Luận văn Nghiên cứu khả năng phân huỷ các hợp chất cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

a mức độ cản ánh sáng (độ đục), định lượng 1 cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)… Định lượng thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn: - Cách tiến hành: Đưa 10ml nước cất vô trùng có 3 giọt Tween 80 vào ống giống thạch nghiêng nuôi cấy được 3 ngày. Lắc đều, lấy 1ml mẫu có chứa VSV. Pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn. Dùng micropipet lấy 0,1ml dịch huyền phù trải đều trên mặt môi trường trong hộp petri. Nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, đếm số lượng khuẩn lạc VSV phát triển trong hộp petri, từ đó tính được số lượng tế bào trong 1ml mẫu lúc đầu theo công thức: N = a x 10 x n Với N: Tổng số CFU trong 1ml mẫu đem phân lập. n: Độ pha loãng mẫu. a: Số CFU trung bình đếm được trong một hộp petri. - Yêu cầu: + Không đếm hộp có khuẩn lạc mọc bung, mọc lan. + Chỉ đếm hộp có ít nhất 10 khuẩn lạc trở lên. Những hộp có số khuẩn lạc nhỏ hơn 10 không có giá trị thống kê. + Khi đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa tránh sự phát tán của bào tử vào không khí, gây nhiễm mẫu hoặc môi trường khác. 2.2.1.4. Phương pháp định danh nấm sợi [6] - Nguyên tắc: Các chủng VSV cần được xác định chủng loại, trước khi tiếp tục nghiên cứu hoặc sử dụng. Việc phân loại định danh cần tiến hành tỉ mỉ thông qua quá trình quan sát, mô tả hoặc các trắc nghiệm sinh hoá dựa trên một khoá phân loại nào đó. - Cách tiến hành phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp (YEA; MEA; Czapek) MT sau khi đổ vào hộp petri, để qua ngày khi bề mặt môi trường tương đối khô ráo rồi mới cấy. Cấy chấm điểm các chủng nấm tuyển chọn, tuỳ theo tốc độ phát triển của từng loài nấm mà cấy 1 hoặc 3 điểm. Đánh dấu vào vị trí cần cấy lên mặt đáy của đĩa MT bằng bút lông Khi cấy, úp ngược hộp MT và cấy bào tử vào các điểm đánh dấu trước, tránh sự rơi vãi bào tử trên bề mặt môi trường tại những vị trí không mong muốn. Sau khi cấy, đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng, trong tối và thường xuyên theo dõi 3 đến 7 ngày.  Quan sát đại thể: Ghi nhận các thông tin về khuẩn lạc của nấm (kích thước, hình dạng, màu sắc, sắc tố tiết ra môi trường, giọt tiết,..). mô tả mặt trên và mặt dưới môi trường thạch. Quy trình quan sát đại thể đặc điểm khuẩn lạc định loại: - Hình dáng - Kích thước (đường kính, chiều dày). Tốc độ phát triển của khuẩn lạc sau những thời gian nhất định (trên những môi trường xác định và ở những nhiệt độ xác định) - Dạng mặt (nhung mịn, mượt, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…) - Màu sắc của khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới. Sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc. - Dạng mép khuẩn lạc: Dày, mỏng, nhăn nheo, phẳng… - Giọt tiết nếu có (ít, nhiều, màu sắc..) - Mùi khuẩn lạc (có, không mùi) - Sắc tố hoà tan (màu sắc môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có. Các cấu trúc khác: Bó sợi, bó giá, các cấu trúc mang bào tử trần như đĩa giá hoặc túi giá, đệm nấm, hạch nấm vv ..  Quan sát đặc điểm vi học: Phương pháp cấy khối thạch: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp ( MEA, YEA, Czapek) trong các hộp petri. + Chuẩn bị các hộp petri, phiến kính, lá kính, bông thấm nước và nước cất vô trùng. + Đặt một hoặc hai khối thạch hình vuông có cạnh trên mỗi phiến kính (mỗi phiến kính chỉ cấy một chủng để nghiên cứu). + Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt khối thạch. + Nuôi cấy trong 3- 4 ngày quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x 100. + Quan sát trên kính hiển vi và mô tả các đặc điểm hình dạng, kích thước sợi nấm ,bào tử, nhánh, cuống sinh bào tử…  Màu sắc hệ sợi khí sinh và cơ chất còn non và khi già. Sợi có vách ngăn, không có vách ngăn, các hình thái đặc biệt nếu có.  Sinh sản vô tính hay hữu tính.  Đặc điểm của các cơ quan sinh sản vô tính,  Hình thái, kích thước của các loại bào tử (dạng bào tử trần, bào tử kín…) + Đặc điểm cuống sinh bào tử (giá bào tử): Hình dạng và cách sắp xếp cuống sinh bào tử (đơn hoặc thành bó, song không liên kết chặt chẽ, bó có liên kết chặt chẽ, liên kết thành mô giả). + Kiểu phân nhánh của cuống sinh bào tử: Không phân nhánh, phân nhánh đơn, phân nhánh nối tiếp hay phân nhánh đối xứng. + Màu sắc của cuống sinh bào tử: Không màu hoặc màu sáng, sặc sỡ hay màu tối. + Sự khác nhau về cấu tạo và vị trí của cuống sinh bào tử:  Vị trí: Đâm lên hay trúc xuống, bò ngang, thẳng.  Kích thước: Cao, thấp, mỏng hay dầy.  Hình dạng phần ngọn của cuống (tròn, vuông, lồi…).  Bề mặt của cuống: Phẳng, lồi, xù xì hay gai.  Nơi xuất phát: Từ sợi khí sinh hay cơ chất. + Đặc điểm của bào tử: Đơn bào hoặc đa bào, có hay không có vách ngăn, có hay không có các sợi phụ, không màu, màu sáng, màu rực rỡ hay tối, toàn bộ đám bào tử màu gì? Được sinh ra trực tiếp từ sợi nấm hay từ sợi nấm do đứt gẫy hoặc được tạo ra trên cuống sinh bào tử. Xếp đơn độc , thành chuỗi hay tụ tập thành cụm. Hình dạng bào tử (hình cầu, ôvan, elíp,..). Bề mặt nhăn hay gai, sần sùi hay có các sợi tơ hoặc đuôi. 2.2.2. Phương pháp sinh học 2.2.2.1. Xác định khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi - Nguyên tắc: Khả năng phân giải cacbuahydro được đánh giá bằng sự sinh trưởng của VSV (lượng sinh khối khô) trên MT có thành phần cacbuahydro. - Tiến hành: + Chuẩn bị các bình tam giác dung tích 250 ml có chứa 47,5 ml môi trường khoáng nước biển và 2,5 ml dầu D.O (dầu hoả, toluen) có khối lượng tương đương 2,1g ( 4%). + Vô trùng môi trường ở 121oC trong 30 phút. + Cấy chủng nấm sợi nghiên cứu lấy từ bề mặt thạch nghiêng đưa vào bình tam giác khoảng 6,3.106 CFU/ml. Bình đối chứng không cấy nấm sợi. Nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày ở nhiệt độ phòng. - Yêu cầu: Đánh giá mức độ phát triển của nấm sợi qua sinh khối khô, mức độ mất các giọt dầu và mùi dầu trong MT. 2.2.2.2. Xác định hàm lượng dầu bị phân giải - Đưa 15ml n-Hexan vào bình tam giác chứa 50ml dịch nuôi cấy sau 15 ngày. - Lắc trên máy 200 vòng/ phút trong 40 phút. - Dùng pipet lấy lớp dịch dầu đã hoà tan trong n-Hexan sang lọ nhựa đã biết trước khối lượng (ký hiệu mo). - Cho tiếp 10ml n-Hexan vào dịch còn lại rồi làm tương tự như trên. - Sấy lọ nhựa chứa hỗn hợp dầu hoà tan trong n-Hexan ở 60oC đến khối lượng không đổi. * Bình đối chứng không cấy nấm sợi cũng được tiến hành như trên. Lượng dầu bị phân huỷ được tính theo công thức: ∆m= m- (m1-mo) Trong đó: - m là khối lượng dầu còn lại trong bình đối chứng. - m1 là khối lượng bình nhựa chứa dầu sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi. - mo là khối lượng bình nhựa. Tỉ lệ (%) dầu bị phân giải tính theo công thức: Tỉ lệ (%)= ∆m.100/m. 2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu  Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần MT đến khả năng phân giải dầu của các chủng tuyển chọn.[20] - Nguyên tắc: Thành phần MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phân giải dầu của nấm sợi. Đánh giá sự ảnh hưởng này thông qua việc nuôi cấy ở MT giàu chất dinh dưỡng (MT phân lập) và nghèo chất dinh dưỡng (MT khoáng). - Tiến hành: 2 ml bào tử nấm sợi (6,3.106 CFU/ml) + 47,5 ml môi trường Czapek- Dox hoặc MT muối khoáng và 2,5 ml dầu D.O trong bình tam giác dung tích 250ml. - Yêu cầu: So sánh khả năng phân giải dầu của nấm sợi ở hai điều kiện trên trong cùng thời gian và nhiệt độ, để chọn môi trường phân giải dầu tốt nhất cho việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tiếp theo. * Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng tuyển chọn trên môi trường tự nhiên. Để xác định xem các chủng tuyển chọn trong môi trường tự nhiên có khả năng phân giải dầu hay không? Chúng tôi dùng môi trường nước biển tự nhiên không bổ sung thêm muối khoáng: Cấy 2ml bào tử nấm sợi (6,3.106CFU/ml) vào bình tam giác 250ml chứa 47,5ml nước biển và 2,5ml dầu DO và nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày. Đánh giá bằng cách xác định lượng dầu bị phân giải.  Ảnh hưởng thời gian - Nguyên tắc: Các chủng nấm sợi có tốc độ sinh trưởng khác nhau. Để xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của nấm sợi RNM chủng tôi tiến hành thí nghiệm sau: - Cách tiến hành: Sử dụng môi trường (MT2) cấy chấm điểm các chủng nấm sợi tuyển chọn. Để ở nhiệt độ phòng. Đo đường kính khuẩn lạc, mỗi lần cách nhau 24giờ nhằm xác định tốc độ sinh trưởng của nấm sợi. Sử dụng môi trường (MT3) nuôi cấy và xác định lượng dầu phân giải bằng phương pháp 2.2.2.2 vào các ngày thứ 7,15, 23, 30. - Yêu cầu: Đánh giá tốc độ sinh trưởng và khả năng phân giải dầu bằng cách so sánh đường kính khuẩn lạc và lượng dầu phân giải của các chủng nấm sợi trong cùng thời điểm.  Ảnh hưởng nguồn nitơ - Nguyên tắc: Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phân giải dầu của nấm sợi, trong đó có N. Để xác định được ảnh hưởng của nguồn N đến khả năng phân giải dầu của các chủng nấm sợi chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau: - Cách tiến hành: Chúng tôi dùng môi trường khoáng làm môi trường cơ sở, trong đó nguồn nitơ được lần lượt được thay thế bằng KNO3; NaNO3; (NH4)2NO3; (NH4)2C2O4; NH4Cl; (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau. Tính theo lượng nitơ của các chất lần lượt là 0,01%, 0,04%, 0,07%, 0,1% và 0,13%. Hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường được tính theo công thức sau: C1% = 14.n.m/m1.M Trong đó: - n: Số nguyên tử nitơ có trong muối chứa nitơ. - m: Khối lượng muối chứa nitơ trong 1lít môi trường. - m1: Khối lượng phân tử của muối chứa nitơ - M: Khối lượng của dung dịch.  Ảnh hưởng của nguồn cacbon. - Nguyên tắc: Các chủng nấm sợi có khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau để sinh trưởng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau, để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của nấm sợi. - Cách tiến hành:Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT4) trong nước biển, sacaroza lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon sau: lactoza, galact-oza, CMC, maltoza. Trọng lượng các chất thay thế được lấy sao cho hàm lượng cacbon trong các nguồn đó đúng bằng hàm lượng cacbon đó trong MT nuôi cấy. Cấy chấm điểm nấm sợi nghiên cứu trên bề mặt các MT tương ứng. Sau đó để ở nhiệt độ phòng khoảng 3-4 ngày. - Yêu cầu: Đánh giá khả năng sử dụng các nguồn cacbon bằng mức độ phát triển của các khuẩn lạc qua độ lớn đường kính khuẩn lạc.  Ảnh hưởng độ mặn - Nguyên tắc: Áp suất thẩm thấu của môi trường có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của VSV. Phần lớn VSV có khả năng tăng trưởng trong môi trường nhược trương. Khi thêm một chất tan như muối, đường vào dung dịch, chúng làm gia tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch. Một số VSV có khả năng chịu được nồng độ muối lên đến 10%, được gọi là ưa muối tuỳ ý, một số khác cần nồng độ muối cao từ 15% đến 20% để tăng trưởng, được gọi là VSV ưa muối cực đoan. Để thử khả năng chịu mặn ta tiến hành phương pháp sau: - Cách tiến hành: + Đo khả năng sinh trưởng:  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp (môi trường MT2), có bổ sung các nồng độ muối NaCl nghiên cứu từ 0%; 3%; 5% và 10%.  Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các môi trường nghiên cứu, theo thứ tự nồng độ muối từ thấp đến cao.  Nuôi trong nhiệt độ phòng từ 4 ngày.  Dựa vào thời gian hình thành khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá khả năng chịu mặn của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Mẫu đối chứng nuôi cấy trên môi trường không có muối. + Đo khả năng phân giải dầu: Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 47,5ml môi trường khoáng với nồng độ muối khác nhau từ 0%- 10% và 2,5ml dầu D.O nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng 15 ngày. - Yêu cầu: Đánh giá mức độ phát triển và phân giải dầu của nấm sợi qua đường kính khuẩn lạc và lượng dầu phân giải. + Nấm sợi phát triển mạnh ở nồng độ muối từ 0%- 3%: Ưa mặn tuỳ tiện. + Nấm sợi phát triển mạnh ở nồng độ muối từ 5%- 10%: Ưa mặn  Ảnh hưởng của pH. - Nguyên tắc: Mỗi loài nấm sợi thích hợp với pH trong MT khác nhau. Vì vậy, khảo sát pH thích hợp cho sinh trưởng và phân giải dầu là rất cần thiết. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau: - Cách tiến hành: + Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT2) nước biển. Sau khi thanh trùng MT, điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1M hoặc HCl 1M để có giá trị pH khác nhau từ 4,0 đến 8,0 cách nhau mỗi khoảng là 0,5. Cấy chấm điểm các giống nấm sợi nghiên cứu. Sau đó, để ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. + Đo khả năng phân giải dầu: Chuẩn bị bình tam giác 250ml chứa 47,5ml môi trường khoáng với độ pH khác nhau từ 4.0- 8.0 và 2,5ml dầu D.O nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng 15 ngày. - Yêu cầu: Đánh giá mức độ sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc, cân sinh khối nấm sợi và xác định lượng dầu phân giải.  Ảnh hưởng của nhiệt độ - Nguyên tắc: Nhiệt độ là một trong những yếu tố MT ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ sinh trưởng của nấm sợi. Để xác định biên độ nhiệt - Cách tiến hành: Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT2) nước biển. Thanh trùng MT, rồi cấy chấm điểm các chủng nấm tuyển chọn vào các lô thí nghiệm. Mỗi chủng nấm sợi của từng lô cấy vào 3 đĩa. Sau đó, để mỗi lô ở nhiệt độ khác nhau từ 20oC đến 40oC mỗi khoảng cách là 5oC trong 4 ngày. - Yêu cầu:Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào độ lớn của khuẩn lạc ở mỗi lô và so sánh sinh trưởng các chủng nấm sợi khác nhau ở cùng nhiệt độ. 2.2.2.4 . Phương pháp kiểm tra hoạt tính sinh học  Khả năng sinh enzym ngoại bào của nấm sợi - Nguyên tắc: Nấm sợi có khả năng sinh enzym ngoại bào phân giải nguồn chất hữu cơ khác nhau trong MT để sinh trưởng. - Cách tiến hành: Để xác định khả năng sinh enzym của nấm sợi, chúng tôi tiến hành thí nghiệm cấy chấm điểm các chủng nấm sợi trên các MT thích hợp (MT4) với cơ chất tương ứng. Nuôi các chủng nấm này ở nhiệt độ phòng trong 4 ngày. Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng: + Kiểm tra hoạt tính proteaza: Đổ dung dịch thuốc thử HgCl2 10% lên bề mặt môi trường nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh proteaza sẽ có một vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc, do các phân tử protein bị phân giải nên không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử protein chưa bị phân giải có màu trắng đục. + Kiểm tra hoạt tính amilaza, kitinaza và xenlulaza: Đổ thuốc thử lugol loãng lên bề mặt của môi trường nuôi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi có hoạt tính amilaza, kitinaza hoặc xenlulaza sẽ tạo vòng phân giải trong suốt xung quanh khuẩn lạc nấm sợi.  Là enzym amilaza thì vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh đậm.  Là enzym kitinaza thì vùng kitin chưa bị phân giải có màu nâu đỏ nhạt.  Là enzym xenlulaza thì vùng xenlulose chưa bị phân giải có màu tím nhạt. - Yêu cầu: Đánh giá khả năng tạo enzym: + Đặt sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính khuẩn lạc (d). + Dựa vào kết quả (D - d)mm để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng nấm sợi. Nếu giá trị (D- d)mm càng lớn thì khă năng sinh enzym của chủng nấm sợi đó càng lớn. + Mức độ đánh giá: D- d  2,5cm hoạt tính enzym mạnh. D- d  2,0cm hoạt tính enzym khá mạnh. D- d  1,5cm hoạt tính trung bình. D- d < 1,0cm hoạt tính enzym yếu  Khả năng sinh kháng sinh - Nguyên tắc: Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt VSV kiểm định. Do vậy, chúng tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. - Cách tiến hành: Cấy nấm sợi trên hộp petri có MT nuôi cấy (MT2). Để ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày. Sau đó dùng khoan nút chai vô trùng để lấy các khối thạch có nấm sợi cần thử hoạt tính. Tiếp đến đặt khối thạch vào hộp petri chứa môi trường đã cấy VSV kiểm định cụ thể là E. coli và B. Subtilis. - Yêu cầu: + Đo đường kính vòng vô khuẩn (D) và đường kính khối thạch (d). + Mức độ đánh giá: D-d  2,5cm: hoạt tính rất mạnh. D-d  2cm: hoạt tính mạnh D-d  1,0 cm: hoạt tính trung bình D-d ≤1,0: hoạt tính yếu 2.2.3. Phương pháp toán học - Phương pháp tính giá trị trung bình: :X Giá trị trung bình n lần thí nghiệm. Xi: Giá trị lần thí nghiệm thứ i n: Số lần lặp lại thí nghiệm. - Phương pháp tính khoảng ước lượng: a= X t n XnS )(2 Trong đó: t tra bảng phân phối Student với n-1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng 2 phía. Sn+2(X) là phương sai mẫu. Sn+2 (X)= 1 1 n   n t XXi 1 )( 2 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ 3.1.1. Kết quả phân lập Để bước đầu tìm hiểu thành phầnvà đặc điểm quần xã nấm sợi, chúng tôi tiến hành phân lập nấm sợi từ các mẫu đất mặt, đất sâu, lá tươi, lá mục, thân, cành khô tại RNM huyện Cần Giờ. Sau 3 lần thu mẫu đã sử dụng môi trường MT1 cùng với 2 tác giả Khươu Phương Yến Anh và Phan Thanh Phương (2007) phân lập được 312 chủng. Những chủng nấm sợi phân lập từ đất có kí hiệu là Đ (đất bề mặt kí hiệu là Đ và lớp đất sâu 10cm kí hiệu là ĐB); những chủng phân lập từ mẫu lá kí hiệu là L và những chủng nấm phân lập được từ mẫu thân kí hiệu là T và C . Trong 312 chủng nấm sợi phân lập được gồm có: - Đất 114 chủng . Trong đó, 93 chủng từ lớp đất mặt và 21 chủng từ lớp đất sâu 10cm. Chứng tỏ, đa số nấm sợi là các VSV sống hiếu khí, nên lớp đất mặt thích hợp cho chúng hơn. Riêng ở môi trường có dầu làm chất cảm ứng. Sau 2 lần lấy mẫu phân lập được 21 (chiếm 18,42% số chủng nấm ở đất) chủng nấm kí hiệu Đ’. - Lá 96 chủng gồm: mẫu lá cây tươi 34 chủng, lá mục 62 chủng của cây dừa nước, Bần, Đước Đôi, Mắm, Ráng… - Thân 102 chủng gồm mẫu thân tươi 35, thân mục khô 67. Số lượng nấm trên lá, thân cây mục đang phân giải (chiếm 64,56% số nấm ở lá và 61,76% số nấm ở thân) nhiều hơn với lá, thân cây tươi. Có thể thấy, khả năng phân giải cơ chất này của các loài nấm trong RNM. Từ kết quả trên cho thấy, nấm sợi có mặt trong mọi cơ chất của RNM với số lượng không nhỏ. Số lượng nấm sợi có trong các mẫu phân tích dao động phụ thuộc vào tính chất của mẫu thu. Điều này cho thấy sự phong phú của khu hệ VSV trong RNM. Chúng tập trung nhiều nhất ở trong đất, đặc biệt là lớp đất mặt (93 chủng). Đặc điểm này của nấm sợi, chứng tỏ chúng có khả năng phân giải các chất hữu cơ từ xác động-thực vật RNM cung cấp dinh dưỡng cho hệ sinh thái này. Sự hiện diện của chúng góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường, đồng thời nâng cao hiệu suất sinh thái. Từ các chủng phân lập được, chúng tôi tiến hành sơ bộ tuyển chọn những chủng nấm sợi có khả năng phân giải dầu. 3.1.2. Kết quả tuyển chọn 3.1.2.1. Khảo sát khả năng phân giải dầu DO của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. Để tìm hiểu khả năng phân giải dầu DO của 312 chủng nấm sợi phân lập được, chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chủng trên MT khoáng có chứa dầu DO. Chúng tôi đánh giá khả năng phân giải cacbuahydro trong dầu DO của 312 chủng nấm sợi theo phương pháp 2.2.2.2 cho phát triển trên môi trường khoáng có chứa 4% dầu DO. Xác định mức độ sinh trưởng qua sinh khối nấm. Kết quả được trình bày theo bảng 3.1 Bảng 3.1: Khả năng sinh trưởng của các chủng nấm sợi trên MT dầu DO STT Kí hiệu chủng Sinh khối khô (mg/50ml) STT Kí hiệu chủng Sinh khối khô (mg/50ml) 1 C15.1 257.7  43 Đ9.2c 82.4 ± 0.007 2 Đ41 356.2 ± 0.005 44 Đ14.3 80.9 ± 0.005 3 L6.3 128.1 ± 0.007 45 Đ34.1 81.4 ± 0.005 4 Đ'9b 224.4 ± 0.005 46 Đ6 78.2 ± 0.006 5 Đ4a 207.0 ± 0.006 47 L19 76.6 ± 0.005 6 L3.2a 196.9 ± 0.007 48 L32.2 77.5 ± 0.005 7 Đ5a 153.6 ± 0.006 49 L4.7 74.8 ± 0.005 8 L35 134.4 ± 0.004 50 L1.8 72.6 ± 0.005 9 C'18.1 194.2 ± 0.007 51 L15.1 68.0 ± 0.004 10 L19 206.2 ± 0.005 52 Đ'9a 62.2 ± 0.003 11 C18 152.7 ± 0.008 53 Đ'9.2a 57.7 ± 0.004 STT Kí hiệu chủng Sinh khối khô (mg) STT Kí hiệu chủng Sinh khối khô (mg) 12 Đ1a 206.7± 0.005 54 Đ'8.1 55.5 ± 0.008 13 Đ7a 167.0 ± 0.006 55 Đ12 49.3 ± 0.004 14 Đ30 257.0 ± 0.004 56 L'1 49.1 ± 0.007 15 Đ2b 124.3 ± 0.006 57 TC2 47.8 ± 0.008 16 Đ18a 112.6 ± 0.004 58 T4.7 48.6 ± 0.007 17 L24 99.8± 0.007 59 C4.1 47.9 ± 0.008 18 Đ16b 102.4 ± 0.005 60 C8 46.6 ± 0.007 19 Đ'8 122.2 ± 0.006 61 T5 46.4 ± 0.008 20 Đ'9.1 98.6 ± 0.008 62 ĐB3 46.0 ± 0.007 21 Đ'30.1 126.7 ± 0.007 63 Đ6 69.5 ± 0.006 22 T1.1 124.8 ± 0.004 64 L3.2b 69.9 ± 0.007 23 Đ11.3 106.6 ± 0.005 65 L12 67.7 ± 0.006 24 C'18 114.7 ± 0.006 66 C15 67.3 ± 0.005 25 C18a 102.8 ± 0.005 67 L1.3 65.4 ± 0.006 26 L'21.1 100.6 ± 0.006 68 L15.5 65.1 ± 0.005 27 L15 90.2 ± 0.004 69 L1.1a 62.4 ± 0.007 28 L35 91.4 ± 0.008 70 Đ'9.2a 62.3 ± 0.008 29 Đ9.4 89.7 ± 0.007 71 T8a 60.4 ± 0.007 30 Đ'9 85.2 ± 0.005 72 L5.2 60.1 ± 0.007 31 Đ33.1 86.4 ± 0.007 73 Đ16 58.9 ± 0.006 32 Đ24 84.4 ± 0.006 74 Đ'30 58.2 ± 0.006 33 T7.1 82.5 ± 0.005 75 Đ'8.2 57.6 ± 0.007 34 L6.5 83.7 ± 0.006 76 Đ8 57.5 ±0.006 35 Đ7 85.2 ± 0.004 77 Đ4 55.4 ± 0.007 36 L16.1 82.3 ± 0.004 78 Đ17 55.5 ± 0.007 37 L14.2 49.3 ± 0.008 79 C11.1 39.7 ± 0.007 38 L5.3 45.6 ± 0.006 80 C13.1 39.2 ± 0.006 39 L6.2 43.2 ± 0.007 81 L16 38.5 ± 0.007 40 L12.1 42.1± 0.006 82 C11a 38.3 ± 0.008 41 Đ3.5 40.8 ± 0.007 83 C16.1 38.1 ± 0.007 42 Đ16.1 40.6 ± 0.008 Qua kết quả bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng: - Các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ có 83/312 chủng nấm có thể sống được trên môi trường có dầu với mức độ sinh trưởng khác nhau. Điều này chứng minh không chỉ ở khu hệ VSV giếng khoan dầu khí Thái Bình, Vũng Tàu do tác giả Lại Thuý Hiền- Đặng Cẩm Hà nghiên cứu (1991), Mai Thị Hằng (2003) có nấm sợi phân giải dầu, mà nấm sợi ở RNM cúng có khả năng này. - Lượng sinh khối sinh ra dao động từ 38.1-356.2mg/50ml. So với kết quả nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng về nấm sợi phân giải dầu ở RNM Nam Định, Thái Thuỵ-Thái Bình (2002). Các chủng nấm sợi được đánh giá có khả năng phân giải dầu DO mạnh có sinh khối nấm từ 126- 296mg/50ml. Để tổng quan hơn, chúng tôi lập bản thống kê (bảng 3.2) khả năng phân giải dầu của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. Bảng 3.2: Thống kê số lượng nấm sợi phân giải dầu DO STT Đặc điểm sinh trưởng Số chủng Tỉ lệ (%) 1 Không sinh trưởng 229 73.39 2 Có sinh trưởng , còn nhiều giọt dầu. 35 11.2 3 Sinh trưởng mạnh, còn ít dầu, còn mùi dầu 34 10.89 4 Sinh trưởng rất mạnh, hết mùi dầu, hết giọt dầu, rất trong 14 4.48 Ghi Chú: Quy ước: sinh trưởng yếu sinh khối khô < 50mg và còn nhiều giọt dầu; sinh trưởng trung bình:100mg50mg còn giọt dầu; sinh trưởng mạnh sinh khối khô >100mg, hết giọt dầu. Kết quả ở bảng 3.2 chúng tôi thấy: - Khả năng phân giải dầu của nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ có các mức độ khác nhau. - Có 83/312 chủng nấm sợi (chiếm gần 26,6% tổng số chủng nấm) có khả năng phân giải dầu DO in vitro.Trên môi trường khoáng có nguồn cacbon duy nhất là dầu DO, hầu hết các chủng nấm sợi phân lập phát triển ở mức trung bình và yếu. Chỉ có 14 chủng (4,48%) có thể phát triển rất mạnh, điều này chứng tỏ bình thường nấm sợi chủ yếu sử dụng nguồn cacbon hữu cơ, ít có chủng nấm có khả năng phát triển mạnh trên môi trường này. - So sánh với tài liệu công bố của tác giả Mai Thị Hằng, chúng tôi thấy số chủng nấm sợi có khả năng phân giải dầu ở Nam Định và Thái Bình (2003) là 83/199 (42%) nhiều hơn so với số chủng ở RNM Cần Giờ 83/312 (26,6%). Vì vậy, sự có mặt của chúng trong RNM là tác nhân tự vệ tự nhiên của hệ sinh thái này trước sự ô nhiễm dầu của những sự cố tràn dầu. - Trong 83 chủng nấm sợi tuyển chọn, có 37 chủng phân lập từ đất (chiếm 44,57%), 27 chủng phân lập từ lá (chiếm 32,53%), 19 chủng được phân lập từ thân (chiếm 22,89%). Đặc biệt, các chủng nấm sợi phân lập từ đất đã được cảm ứng dầu, có số lượng nấm phân giải dầu cao hơn hẳn các khu vực lấy mẫu khác (8/21 chủng). Điều này cho thấy, khi thêm chất cảm ứng vào môi trường đã kích thích VSV sinh enzym phân giải cơ chất này. Để có cái nhìn cụ thể hơn về khả năng phân giải dầu của 14 chủng nấm sợi phân giải dầu mạnh. Chúng tôi tiếp tục nuôi cấy các chủng nấm sợi này trên môi trường có dầu DO nhằm xác định hàm lượng dầu phân giải . 3.1.2.2. Xác định lượng dầu phân giải bởi các chủng nấm sợi tuyển chọn Để xác định rõ hơn hoạt tính enzym phân giải dầu DO của 14 chủng nấm sợi có khả năng phát triển tốt trên môi trường khoáng chứa dầu. Chúng tôi tiếp tục xác định hàm lượng dầu bị phân giải theo phương pháp 2.2.2.2. Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3: Lượng dầu DO bị phân giải của 14 chủng nấm sợi tuyển chọn STT Ký hiệu chủng Hàm lượng dầu bị phân giải (∆m)mg Tỷ lệ (%) dầu bị phân giải Khối lượng sinh khối (mg/50ml) sinh ra 1 C15.1 1283,1  0,007 67,09 257,2  0,006 2 Đ41 1281,7  0,005 67,02 355,6  0,005 3 L6.3 1154,7  0,007 65,60 127,7  0,007 4 Đ’9b 1222,6  0,002 63,93 223,8  0,005 5 Đ4a 1155,4  0,007 60,42 206,8  0,006 6 L3.2a 1152,6  0,006 60,27 196,4  0,007 7 Đ5a 1145,5  0,007 59,90 153,2  0,006 8 L35 1124,2  0,003 58,79 134,0  0,004 9 C’18.1 1124,2  0,006 58,78 193,8  0,007 10 L19 1081,2  0,008 56,54 205,9  0,005 11 C18 1,0772  0,004 56,33 152,5  0,008 12 Đ1a 1073,0  0,005 56,11 206,5  0,005 13