Đề tài Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1960 tại miền Nam và đầu những năm 1970 tại miền Bắc. Tuy nhiên chỉ những cuối năm 1980 trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật mới phát triển mạnh mẽ và được đưa vào ứng dụng. Trong đó kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kĩ thuât chính. Những thành công của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã chứng tỏ khả năng ứng dụng hiệu quả trong nhiều lĩnh vực, trong đó có bảo tồn ex situ những nguồn gen quý hiếm. Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép chúng ta nhân nhanh một lượng lớn cây giống trong ống nghiệm mà chỉ cần số lượng mẫu ít (thậm chí chỉ cần một chồi). Ngoài ra, kĩ thuật nhân nhanh trong ống nghiệm nhằm tạo ra một quần thể cây con có chất lượng đồng đều về mặt di truyền. Hiện nay, cây Ngưu tất được trồng và mọc chủ yếu ở Sapa, Tam Đảo, Hà Nội... Do chúng được sử dụng khá phổ biến trong y học cổ truyền với nhu cầu ngày càng tăng như: làm giảm cholesterol trong máu, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị ung thư, chữa trị các bệnh về khớp… Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh cây Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” nhằm nhân giống và bảo tồn nguồn gen cây Ngưu tất trong ống nghiệm. Mục đích và yêu cầu Mục đích Nghiên cứu quy trình nhân nhanh và bảo tồn cây Ngưu tất trong ống nghiệm bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Yêu cầu Xác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm. Xác định môi trường thích hợp để tạo đa chồi cây Ngưu tất. Xác định môi trường thích hợp để tạo rễ cây Ngưu tất. Xác định giá thể thích hợp để đưa Ngưu tất ra ngoài tự nhiên. PHẦN 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Ngưu tất 1.1.1. Đặc điểm sinh học Tên việt nam: Cây Ngưu tất Tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume Thuộc họ Giền (Amaranthaceae). Đặc điểm hình thái: Ngưu tất là cây thân thảo, sống lâu năm, cao 60-80 cm, rễ củ hình trụ dài, có nhiều rễ phụ. Thân phình lên ở những đốt, màu lục hoặc nâu tía. Cành mọc gần như thẳng đứng. Lá mọc đối xứng hoặc hình mác. Gốc thuôn hẹp, đầu nhọn dài từ 5-10 cm, rộng từ 1-4 cm, hai mặt nhẵn, gân lá mặt trên thường có màu nâu tía, mép lá uốn lượn, cuống lá dài từ 1-1,5 cm. Cụm hoa là một bông dài từ 2-5 cm, mọc ở ngọn thân và kẽ lá đầu cành, hoa rất nhiều, thường gập xuống sít vào cuống của cụm hoa, sau khi đã nở lá bắc dài 3mm, 5 lá dài, 5 nhị, bầu hình trứng. Hoa mọc hướng lên nhưng khi biến thành quả sẽ mọc quặp xuống. Quả nang, hình bầu dục, chỉ chứa một hạt [29] [30]. Cây thường mọc ở Trung Quốc và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Cây Ngưu tất thích hợp gieo trồng ở điều kiện của nước ta và phát triển tốt, được trồng nhiều ở vùng núi cao, trung du và đồng bằng nhất là ở Đồng Bằng Bắc Bộ: Hưng Yên; Hà Nội; các trung tâm nghiên cứu cây trồng và chế biến cây thuốc [29]. Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn. Đất phù sa cao ráo, thoát nước rất phù hợp với cây Ngưu tất [32]. Thành phần hóa học Rễ chứa các Saponin, khi thủy phân cho các Sapogenin là axit oleanolic. Rễ Ngưu tất có chứa axitd oleanolic 0,096%, saponin toàn phần 4,04% và axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranosid. Rễ còn chứa ecdysteron và inokosteron. Hàm lượng ecdysteron khoảng 0,037%. Ngoài ra còn có ecdysteron, inokosteron, glucose, galactose, rhamnoza, muối kali và một số thành phần khác như betain, polysaccharide, emodin, physcion [31]. 1.1.2. Giá trị cây Ngưu tất Giá trị y học Ngưu tất vị đắng, chua, tính bình, quy vào hai kinh can, thận. Tác dụng hoạt huyết, thông kinh, hoạt lạc, mạnh gân cốt, lợi niệu trừ sỏi, hạ huyết áp, giảm cholesterol trong máu, giải độc chống viêm [30]. Tác dụng dược lý: - Chống viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và mạn tính của phản ứng viêm. - Gây teo tuyến ức chuột cống đực non. Tác dụng gây teo tuyến ức là một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch. - Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng cholesterol từ ngoài vào và gây ức chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng kéo dài. Có độc tính thấp. - Chế phẩm Solamin trong thành phần có Ngưu tất và một số dược liệu khác đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng chống viêm và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng. Kết quả tốt nhất và tương đối nhanh đối với đau lưng cấp do lạnh và sang chấn. Ðối với viêm đa khớp dạng thấp, chưa có biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn thuần, tác dụng điều trị tương đối tốt. Khi đã có biến dạng về xương, cơ, khớp, kết quả kém. Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể. Công dụng Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt, đái ra máu hoặc sỏi, bụng dưới kết hòn cục, đẻ khó hoặc khi đẻ rau thai không ra, sau khi đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức mỏi. Ngưu tất sao tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân co quắp hoặc bại liệt [30]. Giá trị kinh tế Cây Ngưu tất là loại cây dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, chỉ cần đất pha cát, tơi xốp, nhiều mùn, đất phù sa cao ráo, thoát nước là có thể phát triển tốt. Nó không đòi hỏi tốn công chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao nhưng lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng. 1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 1.2.1. Lược sử phát triển Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua hơn 100 năm phát triển. Ngày càng có nhiều ứng dụng và làm sáng tỏ lý thuyết về tính toàn năng của tế bào. Có thể thấy sự phát triển của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật luôn song song với lịch sử các ngành khoa học sự sống khác. Các giai đoạn chính của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [1] [3] [9] [15]. - Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng học thuyết cơ bản của sinh học gọi là thuyết tế bào và nêu rõ: + Mọi cơ thể sống đều cấu tạo từ một hoặc nhiều tế bào. + Tế bào là đơn vị cấu trúc chức năng cơ bản của cơ thể sống, là hình thức nhỏ nhất của sự sống. + Tế bào chỉ được tạo ra từ tế bào trước đó. - Người đầu tiên là Haberlandt (1898) đề xuất ra lý thuyết về tính toàn năng của tế bào, ông cũng là người đầu tiên đưa ra các giả thuyết của Schleiden và Schwann vào thực nghiệm. Ông đã đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào. Theo ông, mỗi tế bào bất kì của cơ thể sinh vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Haberlandt đã nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng chưa thành công. - Đến năm 1922, Robbins và Kotte đã thành công trong nuôi cấy đầu rễ cây hòa thảo kéo dài 12 ngày trong môi trường lỏng gồm có muối khoáng, glucose. - Năm 1934, White (Mỹ) đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước chiết nấm men. Sau đó ít lâu White đã chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit nicotinic. Cùng năm, Gautheret thành công trong việc nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng của cây Salic apraea và cây Populus nigra. Mô nuôi cấy đã phân chia liên tục trong môi trường Knop bổ sung glucose và cysteinhyochloride. - Went và Thimann (1937) đã phát hiện ra chất sinh trưởng thực vật đầu tiên là axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ. - Năm 1938 Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trưởng với thời gian vô hạn của mô sẹo cà rốt trên môi trường thạch bằng cách cấy chuyển đều đặn 6 tuần/lần. - Năm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà. Trong thời gian này, nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit (NAA), và 2,4 Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D). Nhiều tác giả đã nhận thấy cùng với nước dừa, 2,4-D và NAA đã giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật mà trước đó rất khó nuôi cấy. - Năm 1954, Skoog đã phát hiện ra Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) là chất điều khiển quá trình phân bào và phân hóa chồi. Sau này người ta cũng tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngô có hoạt tính tương tự Kinetin. Cả 2 chất này đều thuộc nhóm Cytokinin. - Năm 1960, Bergman đã phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên một bước mới là tạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật trên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật. Cũng năm 1960, Cooking đã dùng men cellulase để phân hủy cellulose của tế bào thực vật và thu được các tế bào trần (protoplast). - Guha và Maheswari (1964) công bố tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. - Bourgin và Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở ra nhiều triển vọng ứng dụng tạo cây đơn bội vào công tác giống và nghiên cưu di truyền. - Đến năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh từ protoplast thuốc lá giống Xanthi. - Melchers (1977) lai soma thành công cây cà chua và cây khoai tây. - Năm 1985 cây thuốc lá mang gen biến nạp đầu tiên được công bố. - Năm 1994 là năm đánh dấu cây cà chua đầu tiên (cà chua Flav’rSav’r) có mặt trên thị trường thực phẩm Hoa Kì. Cùng năm 1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp được đưa vào sản xuất đại trà tại Na Uy. Đến nay đã có hàng trăm loài cây được nuôi cấy mô thành công với nhiều mục đích khác nhau như nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô và chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh tạo chồi mà nhiều giống cây trồng chuyển gen đã được tạo ra (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [15]. 1.2.2. Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đủ của cơ thể sinh vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng. Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [1] [13]. 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro Mẫu nuôi cấy Muashige (1974) ghi nhận sự quan trọng của việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp, điều quan trọng cho thấy một số nhân tố khi chọn lọc mẫu bao gồm: kiểu gen, cơ quan được chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu. + Kiểu gen: Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy. Với loài thuốc lá được sử dụng như cây kiểu mẫu, Cheng và Smith (1973) ghi nhận sự khác nhau giữa các genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lồi. Hơn nữa, Jaramillo và Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng và đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cây cà chua. + Cơ quan: Muashige (1974) cho rằng hầu hết các loại cơ quan và mô đều có khả năng sử dụng để nuôi cấy invitro. Mẫu nuôi cấy in vitro khác nhau ở các loài khác nhau, như ở Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy. Theo Doerschung và Miller (1976) cho rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫu nuôi cấy ở các cây nảy mầm từ hạt. + Tuổi và sinh lý: Tuổi thực của mẫu nuôi cấy và tuổi theo mùa trong năm của mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến sự biệt hóa và tuổi của sinh lý. Có nhiều nghiên cứu khác nhau về ảnh hưởng của tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy. Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh trên lá non và không phát sinh trên lá già. + Mẫu in vitro: Trong những năm gần đây, nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả năng tái sinh cao hơn mẫu lấy từ cây mẹ trên đồng ruộng hay trong vườn ươm như cây Azalea. + Sức sống của mẫu: Điều cần nhận thấy rằng mẫu cây mẹ có ảnh hưởng rất quan trọng đến nuôi cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy nhất là đối với những cây bị bệnh,nếu nuôi cấy cây bị bệnh thì sẽ có một số lượng lớn mẫu cây bị bệnh được nhân lên [13]. Điều kiện nuôi cấy Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô là từ 20-27oC. Theo Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sự sinh trưởng và phát triển trong quá trình nuôi cấy in vitro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào cơ quan. Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng là một nhân tố quan trọng trong quang hợp, ảnh hưởng đến khả năng nuôi cấy in vitro cây lá xanh. Ảnh hưởng của ánh sáng có liên hệ đến các loài, có loài chịu ánh sáng cao, có loài chịu ánh sáng thấp hay tối, có loài chịu ánh sáng trung bình. Việc nuôi cấy in vitro tốt nhất trong điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [12]. Môi trường nuôi cấy Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp trong nuôi cấy mô tế bào là rất cần thiết. Vì mỗi loại cây trồng khác nhau đều cần một hàm lượng chất dinh dưỡng khác nhau. Mặt khác môi trường cũng thay đổi tùy thuộc vào sự phân hóa cua mô cấy, tùy theo trường hợp duy trì mô ở trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tái sinh cây hoàn chỉnh. Việc lựa chọn môi trường cần dựa vào tài liệu đã cho cùng đối tượng nuôi cấy hoặc thăm dò một số môi trường đã cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy. Chất kích thích sinh trưởng thực vật (KTSTTV) Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Auxin và Cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Auxin là chất kích thích sinh trưởng thực vật được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần khác trong môi trường dinh dưỡng để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được phối hợp sử dụng với nhóm Cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ Auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: + Kiểu tăng trưởng và phát triển của mẫu cần nghiên cứu. + Hàm lượng Auxin nội sinh có trong mẫu nuôi cấy. + Sự tác động qua lại giữa Auxin nội sinh và Auxin ngoại sinh. Đặc tính của Auxin Auxin có vai trò kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào. Đặc điểm chung của các Auxin là kích thích sự phân chia tế bào. Các hoocmon của nhóm này có các hoạt tính như tăng trưởng chiều dài thân, gióng, tính hướng đất, tính ưu thế ngọn và phân hóa mạch dẫn. Auxin cũng kích thích sự hình thành rễ bất định và sự giãn của tế bào làm cho kích thước tế bào tăng lên. Các Auxin thường liên quan đến độ dài của thân, đốt, chồi chính, rễ… Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, Auxin được sử dụng cho việc phân chia tế bào và phân hóa rễ. Những Auxin được sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy ô tế bào thực vật: + IBA (3-indol Butyric Axit) + IAA (Indol-3-Axetic Axit) + NAA (α-Naptalen Axetic Axit) + 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxy Axetic Axit) Đặc tính của Cytokinin Cytokinin là hoocmon phân bào, là dẫn xuất của Ađênin, có ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Các Cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: + BAP (6-Benzyl Amino Purin) + Kinetin (N-(2-Furfurylamin)-1-H-6- Amin) + Zeatin Hàm lượng của các loại Cytokinin có tác dụng kích thích từ rễ đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh mẽ sự tạo thành rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại Cytokinin nói trên thì BAP và Kinetin là hai loại hay được sử dụng nhiều nhất. Ngoài hai nhóm Auxin và Cytokinin, trong nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta cũng sử dụng thêm Gibberellin để kích thích sự kéo dài tế bào, qua đó làm tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA (Gibberellic axit) là loại Gibberellin được sử dụng thường xuyên nhất. Tuy nhiên, GA vẫn mẫn cảm với nhiệt độ, nó mất hoạt tính đến 90% sau khi hấp vô trùng. Vì vậy, muốn sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó đưa vào môi trường nuôi cấy [16]. 1.2.4. Các phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống vô tính cổ điển như giâm cành,chiết cành, ghép cành, tách dòng… Nhân giống in vitro hay vi nhân giống trong ống nghiệm là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus, nhân nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất [1]. Có ba phương thức để tạo cây in vitro: a. Hoạt hóa chồi nách Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách: - Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy loài cây hai lá mầm như khoai tây, hoa cúc, cây thuốc lá,… ) - Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra với cây một lá mầm như lúa, mía…). b. Tạo chồi bất định Chồi bất định là chồi mọc ra rừ các cơ quan, các bộ phận khác của cây, không phải là phôi. Ví dụ: Chồi hình thành từ callus (mô sẹo). Tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành,… Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo. c. Tạo phôi vô tính Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình hành từ các tế bào soma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo. Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cũng cần thực hiện hai quá trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tách các tế bào soma hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển của mô sẹo. Sự hình thành phôi trải qua hai bước chính: Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá trình này cần môi trường giàu Auxin, vì Auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin. Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy của giai đoạn này phải nghèo hoặc không có Auxin, với nồng độ Auxin cao thích kích thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng độ cao quá sẽ gây ức chế hoặc gây độc [12]. Các bước chính trong nhân giống in vitro Theo George (1993) quá trình nhân giống vô tính in vitro bao gồm các bước sau: Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và đang ở giai đoạn sinh trưởng và phát triển mạnh mẽ. Việc trồng các cây mệ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng bệnh hợp lý sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng khi tra đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng mẫu, giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tăng tỷ lệ mẫu tái sinh, mô tồn tại, sinh trưởng và phát triển tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển tốt của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách, đỉnh chồi hoa và sau đó là đoạn thân, mảnh lá. Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo chồi bất định… Vấn đề là cần xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung, môi trường có nhiều Cytokinin sẽ kích thích tạo chồi (Auxin/Cytokinin < 1: thì kích thích tạo chồi). Chế độ nuôi cấy thường là 25-27oC và 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-3000lux. Tuy nhiên đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy khác nhau đòi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau. Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta cấy chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường tạo rễ thường được bổ sung thêm một lượng nhỏ Auxin. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay cả khi ta không bổ sung Auxin. Bước 5: Đưa cây ra ngoài vườn ươm Để đưa được cây ra bên ngoài vườn ươm phát triển tốt ta cần phải đảm bảo một số yêu cầu sau: - Cây đảm bảo về chiều cao, số rễ, số lá. - Giá thể phải tơi xốp, sạch sẽ, thoát nước tốt. - Phải điều chỉnh độ ẩm, chế độ chiếu sáng vườn ươm, cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp. 1.2.5. Phương pháp nhân đa chồi Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi ngọn và các chồi bên từ các nách lá cấy vào môi truờng có chứa Cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của Cytokinin lúc này là ức chế quá trình ưu thế ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển. Các chồi bên này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới có bổ sung Cytokinin để tiếp tục tạo ra các chồi khác. Sau đó các chồi này được chuyển sang môi trường ra rễ và đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh. Phương pháp có ý nghĩa quan trọng trong thực tế vì: - Phương pháp này đơn giản hơn so với các phương pháp khác. - Tốc độ nhân giống cao. - Các cây đồng đều về mặt di truyền. - Cây con tăng trưởng rất tốt. Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: - Hàm lượng Cytokinin (loại và nồng độ). - Nhu cầu về nồng độ Cytokinin thay đổi theo từng giai đoạn nuôi cấy, những mô cấy còn non thì cần ít Cytokinin hơn các mẫu đã trưởng thành. - Thông thường trong quá trình tạo chồi, người ta sử dụng Auxin với nồng độ thấp phối hợp cùng Cytokinin ở nồng độ cao, tỷ lệ Auxin/Cytokinin thường 1/10. - Đôi khi nên để chồi ngọn phát triển trước khi tăng nồng độ Cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi bên. - Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì cần phải cắt bỏ ngọn của chồi để các chồi bên phát triển. - Không nên cảm ứng sự tạo thành mô sẹo với nồng độ Cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định mang các đột biến. - Trong một số trường hợp có thể kích thích sự tạo thành chồi bên bằng cách cấy vào môi trường lỏng. Môi trường lỏng này cần lắc hay không lắc tùy thuộc vào cây được làm thí nghiệm. - Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh trưởng sinh khối bị thay đổi. Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng cho nhiều loài thực vật, quy trình nhân chồi thường được thực hiện theo các bước như sau [5]. Sơ đồ tổng quát nhân nhanh trong phòng thí nghiệm 1.2.6. Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm một loạt các kỹ thuật khác nhau và có khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực bao gồm [12]. Kỹ thuật  Ứng dụng   Nuôi cấy hạt giống (Seed culture)  - Tăng khả năng nảy mầm của các hạt khó nảy mầm trong điều kiện bình thường. - Thúc đẩy quá trình nảy mầm bằng cách bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. - Tạo ra cây con dùng cho nuôi cấy mô phân sinh hoặc các bộ phận khác.   Hoa cái (Bầu quả, noãn)  - Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa. - Tạo cây đơn bội. - Tạo đa phôi.   Hoa đực (Bao phấn và hạt phấn)  - Tạo mô sẹo và cây đơn bội. - Tạo đột biến ở mức đơn bội. - Tạo dòng đồng hợp tử.   Phôi hợp tử  - Nuôi cấy cứu phôi khi lai xa. - Nhân các dòng lai xa. - Phá sự ngủ, nghỉ của hạt.   Mô sẹo  - Tạo phôi vô tính. - Nuôi cấy tế bào đơn và tách tế bào trần. - Tạo cây có biến dị soma.   Tế bào  - Tạo đột biến ỏe mức độ tế bào. - Tạo tế bào trần để lai vô tính. - Biến nạp gen. - Nuôi cấy tế bào đơn.   Đỉnh chồi (Đỉnh sinh trưởng)  - Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền. - Làm sạch virus. - Nghiên cứu sinh lý phát triển.   Phân hóa phôi vô tính (Somatic embryogenesis)  - Là đường hướng tái sinh chủ yếu ứng dụng: + Nhân nhanh + Sản xuất hạt nhân tạo - Cung cấp vật liệu để tạo các protoplast có khả năng tạo phôi.