Chuyên đề Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh giống cây hông Paulownia bằng phương pháp in vitro

o dung dịch nuôi cấy để thấm chất đinh dưỡng, đầu phía trên được uốn cong làm nơi đặt mẫu. Sử dụng cầu giấy để nuôi cấy phôi, nuôi cấy tế bào đơn. Ngoài các phương pháp trên, mẫu có thể nuôi cấy trên môi trường bán rắn hoặc bán lỏng hoặc phối hợp cả hai loại môi trường trên như trong trường hợp phủ một lớp dung dịch của môi trường lỏng trên bề mặt môi trường đặc để nuôi cấy. Lựa chọn phương pháp nào là tuỳ theo đối tượng, giai đoạn phát triển của mẫu, mục đích và kỹ thuật nuôi cấy. Đối với những nghiên cứu về dinh dưỡng và trao đổi chất thì môi trường lỏng tỏ ra thích hợp hơn (Naryanaswamy S, 1994). Các kỹ thuật nuôI cấy mô tế bào Hiện nay người ta sử dụng 3 phương pháp kỹ thuật nhân giống Invitro thực vật đó là: Phương pháp nhân chồi đỉnh (Meristem) và các phần khác nhau của thực vật. Phương pháp tái sinh chồi bất định. Phương pháp tạo phôi vô tính. Phương pháp nhân chồi đỉnh và các phần khác nhau của thực vật. Mô phân sinh đỉnh chồi, đỉnh cành, đỉnh rễ… có khả năng tái sinh và phân hoá rất mạnh. Mặt khác ở mô phân sinh hầu như không có virus nên nó được sử dụng để nhân giống cây sạch bệnh. Do kích thước của mô phân sinh khá nhỏ nên trong một vài trường hợp để dễ thu nhận và nuôi cấy người ta thường tách cả phần đỉnh chồi chứa mô phân sinh để nuôi cấy. Chồi phát sinh từ mẫu nuôi cấy được tách ra và chuyển sang môi trường nhân chồi. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần cho đến khi đạt được số lượng chồi đủ lớn theo yêu cầu. Trong quá trình nuôi cấy muốn kích thích tạo chồi cần bổ xung Cytokinin hay tổ hợp Cytokinin với Auxin. Muốn tạo rễ thì bổ xung Auxin. Như vậy trong nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng là rất quan trọng. Ngoài việc sử dụng đỉnh chồi để nhân giống in vitro, một số bộ phận khác của thực vật như: thân, lá, hoa… cũng được nuôi cấy. Các mô và cơ quan tách rời này để đưa vào nuôi cấy phải ở tình trạng sinh lý tốt nhất và đang phát triển. Đó là những phần non của cây, lá mầm, phần trên của lá mầm, chồi bên lá thứ nhất hay lá thứ hai hoặc phôi của hợp tử trưởng thành vì chúng chứa nhiều tế bào mô phân sinh. Tái sinh chồi bất định Tái sinh chồi bất định là một dạng nhân giống in vitro có thể sử dụng để tái sinh các dòng hoặc nhân với số lượng cây lớn. Sự phát sinh các cơ quan bao gồm sự tái tạo mới các chồi bất định trên từ nhiều nguồn mẫu khác nhau. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong nhân giống nhiều cây nông nghiệp, lâm nghiệp, cây cảnh cũng như các loài khó nhân khác. Ngoài việc nâng cao tỷ lệ nhân thì phương pháp này cũng duy trì được đặc điểm của dòng và tỷ lệ nhân cao hơn phương pháp nhân chồi. Kỹ thuật này còn được sử dụng để nhân các dòng bất thụ đực hoặc cái do không có hạt và đối với các dòng nhân theo phương pháp cắt hoặc ghép. Việc hình thành chồi, phát sinh cơ quan phụ thuộc rất lớn vào môi trường và điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, nguồn cacbon hydrate và nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng. Ví dụ: - ánh sáng: cây Fressia để hình thành được chồi phải để trong bóng tối. - Nhiệt độ: Sự hình thành chồi thích hợp trong khoảng 22- 280C - Môi trường: Giảm nồng độ Nitơ và Kali trong môi trường MS làm cho số chồi được hình thành trên mô cuống lá Senocioxhybrids tăng gấp 3 lần. Tỷ lệ Cytokinin/Auxin cao kích thích tạo chồi. 3. Tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo Sự phát sinh của phôi Somatic là sự hình thành phôi từ một tế bào không phải giao tử hay từ sự dung hợp giao tử thể. Mặc dù là một hiện tượng invitro quen thuộc và có tiềm năng ứng dụng như một hệ thống vi nhân giống nhưng trong tự nhiên nó được biết đến từ lâu là sự phát sinh phôi phụ, một dạng của Apomixis. Apomixis là hiện tượng phát sinh phôi không qua quá trình thụ tinh ở thực vật. Nó thường xuất hiện ở những tế bào đơn Somatic điploi trong túi phôi (Aspospopy) hoặc từ những tế bào đơn của Nucellus (nucellar embryon). Người đặt nền móng đầu tiên cho việc tạo phôi vô tính in vitro là Reinert và Stewars (1958). Hai ông đã tạo được phôi vô tính trong điều kiện phòng thí nghiệm ở huyền phù tế bào cà rốt. Sau đấy một loạt các nghiên cứu tạo phôi vô tính trên các đối tượng khác như cây ăn quả, cây hoa, cây cảnh, … Đến năm 1989 kỹ thuật phôi vô tính đã đạt được những tiến bộ lớn. Hiện nay người ta đã nhân giống vô tính hơn 200 loài thực vật. Việc tạo phôi vô tính ở thực vật đem lại tiềm năng ứng dụng lớn đối với các mục đích: Nhân dòng với số lượng lớn, ví dụ: một mẻ cấy 500 lít cho 200.000 chồi cây cỏ ngọt. Kỹ thuật di truyền, nuôi cấy protoplast, tạo các biến dị Somatic có lợi. Bên cạnh những ưu điểm trên phương pháp này cũng có một số nhược điểm như: Tần số phôi thấp, tạo các phôi khuyết tật, phôi chín không đều… VI.ứng dụng của phương pháp nhân giống in vitro Tạo cây sạch bệnh Hàng năm sản xuất nông nghiệp chịu thiệt hại rất lớn do các nguồn bệnh nói chung: nấm, vi khuẩn, tuyến trùng… và virus nói riêng. Ví dụ virus Tungro năm 1971 đã cướp đi nửa triệu tấn thóc của nông dân philippin; virus khảm làm giảm tới 20- 30 % sản lượng lúa mì, đại mạch ở các nước Châu âu. Mà virus không thể phòng, chống, tiêu diệt bằng xử lý các chất hoá học như vi khuẩn, nấm, sâu bọ. Cách duy nhất để giảm thiệt hại do virus gây ra là tách chúng ra khỏi cây bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khoẻ mạnh. Phương pháp nhân giống in vitro là phương pháp tạo cây sạch bệnh hữu hiệu nhất. Từ năm 1940 nuôi cấy mô tế bào được sử dụng vào cải thiện giống cây trồng. Từ khi Kassanis (1957) quan sát thấy đỉnh chồi hoặc rễ hoàn toàn không hay có rất ít virus, đỉnh sinh trưởng (meristem) đã được dùng để nuôI cấy tạo cây sạch bệnh. Đỉnh sinh trưởng của cây được dùng để nuôi cấy tạo cây sạch bệnh. Đỉnh sinh trưởng của cây thường có kích thước từ 5- 10mm nhưng với mục đích loại trừ vius thì kích thước mẫu cấy chỉ cần 0,1mm. Phương pháp nuôi cấy này có thể áp dụng ở đối tượng cây hai lá mầm như: khoai tây, thuốc lá, cam, chanh, hoa cúc hay ở cây một lá mầm như dứa sợi… Nhưng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (mô phân sinh đỉnh) vẫn không thể loại trừ hoàn toàn vius. Để tạo giống cây sạch bệnh theo đúng nghĩa Klin Kowski và Shmelze (1974) đã kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và liệu pháp nhiệt: Xử lý ở nhiệt độ 32- 380C trong 7 ngày có thể loại trừ hoàn toàn những virus có ở đỉnh sinh trưởng (Krylova năm 1973 đã quan sát được 12 tiêu bản virus trên 80- 10nm đỉnh sinh trưởng). Hàng loạt các loại cây trồng làm thức ăn gia súc, cây rau, cây ăn quả, cây hoa… đã được làm sạch bằng phương pháp này. Để tạo cây sạch bệnh, hoá chất cũng được sử dụng và cho hiệu quả rất tốt. Kết hợp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và sử lý hoá chất giúp cho việc loại bỏ vius có hiệu quả hơn. Các đồng phân của purine và pirimidine, amino acid, hormon sinh trưởng thực vật và các kháng sinh là những hoá chất thường được sử dụng. Nó có tác dụng kìm hãm hoạt động của virus. Gần đây người ta còn sử dụng một số nhóm các chất khác như arabinoside hoặc vidarabine để làm sạch virus trong quá trình nuôi cấy mô phân sinh ở khoai lang cũng cho kết quả rất tốt. Từ năm 1952 các nghiên cứu sinh của Morel ( nhà khoa học Mỹ) đã cho thấy kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ( Meristem) rất có hiệu quả trong việc làm sạch virus. Bằng kỹ thuật này đã làm sạch bệnh cho 55 loài cây trồng, 23 loài cây cảnh, 11 loài cây ăn quả, 8 loài cây có củ và 7 loài cây công nghiệp. Như vậy bằng việc kết hợp giữa biện pháp nhiệt, xử lý hoá chất và nuôi cấy đỉnh trưởng đã tạo ra rất nhiều giống cây sạch bệnh, giảm thiểu sự thiệt hại do các nguồn bệnh nói chung và virus nói riêng đối với sản xuất nông nghiệp. Trung Quốc là nước tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy mô rất sớm (từ thập kỷ 40-50). Năm 1970 Tsui đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh chồi làm sạch virus. Bằng kỹ thuật vi nhân giống đến nay đã nhân được hơn 700 loài. Hàng năm nhân được khoảng 220 triệu cây và trồng trên diện tích hơn 1 triệu ha bao gồm: khoai tây, chuối, táo, nho, cây cảnh, cây lâm nghiệp… 2.Nhân nhanh invitro với số lượng lớn Phương pháp nhân giống in vitro là phương pháp nhân giống vô tính có khả năng tạo nhanh một quần thể có độ đồng đều cao, sạch bệnh. Quần thể vô tính này tránh được sự thoát ly, thoái hoá giống hay gặp trong quần thể cây trồng từ hạt đồng thời sử dụng đầy đủ tiềm năng về di truyền của cả bố và mẹ (additive and non – additive componen). Nhân giốn in vitro hay vi nhân giống thực chất là nhân bản thực vật nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Dựa vào tính toàn năng của tế bào thực vật, bằng việc nuôi cấy mô tế bào trong thời gian ngắn đã cho ra một số lượng lớn cây giống có đủ phẩm chất để đem sản xuất. Để tạo ra một thế hệ các cá thể đồng đều mới từ hạt có ba con đường: Các cá thể mới xuất phát từ hạt của các dòng tự thụ; từ hạt F1 của tổ hợp lai bố mẹ đồng đều; từ hạt Apomitic. Đối với nhiều loại thực vật thời gian sinh trưởng quá dài, hơn nữa hạt thường mất sức sống một cách nhanh chóng. Sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã khắc phục được nhược điểm này. Trong nhân giống in vitro, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một phương thức rất hữu hiệu để cho ra những giống cây trồng sạch bệnh. Nó đã được áp dụng cho việc phục tráng giống ở các loài hoa, cây cảnh, rau… Đối với các loài thân gỗ, do việc tái tạo lại cơ thể hoàn chỉnh bằng nuôi cấy mô là rất khó nên tới năm 1968 Winton mới lần đầu tiên tạo được một cây hoàn chỉnh bằng kỹ thuật in vitro đó là cây Populus tremiloids. Kể từ đó kỹ thuật nhân giống in vitro đã được áp dụng để nhân thành công nhiều loại cây. Một số nước như ấn Độ, Trung Quốc đã sử dụng thành công kỹ thuật nhân giống in vitro vào việc nhân giống cây bạch đàn. Hiện nay đã nhân giống thành công trên 20 loài bạch đàn khác nhau và Trung Quốc là nước sớm ứng dụng nuôi cấy mô vào trồng trên diện tích rộng. Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn nhỏ trên thế giới áp dụng để nhân khoảng 500 triệu giống cây trong nhiều năm ở các giống cây trồng khác nhau. Dự kiến thị trường cây giống nhân bằng kỹ thuật nuôi cấy mô vào khoảng 15 tỷ USD/năm và tốc độ tăng trưởng hàng năm của thị trường vào khoảng 15%. Công nghệ nuôi cấy mô phục vụ nhân giống cây trồng đã được triển khai trên 20 năm ở nước ta. Nhân giống thương mại quy mô lớn đã được thực hiện ở một số giống cây trồng như nhân nhanh giống chuối, giống khoai tây sạch bệnh, các giống mới nhập nội, các dòng bạch đàn và keo lai đạt công suất khoảng 3 triệu cây/năm. Quy trình công nghệ nhân giống đã được nhiều viện, trường nghiên cứu hoàn thiện ở nhiều cây trồng khác nhau như cây có múi, đu đủ, các loài lan, các loài thuốc quý, cây cà phê, cây tếch… Việc thương mại hoá các công trình trên đây là chìa khoá quan trọng để mở rộng phạm vi ứng dụng công nghiệp in vitro ở nước ta trong 10 năm tới. Những thành tựu trên vẫn chủ yếu dựa vào các phương pháp nuôi cấy mô truyền thống, trong đó cây hoàn chỉnh được tái sinh trong ống nghiệm, bình tam giác… không đủ đáp ứng nhu cầu của sản xuất trước mắt.Do vậy đã có nhiều nghiên cứu nhằm tăng cường hệ số nhân, nâng cao chất lượng cây giống và tự động hoá quá trình nhân giống vô tính thông qua sử dụng các phương thức nhân giống mới, các hoạt chất sinh học mới… Quá trình sản xuất cây cấy mô Qua trình sản xuất vi nhân giống bao gồm năm giai đoạn chính và mỗi giai đoạn có những đòi hỏi riêng. Giai đoạn I: Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc Giai đoạn này gồm các khâu như: Chọn lọc cây mẹ để lấy mẫu. Cây mẹ thường là những cây ưu viết, khoả mạnh, có giá trị kinh tế cao. Chọn cơ quan để lấy mẫu, thường là chồi non, đoạn thân có chồi ngủ, hoa non, lá non… Mô chọn để nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị. Tuỳ theo điều kiện giai đoạn này kéo dài từ 3 đến 6 tháng. Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy Giai đoạn này bao gồm các khâu như sau: Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo. Giai đoạn này gọi là giai đoạn cấy mẫu in vitro. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm nấm, khuẩn hoặc virus sẽ được lưu giữ trong phòng nuôi cấy với điều kiện thích hợp về ánh sáng, nhiệt độ. Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ), hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính. Giai đoạn 2 thông thường yêu cầu 2 đến 12 tháng hoặc ít nhất là 4 lần cấy chuyển các mảnh cấy. Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi Khi mẫu đã được tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi hoặc các phôi vô tính sinh trưởng tốt, quá trình nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất. Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy. Thành phần và điều kiện phải được tối ưu hoá nhằm đạt được mục đích nhân nhanh. Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường trong khoảng 1-2 tháng tuỳ từng loại cây. Tỷ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần/4 lần cấy chuyển. Nhìn chung giai đoạn 3 kéo dài trong khoảng 10 đến 36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ vài chồi ban đầu nên không kéo dài quá lâu. Ví dụ đỉnh sinh trưởng của một cây chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân lên khoảng 2000-3000 chồi cây sau 7-8 lần cấy chuyển để tránh biến dị xoma. Đối với các loài cây khác như mía, hoa cúc, hoa phong lan chỉ sau một năm có thể nhân được 1.000.000 chồi từ cây mẹ ban đầu. 4.Giai đoạn 4: Tạo rễ Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng thông thường các chồi này cần phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ, ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi được cấy chuyển trực tiếp ra đất. Giai đoạn 4 thông thường cần từ 2-8 tuần. 5.Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng Đây là giai đoạn đầu tiên cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên. Đối với một số loài có thể chuyển chồi chưa có rễ ra đất, nhưng đa số các loại cây trồng thì chỉ sau khi chồi đã ra rễ và tạo cây hoàn chỉnh mới được cấy chuyển ra ngoài vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài vườn ươm. Quá trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu chăm sóc đặc biệt. Vì cây được chuyển từ môi trường bão hoà hơi nước sang vườn ươm với những điều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm phải đáp ứng những yêu cầu sau: Cây được che bằng nilon bao phủ và hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát. Giá thể trồng cây có thể là đất mùn hoặc hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa, bọt biển. Giai đoạn 5 thường đòi hỏi từ 4-16 tuần. VàI nét về cây hông 1.Đặc điểm sinh thái Cây hông hay còn gọi là cây bao đồng có tên khoa học là Paulownia thuộc chi Paulownia họ Scrophulariaceae sinh trưởng tự nhiên ở Trung Quốc, Đài Loan, Campuchia, Việt Nam… Tại Việt Nam cây hông có hai loàI là: p. Fortunei và P. Elougata mọc tự nhiên ở Miền Bắc: Lào Cai, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái Nguyên (Phạm Hoàng Hộ, 1993; Trần Hợp và Nguyễn Bội Quỳnh, 1993; Vũ Xuân Phương, 1995; Vũ Văn Dũng, 1996). Nó được đưa vào Châu Âu , bắc Mỹ vào giữa thế kỷ 19 và sau này là Nam Mỹ, Australia và New Zealand. Cây hông là cây thân gỗ, cao 20 – 30m. Vỏ thân trắng xám hoặc xám vàng không có lông, phần non có lông, phân nhánh. Lá đơn mọc đối, phiến lá lớn, dài 25cm hoặc hơn hình trứng dài hoặc bầu dục, nhọn dần về phía chóp lá. Cuống lá dài 6 – 2cm. Hoa mọc hợp thành chuỳ dài 8 – 10cm, đài cứng xẻ 5 răng. Tràng hoa hợp thành ống, phía trong có những điểm lấm tấm màu tím, phía trên có 5 thuỳ tròn, có lông; 4 nhị trong đó có 2 nhị dài. Quả nang hình bầu dục, dài 6 – 7cm, vỏ ngoài khá dày, hoá gỗ; quả chứa nhiều hạt nhỏ, khi chín tự nở, hạt dài 6mm, có cán trong suốt. Cây hông là cây ưa sáng, ưa khí hậu mát mẻ, thường thấy mọc ở những vùng đồi núi thấp, ở độ cao 300 – 800m so với mực nước biển. Cây sinh trưởng nhanh ở những nơi có điều kiện thích hợp, mỗi năm có thể tăng trưởng tới 3m về chiều cao. Cây còn non sinh trưởng rất nhanh nhưng đến năm 30 tuổi thì tốc độ sinh trường chậm dần. Do hạt nhỏ, có cánh nên khả năng phát tán theo gió mạnh. Cây mềm yếu, nhỏ, khó đâm qua được tầng cành khô lá rụng, ít gặp tái sinh dưới rừng. 2.Các nghiên cứu về cây hông trên thế giới và Việt Nam Nghiên cứu trên thế giới Năm 1986, Zhu và cộng sự cho rằng cây hông được sử dụng vào nhiều mục đích như thân làm gỗ, lá làm phân bón và thức ăn gia súc, hoa làm thuốc… Năm 1988, Marcotrigiano và Jagnnathan nghiên cứu thấy rằng cây hông có nguồn gốc ở vùng Đông Nam á, được trồng nhiều nơi trên thế giới, có khả năng thích nghi với vùng đất có điều kiện khí hậu không thuận lợi. Cây hông có thể trồng từ hạt, đoạn rễ hay đoạn thân, tuy nhiên phương pháp nuôi cấy mô được xem là phương pháp hữu hiệu nhất để nhân nhanh các dòng hông có đặc tính ưu việt (Rao và cộng sự, 1996; Bergmann và Moon, 1997; Kuman và cộng sự , 1998). Cây hông được nuôi cấy in vitro trong điều kiện quang tự dưỡng (có 20g/l đường và Vitamin trong MS) tăng trưởng tốt hơn rõ rệt so với cây nuôi cấy trong điều kiện dị dưỡng. Trong điều kiện môi trường quang tự dưỡng, cây hông in vitro tăng trưởng nhanh hơn trong điều kiện nồng độ CO2 của phòng nuôi cấy được tăng đến 160mm/ml dưới cường độ ánh sáng 250mm m-1s-2 (Kozai và Iwanami, 1988; Kozai, 1991; Kirdmanee, 1995). Nghiên cứu ở Việt Nam *Tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc trung tâm nghiên cứu giống cây rừng Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam, các nhà khoa học đã tiến hành một số nghiên cứu về vi nhân giống cây hông như sau: - Tạo mẫu nhân giống in vitro bằng chồi ở cây 1- 2 năm tuổi tốt hơn từ hạt và khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút cho tỷ lệ nhiễm bệnh ít nhất. - Tạo chồi chỉ cần dung dịch MS với BAP nồng độ 1,0ml/l. - Sử dụng IBA với nồng độ 1mg/l để tạo rễ và đạt tỷ lệ rễ nhiều nhất (100%) và có chỉ số rễ/hom, chiều dài rễ cao nhất. - Đưa cây từ bình thí nghiệm ra môi trường đất cho tỷ lệ sống cao hơn môi trường cát. * Tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện sinh học nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh cũng tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cây hông theo một số hướng sau: -+ Cây hông có thể được tạo ra và nhân chồi từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng chồi bên và từ cuống lá. Nồng độ BAP 0,5mg/l cùng NAA 0,1mg/l là thích hợp nhất cho sự tạo chồi từ nuôi cấy chồi đỉnh và cuống lá. + Môi trường tạo rễ và cây con hoàn chỉnh tối ưu là 1/2 hàm lượng dinh dưỡng khoáng MS + 20g/l đường, 0,5mg/l NAA + 1g/l than hoạt tính. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy lên sự tăng trưởng và phát triển của cây hông in vitro cho kết luận là: + Cây hông phát triển tốt hơn khi sự trao đổi khí của bình nuôi cấy được tăng bằng cách sử dụng nút giấy thay nút cao su đậy bình tam giác hoặc màng millipore trên nắp hộp magenta. + Cây hông phát triển tốt hơn trên môi trường có giá thể xốp như Perlite. Ngoài ra, ở điều kiện này cây hông có thể phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin. - Kỹ thuật ươm cây hông giai đoạn sau ống nghiệm. + Che nilon và tưới phun sương 15 – 30 phút/ lần giúp cho cây có tỷ lệ sống cao (90- 95%). + Giá thể trồng không thích hợp cho cây Paulownia ở giai đoạn đầu và tro trấu tỷ lệ 1:1 cho tỷ lệ sống tốt. + Thời gian ươm tối thiểu cho cây thích nghi môi trường bên ngoài là 14 ngày. + Giá thể chuyển tiếp tốt đối với Paulownia 21 ngày tuổi là đất + tro + phân chuồng tỷ lệ 1:1:1. + Phân bón qua lá RAD – G, KOMIC, HVP, HP – 206G có tác dụng tốt cho cây lớn nhanh, đạt tiêu chuẩn xuất vườn. *Tại phòng nuôi cấy mô và tế bào Viện di truyền Nông nghiệp Hà Nội cũng tiến hành một số thí nghiệm về cây hông được một số kết quả như sau: - Sử dụng HgCl2 0,1% trong 3 phút cho hiệu quả khử trùng cao, không gây độc cho mẫu. - Môi trường cơ bản MS (3% đường + 0,6% agar) có bổ xung 2mg/l BAP là môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân chồi (hệ số nhân đạt 5,1 lần). - Môi trường cơ bản MS (3%đường + 0,6% agar) có bổ xung 2mg/l BAP và nước dừa cho thấy hệ số nhân chồi không đổi nhưng các chồi hông phát triển tốt hơn, lá cây khoẻ, không mọng nước. - Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh trong môi trường MS/2 (3%succarose + 0,5mg/l NAA) với thời gian ra rễ 15 ngày. - Giá thể (1đất + 1cát) để ươm cây hoàn chỉnh cho hiệu quả sống sót cao nhất (82%) so với giá thể đất hay cát độc lập. Phần II. Phương pháp nghiên cứu I. Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu: các chồi, mô lá, đốt thân của cây hông (Paulownia) được chọn làm vật liệu nghiên cứu. II.Phương pháp nghiên cứu 1. Môi trường nghiên cứu Đối với toàn bộ thí nghiệm môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường khoáng MS (Murashige và Skoog, 1962). Môi trường có bổ sung agar, đường, succarose, inositol, than hoạt tính, pH= 5,8. Nuôi cấy ở nhiệt độ là 250C, ánh sáng 2000 lux, chu kỳ chiếu sáng 12h/12h. 2.Thí nghiệm a. Thí nghiệm tạo nguồn nguyên liệu Thí nghiệm được tiến hành với môi trường nuôi cấy bổ sung NAA 0,05 mg/l và BAP với các nồng độ: Công thức 1: BAP 0mg/l Công thức 2: BAP 0,5mg/l Công thức 3: BAP 1,0mg/l Công thức 4: BAP1,5mg/l Công thức 5: BAP 2,0mg/l b. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hệ số nhân chồi Môi trường nuôi cấy là môi trường bán lỏng có 3% succarose và lượng agar bằng 80% so với môi trường đặc. Ngoài ra môi trường còn được bổ sung BAP với các nồng độ như sau: Công thức 1: BAP 0mg/l Công thức 6: BAP 1,0mg/l Công thức 2: BAP 0,1mg/l Công thức 7: BAP 1,3mg/l Công thức 3: BAP 0,3mg/l Công thức 8: BAP 1,5mg/l Công thức 4: BAP 0,5mg/l Công thức 9: BAP 1,8mg/l Công thức 5: BAP 0,7mg/l Công thức 10: BAP 2,0mg/l Mật độ cấy tăng 50% so với các thí nghiệm trước kia (15 mẫu/bình). c. Thí nghiệm vươn chồi Thí nghiệm này chúng tôi tiến hành với môi trường nuôi cấy bổ sung BAP với các nồng độ: Công thức 1: BAP 0 mg/l Công thức 2: BAP 0,1mg/l Công thức 3: BAP 0,3mg/l Công thức 4: BAP 0,5mg/l Công thức 5: BAP 0,7mg/l Môi trường nuôi cấy cũng là môi trường bán lỏng, mật đội cấy tăng 100% (20mẫu/bình), cấy theo phương pháp đặt. d. Thí nghiệm nghiên cứu sự ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ in vitro Chúng tôi tiến hành thí nghiệm ra rễ Invitro bằng cách bổ xung vào môi trường nuôi cấy NAA với các nồng độ: Công thức 1: NAA 0mg/l Công thức 2: NAA 0,1mg/l Công thức 3: NAA 0,2mg/l Công thức 4: NAA 0,3mg/l Công thức 5: NAA 0,4mg/l e. Thí nghiệm ra rễ in vivo Với thí nghiệm này chúng tôi sử lý nhúng chồi vào dung dịch NAA với các nồng độ: Công thức 1: NAA 0ppm Công thức 2: NAA 5ppm Công thức 3: NAA 10ppm Công thức 4: NAA 50ppm Công thức 5: NAA 100ppm Và trồng trên các giá thể Giá thể 1: Cát Giá thể 2: Phù sa + cát (tỷ lệ 1:2) Giá thể 3: Phún xuất núi lửa (kích thước 0,3 – 0,5cm). g. Giai đoạn vườn ươm Sau giai đoạn ra rễ cây được trồng vào bầu đất ở vườn ươm. Kích thước bầu là 10x15cm. Hỗn hợp bầu gồm: đất + than bùn + phân chuồng với tỷ lệ 1:1: 0,5. Phần III. Kết quả và thảo luận ở Việt Nam việc nghiên cứu về cây hông còn rất mới mẻ. Với đặc thù là một cây thân gỗ nên việc nhân giống cây hông không hề đơn giản. Chính vì vậy phương pháp nuôi cấy mô tế bào là một phương pháp hữu ích cho việc nhân số lượng lớn cây trồng. Phương pháp này cho phép tạo ra một quần thể cây con đồng đều giữ nguyên đặc tính của cây mẹ với số lượng lớn, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ sớm khắc phục những bất lợi của điều kiện kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ khắc phục những bất lợi của điều kiện môi trường. Tuy nhiên việc nhân giống bằng phương pháp cấy mô tế bào thực vật hiện nay mới được đặc biệt quan tâm. Thừa hưởng những kết quả trên nhiều loại cây trồng và một số kết quả nghiên cứu về cây hông, chúng tôi tiến hành việc nhân giống cây hông tại phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật – Viện di truyền nông nghiệp. I. Tạo nguồn nguyên liệu Để có thể tiến hành được công tác nhân giống thì việc đầu tiên chúng ta phải làm là tạo nguồn nguyên liệu. Chỉ khi có được nguồn nguyên liệu tốt và đảm bảo chất lượng thì mới có thể dẫn đến một quy trình nhân giống thành công và hiệu quả. Chúng tôi đã tiến hành tạo nguyên liệu bằng cách lựa chọn những cây sinh trưởng khoẻ có kích thước lớn trong quần thể rồi chọn những chồi non gần ngọn để làm mẫu. Sau đó mẫu được rửa kỹ bằng dung dịch xà phòng 10% trong 5 phút rồi tráng nhiều lần bằng nước cất rồi rửa bằng cồn 700 sau đó tráng sạch bằng nước cất. Tiếp tục khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong 3 phút. Mẫu được làm sạch lần cuối bằng nước cất nhiều lần. Cắt mẫu thành từng lát mỏng dầy 0,2 – 1,2 mm cấy vào môi trường. Môi trường nuôI cấy là môi trường MS cơ bản có bổ sung NAA 0,5mg/l và BAP với các nồng độ như sau: 0; 0,5; 1; 1,5; 2mg/l. Sau 45 ngày theo dõi chúng tôi thu được các chồi từ callus tốt nhất trên công thức có nồng độ BAP 2mg/l. II.Nhân nhanh Các nghiên cứu thuộc giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp nhất cho quá trình nhân nhanh chồi là giai đoạn quyết định hiệu quả của công nghệ nhân giống.. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật BAP là một Cytokinin có tác dụng tạo chồi mạnh, kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra nó còn có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, tăng cường sự hoạt động của một số enzyme được sử dụng rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh chồi. Những nghiên cứu trước đây người ta sử dụng phối hợp BAP và N