Luận văn Nghiên cứu phân tích một số hợp chất hữu cơ vòng bé bằng phương pháp hplc - Ms và nmr

rB - = + 1.3.4. Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, nhưng phổ NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì nó không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏ hỗn hợp hai đồng phân đối quang. Các đồng phân khác nhau được xác định nhờ độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin-spin của những nguyên tử hydro trong từ trường. Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân “dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau. Tỉ lệ của các đồng phân có mặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này. Nếu trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ nhỏ. a). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ không phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tín hiệu của chúng không được phân tách trong từ trường. Để phân biệt được hai cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất nghiên cứu thành đồng phân dia. Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyển hợp chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit Sau đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đưa ra được cấu hình của chất ban đầu. Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan- 10 1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để tạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây. Hai đồng phân dia này sẽ được phân biệt rõ trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton. Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trường cao, trong khi tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trường thấp. Như vậy, người ta có thể xác định được cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu. Hình 1.2. Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1-phenylbutan-1-ol Hình 1.3. Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1- phenylbutan-1-ol 11 Ngoài axit R-Mosher, hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng một số tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol, amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ như các tác nhân bổ trợ sau. b). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA) Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân hữu dụng nhất, cho phép xác định nhanh tỷ lệ của các đồng phân lập thể. Khi có mặt của chất này, các đối quang của lacton, amin và ancol trong từ trường tạo ra phổ không tương đương. Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl của chất CSA tạo ra các tương tác với các tâm bazơ. Ưu điểm của của phương pháp này là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất với tác nhân bổ trợ nên hạn chế được quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lượng nhỏ. Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân bổ trợ CSA, kết quả do tương tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang được tách biệt trong từ trường. Nghiên cứu của phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin khi không có tác nhân chuyển dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt được trong từ trường, nhưng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu của metyl, metin được tách ra. Dựa vào phổ này, người ta có thể xác định được tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin. 12 Hình 1.4. Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA c). Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3) Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm bất đối. Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH ) trong phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia”. Phức dia tạo thành có một số proton được tách ra trong từ trường và chuyển về trường thấp. Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trường thấp của một số proton phụ thuộc vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3. Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-1- axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt được trong từ trường. Tuy nhiên, khi được tạo phức với tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu. Nhóm metyl (triplet) được tách thành hai triplet có cường độ tương đương nhau. Sự tách tín hiệu của proton trong từ trường phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch. Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-1- axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều được tách ra và có độ 13 chuyển dịch hóa học chuyển về phía trường thấp. Sự tách tín hiệu và độ chuyển dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng. Đối với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 được chuyển dịch về phía trường cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan. Như vậy, có thể phân biệt và xác định được tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1- axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5). Hình 1.5. Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp 1.3.5. X-ray tinh thể a. Giới thiệu chung Phương pháp X-ray phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định cấu trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ. Từ phương trình Bragg, người ta tính toán độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lượng phân tử (n) xây dựng nên tế bào cơ sở. Phương trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos2β-cos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2 Số lượng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ trọng g/cm3) Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hướng (h,k,l) và hướng ngược lại (-h,-k,-l). Cường độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) được tính toán nhờ cường độ của tín hiệu nhiễu xạ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl) 1/2). 14 Hình 1.6. Cặp tín hiệu Fiedel Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ được tính toán bằng công thức: ρ(x,y,z) = [ Σhkl Fhkl exp{-2p(hx + ky + lz)}] / V Bằng cách đo cường độ của tất cả các tín hiệu nhiễu xạ Ihkl theo mặt h,k,l khi đã biết được các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phương trình Bragg ở trên, người ta sẽ tính toán được mật độ electron tại mọi điểm trong không gian của tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng được bản đồ mật độ điện tích của phân tử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chương trình máy tính sẽ dựng được cấu trúc không gian ba chiều của phân tử. Quá trình xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ bằng phương pháp X-ray phân tử có thể được tóm tắt như sau: Hình 1.7. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray b. Xác định cấu hình tuyệt đối Phương pháp X-ray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hình tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất thường. Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phương pháp X-ray tinh thể người ta sử dụng phương pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ số R. H,K,L -H,-K,-L 15 Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi được chiếu bức xạ tia X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thường Friedel, lợi dụng nguyên tắc này Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hướng (h,k,l) và hướng ngược lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối. Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R được xây dựng trên cơ sở hàm thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và được so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang. Nếu giá trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá trị này bằng phương pháp thống kê. Như vậy, cả hai phương pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có cường độ cao do ảnh hưởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử mà chưa so sánh được những tia tán xạ yếu. Những yếu tố tán xạ yếu chỉ được sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lượng lớn. Phương pháp X-ray tinh có thể sử dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi. Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, người ta có thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt đối. Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết được chọn để nghiên cứu trong phương pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận được dạng đơn tinh thể. Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng phân tích X-ray được thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết với chất nghiên cứu. Ngoài ra, việc đưa nhóm nguyên tử nặng như halogen (Cl, Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho phép xác định cấu hình tuyệt đối của chất đó nhờ phương pháp Bijvoet ở trên. Ví dụ hidroxy lacton chưa biết cấu hình tuyệt đối được chuyển thành este với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia. Trong trường hợp chất tạo thành thu được dưới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton được 16 xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết của phần tác nhân Mosher thông qua phân tích phổ X-ray. 1.3.6. Phổ CD Phương pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứng Cotton, cơ sở của phương pháp này là nghiên cứu bước chuyển ở trung tâm bất đối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn. Việc xác định phổ CD rất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ có những hợp chất có bước chuyển n---->π* và π---->π* (có nhóm mang màu) mới đo được hiệu ứng Cotton. Trong trường hợp chất cần nghiên cứu không có bước chuyển n---->π* và π---->π* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân tử. Xác định cấu hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ được thực hiện nhờ so sánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cấu trúc tương tự đã biết về cấu hình tuyệt đối. Như vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cấu trúc tương đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cần nghiên cứu. Ví dụ, khi muốn xác định cấu hình của flavan mới, người ta phải so sánh hiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biết trước cấu hình tuyệt đối. Hợp chất flavan B đã biết cấu hình tuyệt đối, hợp chất flavan A chưa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD là tương tự nhau nhưng có chiều ngược nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A là ngược so với B. Hình 1.8. Phổ CD của hợp chất A và B Ngoài ra, với các phân tử hữu cơ quang hoạt có chứa các phần mang màu đã biết việc phân tích phổ CD cho phép xác định được cấu hình tuyệt đối của cacbon bất đối trong phần mang màu này. 17 1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 1.4.1. Khái niệm Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt. Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường 1.4.2. Phân loại Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: · Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography). · Sắc ký phân bố (partition chromatography). · Sắc ký ion (ion chromatography). · Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography). Trong đó, sắc ký pha đảođược sử dụng nhiều hơn cả. 1.4.3. Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu: · Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). 18 · Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography) Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau: o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi. Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này. Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực. Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl. Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất. Hình 1.9. Cấu trúc của cột ODS 1.4.4. Pha động trong sắc ký pha đảo Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau: · Hòa tan mẫu phân tích. · Phù hợp với đầu dò. · Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh. · Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao. · Tinh khiết dùng cho sắc ký. 19 Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao. Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất. Trong đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải. Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid hoặc tính base của dung môi. Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký. Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn. 1.4.5. DETECTOR DAD Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tinh khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 – 0,050 mm. Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot. Hệ thống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện được tích – 5V. Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện. Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo. Kết quả là dòng điện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ. 20 a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng, c) đường quang phản xạ nhiều lần Hình 1.11. Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell). 1.4.6. DETECTOR MS Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trường hoặc từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion. Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó. Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, QKLӋWÿӝFDRFiFFKҩWNKҧRViWSKҧLӣWUҥQJWKiLNKtYұQWӕFGzQJFKҧ\QKӓ trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng. Điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ. Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung gian gọi là giao diện. Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùm tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB), đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API). Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa. Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp. Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích 21 nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử. Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích. Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS: * Phun mù điện tử (ESI). * Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI). * Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI). Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả. c. Các loại đầu dò khối phổ Có các loại tổng quát sau: * Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection) - Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp. - Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn cong nhờ từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao. * Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer) - Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter) - Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap) * Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight mass spectrometry) * Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS). Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourierđược sử dụng nhiều hơn cả 22 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị. 2.1.1. Các phương pháp tổng hợp hữu cơ. Sử dụng phản ứng đóng vòng Staudinger và một số phương pháp khác tại phòng thí nghiệm Hoá dược- Viện Hoá học- Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam. 2.1.2. Dụng cụ và hóa chất. Nguyên liệu đầu: phenol, m-clophenol, este 2-brom metylaxetat, benzylamin, p-brom benzandehit. Dung môi: axeton, metanol, etanol, n-hexan, diclometan, etyl axetat, nước. Dung dịch hiện màu: dragendoff, ceri sunfat/ axit sunfuric đặc. Các chất xúc tác và dung môi khác cho các phản ứng được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ). Bột silica gel cho sắc kí cột kích thước 0,01÷0,02 mm (Merck), bông y tế dùng nhồi cột. Bản mỏng sắc kí silica gel đế nhôm tráng sẵn Art. 5554 DC – Alufolien Kiesel 60 F254 , dày 0,2 mm, kích thước 20 x 20 cm (Merck). Cột sắc kí thuỷ tinh, giá ống nghiệm, ống capila, bình triển khai sắc kí bản mỏng. Bình cầu phản ứng 250 ml, con khuấy từ, máy khuấy từ, giá kẹp bình phản ứng. Phễu chiết 250 ml, cốc mỏ vịt, natri sunfat để làm khô. 23 2.1.3. Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng. Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm. Thông thường chất đầu và sản phẩm với giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng. Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động. Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để các chất tách ra xa khỏi nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất. Quy trình chạy sắc kí lớp mỏng: Cho chất lên bản sắc kí: Hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung môi dùng để điều chiết sao cho dung dịch thu được không quá loãng hay quá đặc. Dùng capila thủy tinh lấy chất rồi chấm lên trên bản mỏng sao cho các vệt chấm phải tròn, gọn và các mép bên của bản mỏng 0,5 cm; cách chân bản mỏng 0,7 cm. Các vết chất cách nhau 0,5 cm. Chiều cao bản mỏng 7 cm. Tiến hành sắc kí lớp mỏng: Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám và lắc kỹ. Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi. Lượng dung môi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất. Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng một góc 15°. Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai. Khi tiền tuyến dung môi cách mép trên 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra. Làm khô bản mỏng, sau đó hiện sắc phổ dưới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện. 2.1.4. Các phương pháp phân tích cấu trúc. Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành các phương pháp sau: 24 - Xác định nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkamp của Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ - Viện Hoá học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500 MHz với dung môi CDCl3 và TMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân - Viện Hoá Học - Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam. - MÁY HPLC + Hóa chất, thiết bị dùng cho máy HPLC Dung môi: Kênh A: H2O (PA); Kênh B: Metanol (PA) Pha tĩnh: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi octadecylsilayl silica gel (C18) Thiết bị:LC-MSD Agilent 1100 Series (USA) + Đặt điều kiện cho hệ thống Detector DAD: đặt ở bước sóng 260nm. Detector MS: - Source: ESI - Capilary: 3000V; 17nA - End Plate Offset: 500V; 435nA - Dry Gas: 5,0 l/min - Dry Temp: 325 ºC - Skimmer: 40.0V - Cap Exit: 200.0V - Polarity: Positive Flow: 0,25 ml/min Stop time: 30 min 25 Thể tích tiêm: 20 – 50 µl (tùy vào lượng mẫu) Min Gradient pha động Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3 %B %B %B 0 5 6 10 15 16 17 30 5 20 20 50 70 100 100 100 15 30 30 50 100 100 100 100 20 30 60 80 100 100 100 100 2.2. Tổng hợp các hợp chất β-lactam 2.2.1. Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic Hỗn hợp của phenol (5,1 mmol) 1a, DMF (3 ml) và Na2CO3 (5,1 mmol) được đun hồi lưu ở 140oC, trong thời gian 10 phút. Sau đó thêm este 2-brom metyl axetat (4,6 mmol) và tiếp tục đun hồi lưu ở 140oC, trong khoảng 4h. Hỗn hợp sau phản ứng được cho thêm dung dịch HCl 10% đến môi trường axit, sau đó thêm dung dịch NaHCO3 đến môi trường trung tính và được chiết ba lần bằng CH2Cl2. Dịch chiết CH2Cl2 được làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô 2a, sau đó thêm 8 ml NaOH 1N và 8 ml MeOH/H2O (1:1), tiếp tục đun hồi lưu ở 140 oC trong 24h. Hỗn hợp sau phản ứng được chiết bằng CH2Cl2, dịch chiết được làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô. Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải là n-hexan/EtOAc (9:1) thu được axit 3a hiệu suất 70%. Axit 3a là các chất rắn màu trắng có điểm chảy là 98-100oC. Dung dịch của hỗn hợp gồmaxit 3a (0,36 mmol), (COCl)2(1,8 mmol) và 0,1 ml DMF trong 5ml CH2Cl2 được khuấy ở nhiệt độ thường trong 24h. Kết thúc phản ứng, loại bỏ dung môi CH2Cl2ở áp suất thấp thu được sản phẩm 2- phenoxy clorua axetat 4a. 26 Dẫn xuất 2-(m-clo phenoxy) clorua axetat