Protein tổng (mg) Tổng hoạt độ (U) Hoạt độ riêng (U/mg pr) Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) Enzyme thô * 202,5 258,3 1,28 1,0 100 Kết tủa 82,35 223,2 2,71 2,12 86,41 Thẩm tích 56,7 201,15 3,55 2,78 77,87 Sắc ký ion DEAE-cellulose 4,59 122,81 26,78 20,99 47,55 Sắc ký lọc gel Sephadex-G75 2,14 61,14 28,59 22,41 23,67 * Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của protease gan tụy Kết quả hình 5 xác định protease gan tụy tinh sạch và phân tử lượng 31 KDa Hình 5: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE Cột b: thang protein chuẩn, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose, cột c: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G75 3.5.3 Xác định một số tính chất của protease gan tụy tinh sạch 3.5.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của protease 16 Hình 6: Độ bền nhiệt theo thời gian của protease Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu của protease gan tụy cá tra là 55 0 C. Theo kết quả hình 6, ở nhiệt độ thấp 35-500C, protease bền nhiệt hơn ở nhiệt độ cao 55-700C, tại nhiệt độ tối ưu 550C sau thời gian 120 phút hoạt độ protease giảm 43,16%. Khi nhiệt độ cao hơn 550C tốc độ giảm hoạt độ protease nhanh hơn, ở nhiệt độ 600C sau 120 phút hoạt độ protease giảm 60,37%, ở nhiệt độ 700C sau 15 phút hoạt độ protease giảm 86,42%. 3.5.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của protease Hình 7: Độ bền pH theo thời gian của protease Kết quả nghiên cứu cho thấy protease gan tụy có pH tối ưu là 8,5, ổn định ở pH 7-9. Theo kết quả hình 7, sau 120 phút hoạt độ tương đối protease trên 80%. Ở pH 7 sau 120 phút hoạt độ protease giảm 12,84%. Ở pH 9 sau 0 20 40 60 80 100 0 15 30 45 60 90 120 Thời gian (phút) H o ạ t đ ộ t ư ơ n g đ ố i (% ) 35 độ C 45 độ C 50 độ C 55 độ C 60 độ C 70 độ C 70 75 80 85 90 95 100 105 0 30 60 90 120 Thời gian (phút) H o ạ t đ ộ t ư ơ n g đ ố i ( % ) pH 7 pH 7.5 pH 8 pH 8.5 pH 9 17 120 phút hoạt độ protease giảm 19,32%. Nhìn chung, protease gan tụy cá tra khá bền ở pH 7-9 trong khoảng thời gian 2-3 giờ, phù hợp để nghiên cứu ứng dụng trong y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa. 3.5.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ của protease Kết quả cho thấy hoạt độ của protease gan tụy cá tra bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Zn2+, Cu2+, Mg2+, kích thích khi có mặt ion Ca2+. 3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị Km và Vmax của protease tinh sạch khi thủy phân cơ chất BSA được xác định với Km = 897 mg/L và Vmax = 15,7 mg/L.phút. 3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy Từ kết quả cho thấy protease tinh sạch có 14 loại acid amin với tỷ lệ khác nhau, trong đó, các amino acid có hàm lượng cao là serine với 0,714 mg/g, aspartic với 0,651 mg/g, tiếp theo là glutamic với 0,416 mg/g, glysine với 0,355 mg/g và leucine với 0,303 mg/g. 3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75 Hình 8: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE- cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 H o ạt đ ộ l ip as e (U /m l) H àm l ư ợ n g p ro te in ( m g /m l) phân đoạn (3ml/ống) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) NaCl 0.3 M 18 Từ kết quả hình 8 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất thể hiện hoạt độ lipase gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ lipase cao nhất là 5,67 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện hoạt độ protease, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử lượng khác nhau (hình 10). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại lipase và một loại protease. Tiếp tục nghiên cứu tách riêng lipase ra khỏi hỗn hợp bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75. Hình 9: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy trên gel Sephadex G75 Từ kết quả hình 9 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra thành 2 peak lớn, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ lipase gồm 9 phân đoạn (ống 4-12) với hoạt độ lipase cao nhất là 5,17 U/ml. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE thể hiện ở hình 10. Hiệu quả quá trình tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 8. Kết quả bảng này cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận lipase có hoạt độ riêng 509,71 U/mg, độ tinh sạch cao gấp 37,95 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu suất thu hồi lipase đạt 40,08%. 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 0.16 0.18 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 phân đoạn (3ml/ống) H àm l ư ợ n g p ro te in ( m g /m l) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 H o ạt đ ộ l ip as e (U /m l) Hàm lượng protein (mg/ml) Hoạt độ lipase (U/ml) 19 Bảng 8: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra Công đoạn Protein tổng (mg) Tổng hoạt độ (U) Hoạt độ riêng (U/mg pr) Độ tinh sạch (lần) Hiệu suất thu hồi (%) Enzyme thô * 202,5 2719,8 13,43 1,0 100 Kết tủa 82,35 2493,45 30,28 2,25 91,68 Thẩm tích 56,7 2293,2 40,44 3,01 84,32 Sắc ký ion DEAE-cellulose 4,59 1735 378,29 28,17 63,79 Sắc ký lọc gel SephadexG75 2,14 1090 509,71 37,95 40,08 * Nguyên liệu gan tụy: 50g ** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của lipase gan tụy Kết quả điện di xác định lipase gan tụy tinh sạch và có phân tử lượng 57 KDa