Luận văn Xác định hàm lượng parabens trong thực phẩm và mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

ol Methanol UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến R Relative coefficient Hệ số tương quan Ppm Parts per million Phần triệu AOAC Association of Official Hội phân tích hoá Analytical Chemist học Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Chất bảo quản là những hóa chất tự nhiên hay tổng hợp được thêm vào thực phẩm, dược phẩm, các mẫu phẩm sinh học, v.v. để ngăn ngừa hoặc làm chậm lại sự thối rữa, hư hỏng gây ra bởi sự phát triển của các vi sinh vật, haycác thay đổi không mong muốn về mặt hóa học của sản phẩm. Parabens là tên gọi chung của nhóm chất bảo quản hóa học, được sử dụng phổ biến và lâu đời. Về mặt hóa học, parabens là một loạt các este của axit parahydroxybenzoic hay còn được gọi là acid 4-hydroxybenzoic. Parabens có tính chất kháng khuẩn và kháng nấm nên được dùng làm chất bảo quản để ngăn ngừa sự nhiễm khuẩn (do nấm hoặc vi khuẩn) và hạn chế sự phân hủy của các hoạt chất dẫn đến giảm hiệu quả của dược phẩm, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm Gần đâycó nhiều nghiên cứu cho thấy, các hợp chất parabens có thể hoạt động tương tự như hormone oestrogen trong các tế bào của cơ thể. Các hoạt động này có liên quan nhất định đến bệnh ung thư vú. Những thông tin này làm cho nhiều phụ nữ lo lắng, và người tiêu dùng được khuyến cáo hạn chế sử dụng các loại mỹ phẩm xung quanh cánh tay, ngực và những vùng da nhạy cảm. Parabens cũng có thể gây dị ứng da đối với những người có cơ địa dị ứng hay quá mẫn cảm. Ngoài ra còn có thông tin về việc parabens làm thúc đẩy quá trình lão hóa da dưới tác động của ánh nắng mặt trời. Trước những bằng chứng về tác hại của parabens đối với sức khỏecon người, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP quy định về việc sử dụng một số chất trong mỹ phẩm. Theo đó, có 5 parabens đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam từ ngày 30/7/2015là: isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben. Cũng theo công văn này, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,4% (tính theo acid), và dạng hỗn hợp các parabens khác với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid).Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày 31/12/2015.Các sản phẩm sản xuất trong nước, nhập khẩu được phép lưu hành trên thị trường đến hết ngày 30/6/2016. Với yêu cầu thực tế hiện nay,việc kiểm soát các chất bảo quản parabens là rất cần thiết. Trong phạm vi luận văn thạc sĩ “Xác định hàm lƣợng prabens trong thực phẩm và mỹ phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện HPLC thích hợp để định tính, định lượng 7 chất parabens, bao gồm: methylparaben, propylparaben, isopropylparaben, isobutylparaben, phenylparaben, benzylparaben, pentylparaben Mục tiêu nghiên cứu: Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 2  Xây dựng và chuẩn hóa phương pháp định lượng 7 chất paraben nêu trên bằngphương pháp sắc ký lỏng kết hợp với đầu dò khối phổ.  Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng parabens trên một số mẫu mỹ phẩm, thực phẩm chức năng. Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 3 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các hợp chất parabens Este alkyl acid p-hydroxybenzoic còn được gọi là parabens được sử dụng rộng rãi làm chất bảo quản trong các dược phẩm từ giữa những năm 1920 và được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm và mỹ phẩm một thời gian ngắn sau đó [11]. Một số parabens được tìm thấy trong tự nhiên, tuy nhiên tất cả các parabens được sử dụng thương mại đểu được sản xuất tổng hơp. Chúng được sản xuất bằng phản ứng este hóa của para-hydroxybenzoic acid và rượu thích hợp, ví dụmethanol, ethanol, n-propanol, v.v.khi có mặt chất xúc tác thích hợp (ví dụ axit sulfuric đậm đặc hoặc axit p-toluenesulfonic) [11]. 1.1.1. Công thức phân tử và tính chất vật lý của các parabens Ở điều kiện bình thường, 7 parabens nghiên cứu đều là những tinh thể màu trắng. Methylparaben (MeP), propylparaben (PrP), isopropylparaben(Iso-PrP) tan tốt trong nước, các parabens còn lại khó tan trong nước, tan tốt trong dung môi hữu cơ (methanol, ethanol). Nguyên nhân là do theo chiều khối lượng phân tử tăng lên, độ phân cực của các parabens giảm xuống [24].  Methylparaben  Danh pháp IUPAC: methyl 4-hydroxybenzoate  Tên gọi khác:nipagin, methylparahydroxybenzoate,methyl p- hydroxybenzoate.  Công thức phân tử: C8H8O3  Công thức cấu tạo Hình 1.1: Hình 1. 1. Công thức phân tử của methylparaben  Khối lượng mol phân tử: 152,15 g/mol  Ký hiệu trong ngành thực phẩm là: E218.  Độ tan trong nước ở 25oC: 2,00 g/100 mL; pKa: 8,17  Propylparaben  Danh pháp IUPAC: propyl 4-hydroxybenzoate Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 4  Tên gọi khác: nipazol, propyl parahydroxybenzoate, propyl p- hydroxybenzoate,.  Công thức phân tử: C10H12O3  Công thức cấu tạo Hình 1.2: Hình 1. 2.Công thức phân tử của propylparaben  Khối lượng mol phân tử: 180,2 g/mol  Ký hiệu trong ngành thực phẩm là: E216  Độ tan trong nước ở 25oC: 0,30 g/100 mL; pKa: 8,35  Isopropylparaben  Danh pháp IUPAC: propan-2-yl 4-hydroxybenzoate.  Tên gọi khác: isopropyl 4-hydroxybenzoate, isopropyl p- hydroxybenzoate.  Công thức phân tử: C10H12O3  Khối lượng mol phân tử: 180,2 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.3: Hình 1. 3. Công thức phân tử của isopropylparaben  Isobutylparaben  Danh pháp IUPAC: 2-methylpropyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C11H14O3 Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 5  Khối lượng mol phân tử: 194,23 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.4: Hình 1. 4. Công thức phân tử của isobutylparaben  Phenylparaben  Danh pháp IUPAC: phenyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C13H10O3  Khối lượng mol phân tử: 214,22 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.5: Hình 1. 5. Công thức phân tử của phenylparaben  Bezylparaben  Danh pháp IUPAC: benzyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C14H12O3  Khối lượng mol phân tử: 228,24 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.6: Hình 1. 6. Công thức phân tử của benzylparaben  Độ tan trong nước ở 25oC: 0,05 g/100 mL  Pentylparaben Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 6  Danh pháp IUPAC: pentyl 4-hydroxybenzoate  Công thức phân tử: C12H16O3  Khối lượng mol phân tử: 208,25 g/mol  Công thức cấu tạo Hình 1.7: Hình 1. 7. Công thức phân tử của pentylparaben 1.1.2. Tác dụng kháng khuẩn của parabens Các parabens có tác dụng sát khuẩn (tiêu diệt nhiều loại vi khuẩn khác nhau) và diệt nhiều loại vi nấm. Parabens có hoạt tính kháng khuẩn là do chúng làm thay đổi đặc tính của màng tế bào, khiến cho cấu trúc lớp màng tế bào thay đổi cho phép các chất tan trong tế bào bị rò rỉ ra ngoài[24]. Tác giả Steinberg Doron và cộng sự[24] đã nghiên cứu đặc tính kháng khuẩn của bốn parabens là: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben đối với các vi khuẩn Streptococcus sobrinus gây bệnh sâu răng. Kết quả thu được cho thấy, theo chiều tăng của chuỗi akyl khả năng kháng khuẩn của parabens tăng dần. Tuy nhiên, theo chiều tăng của chuỗi ankyl khả năng tan trong nước giảm dần, trong khi vi khuẩn thường phát triển trong môi trường nước. Do vậy các đồng phân có chuỗi alkyl ngắn thường được lựa chọn sử dụng với mục đích bảo quản. Để tăng hiệu quả bảo quản, các parabens được sử dụng kết hợp với nhau. Thông thường, người ta phối hợp hai paraben trở lên, thí dụ như phối hợp 0,18% methyl parabens, 0,02% propyl parabens để làm chất bảo quản sát khuẩn trong nhiều loại thuốc tiêm chích hoặc phối hợp parabens với một số hóa chất khác. Trước đây, parabens đã được sử dụng rộng rãi trong thuốc chữa bệnh, thường là ở hàm lượng cao, khoảng 1% đến 5% [5]. Khi những tác hại của parabens đối với sức khỏe con người được phát hiện, việc sử dụng parabens trong các sản phẩm thuốc chữa bệnh đã giảm xuống. So với trong dược phẩm, hàm lượng parabens sử dụng trong các sản phẩm mỹ phẩm thường ở nồng độ thấp hơn (khoảng 0,1% đến l0,8%), và hiện nay, chúng vẫn là loại chất bảo quản được sử dụng nhiều nhất vì nhiều lí do: giá thành rẻ, hiệu quả bảo quản tốt, không màu, không mùi, không làm thay đổi tính chất của sản phẩm. 1.1.3. Tác động của parabens đối với sức khỏe 1.1.3.1. Gây dị ứng da Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 7 Tác giả Christen M. Mowad [9] đã trình bày trong bài báo của mình về hai trường hợp viêm da dị ứng do tiếp xúc gây ra bởi parabens, thông qua việc sử dụng các sản phẩm hàng ngày là sữa tắm, dầu gội đầu, nước rửa tay, v.v..Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, benzylparaben là chất có khả năng gây dị ứng mạnh nhất, có thể là do khối lượng phân tử lớn hơn. Trong một báo cáo khác, tác giảJames E. Nagel và cộng sự[13] đã trình bày về hai trường hợp dị ứng với parabens bằng con đường tiêm dưới da. Cơ chế gây dị ứng của parabens hiện vẫn chưa rõ ràng, nhưng nhiều trường hợp dị ứng với chất bảo quản này đã được ghi nhận. Một cuộc điều tra năm 1973, tiếnhành trên 1200 cá nhân được thực hiện bởi The North American Contact Dermatitis Group đã cho thấy tỷ lệ dị ứng với parabens là 3% [13]. 1.1.3.2. Hiện tượng lão hóa da Theo kết quả nghiên cứu của rác giả Osamu Handa và cộng sự[19], methylparaben tăng cường khả năng gây hại của tia UVB đối với các tế bào sừng trên da. Tia UVB với cường độ 15 mJ/cm2 và 30 mJ/cm2 (tương ứng với cường độ UVB trung bình khi tiếp xúc với ánh sáng mặt trời trong vòng 1 phút vào ngày đẹp trời ở châu Âu) hầu như không gây hại đến tế bào sừng. Tuy nhiên khi kết hợp sử dụng methylparaben 0,003% và việc chiếu xạ bằng tia UVB với cường độ như trên thì lượng tế bào sừng bị hoại tử tăng lên đáng kể. Theo kết quả một nghiên cứu khác của tác giả Yoshinori Okamoto và cộng sự [28], methylparaben và các sản phẩm chuyển hóa của methylparaben, kết hợp với ánh sáng mặt trời có thể gây tổn hại đối với ADN trên da. Cơ chế tác động được mô tả như Hình1.8: Hình 1. 8. Cơ chế gây hại ADN trên da của hợp chất parabens 1.1.3.3. Mối liên hệ với giữa parabens và bệnh ung thư vú Hơn 50 năm nay, các hợp chất parabens đã được biết đến là có hoạt tính oestrogen. Oestrogen được biết là có ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc bệnh ung thư vú và việc ngưng hoạt động của oestrogen vẫn là phương pháp ưu tiên điều trị cho các khối u vú nhạy cảm với hormone. Nhóm tác giả Byford J.E và cộng sự[6] tiến hành nghiên cứu hoạt tính oestrogen của các hợp chất parabens (methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, n-butylparaben) trong các tế bào ung thư vú nuôi cấy MCF7. Parabens có thể di Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 8 chuyển [3H] oestradiol từ các thụ thể của tế bào tương MCF7. Paraben cũng có thể tăng biểu hiện của các gen quy định oestrogen và tăng khả năng sản sinh các tế bào này. Liên kết của các parabens với tế bào MCF7 tăng lên theo chiều dài chuỗi alkyl, tuy nhiên liên kết này khá yếu. Kết quả này cũng phù hợp với các báo cáo nghiên cứu về tính liên kết áp dụng với hệ tử cung của chuột. Theo tác giảRoutledge E.J và cộng sự [20], tất cả các parabens bao gồm: methylparaben, ethylparaben, n-propylparaben, butylparaben đều có hoạt tính tương tự oestrogen. Trong đó methyl paraben là chất có hoạt tính oestrogen yếu nhất với cường độ thấp hơn khoảng 2500000 lần so với 17-estradiol (một loại oestrogen có trong tự nhiên). Hoạt tính oestrogen mạnh lên theo chiều tăng của chuỗi alkyl, cụ thể ethylparaben, propylparaben và butylparaben lần lượt có cường độ thấp hơn khoảng 150000 lần, 30000 lần, và 10000 so với 17-estradiol. Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng, cường độ hoạt tính oestrogen của parabens trên cá thể chuột thấp hơn 2 đến 3 lần so với cường độ trong thử nghiệm ống nghiệm. Nguyên nhân được giải thích do parabens nhanh chóng được đào thải ra ngoài thông qua hệ bài tiết của cơ thể. Một nghiên cứu khác của tác giả Thuy T.B. Vo và cộng sự[25] tiến hành đối với cá thể chuột cái giai đoạn từ 21-40 ngày tuổi cũng cho kết quả tương tự. Hoạt động estrgen mạnh lên theo thứ tự sau: ethylparaben<propylparaben<isopropylparaben<butylparaben<isobutylparaben. 1.2. Tình hình sử dụng parabens trên thế giới và ở Việt Nam Năm 1920, parabens lần đầu tiên được sử dụng làm chất bảo quản trong dược phẩm, và được sử dụng rộng rãi một thời gian ngắn sau đó. Hiện nay chúng là chất bảo quản được sử dụng phổ biến nhất không chỉ trong dược phẩm, mà còn trong các sản phẩm mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Tác giả Dorota B. và cộng sự [11], trong báo cáo về ảnh hưởng của parabens đối với môi trường và sức khỏe con người đã tổng hợp kết quả các nghiên cứu về thực trạng sử dụng parabens hiện nay. Theo đó, nghiên cứu của tác giảPouillot (năm 2006) cho biết parabens có mặttrong khoảng 80% sản phẩm chăm sóc cá nhân.Tác giả Rastogi(năm 1995) cho biết parabens được tìm thấy trong 77% sản phẩm mỹ phẩm rửa trôi và 99% mỹ phẩm lưu lại trên da.Một nghiên cứu khác của tác giả Masten (năm 2005) cho kết quả butylparaben có mặt trong 13% sản phẩm khảo sát, methylparaben và propylparaben có mặt trong 48% sản phẩm. Trong nghiên cứu của tác giảEriksson E. và cộng sự[12], khảo sát trong tổng số 751 sản phẩm thu thập ở Đan Mạch cho thấy có 36% sản phẩm có chứa parabens. Khảo sát ở Na Uy cho thấy có 32% trong tổng số 117 sản phẩm chăm sóc da dành cho trẻ em có mặt parabens. Tại Việt Nam, parabens được sử dụng rất phổ biến trong các sản phẩm chăm sóc cá nhân. Một khảo sát của Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế[1], trong 30 mẫu mỹ phẩm (gồm 09 mẫu sữa rửa mặt, 21 mẫu kem dưỡng da, tấy trắng da, tái tạo da, trị nám, trị mụn, v.v.) đang có mặt trên Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 9 thị trường Thừa Thiên Huế có 24 mẫu chứa 2 chất methylparaben và propylparaben, 3 mẫu chỉ chứa methylparaben và 3 mẫu chỉ chứa propylparaben. Trước những bằng chứng về tác hại của parabens đối với sức khỏe con người, Cục Quản lý Dược đã ban hành công văn số 6577/QLD-MP quy định về việc sử dụng một số chất trong mỹ phẩm. Theo đó, có 5 parabens đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam từ ngày 30/7/2015là: isopropylparaben, isobutyl araben, phenylparaben, benzylparaben và pentylparaben. Cũng theo công văn này, propylparaben và các muối được phép dùng riêng lẻ với nồng độ tối đa 0,4% (tính theo acid), và dạng hỗn hợp các parabens khác với tổng nồng độ tối đa là 0,8% (tính theo acid).Thời hạn công bố đối với các sản phẩm mới sản xuất trong nước, nhập khẩu đến hết ngày 31/12/2015.Các sản phẩm sản xuất trong nước, nhập khẩu được phép lưu hành trên thị trường đến hết ngày 30/6/2016. 1.3. Các phương pháp phân tích parabens Trong tình hình sử dụng parabens và các tác hại của parabens đối với sức khỏe, việc kiểm soát hàm lượng parabens là vô cùng cần thiết. Để phân tích các parabens có các phương pháp phổ biến như: phương pháp điện di mao quản (CE), phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp sắc ký khí, v.v.. 1.3.1. Phương pháp điện di mao quản (CE) Đây là phương pháp tách các chất phân tích là các ion hoặc các chất không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp chứa đầy dung dịch đệm, đặt trong điện trường. Do độ linh động của các ion khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau. Phương pháp điện di mao quản được tác giả Usama A.và cộng sự[26] sử dụng để phân tích bốn parabens là methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben có trong sữa mẹ và trong các mẫu thực phẩm. Mẫu sau khi được chiết tách bằng phương pháp chiết vi lượng lỏng-lỏng phân tán (DLLME) được bơm vào máy điện di mao quản với detector UV-VIS tại bước sóng 298 nm. Nhóm tác giả sử dụng cột mao quản silica nóng chảy với đường kính trong 75µm, tổng chiều dài 48,5 cm, chiều dài hiệu dụng tới detector là 40 cm. Bơm mẫu tại anot,và phát hiện chất phân tíchtại catot ở cuối mao quản. Nhiệt độ mao quản được duy trì ở 120C, điện thế 25kV và dung dịch điện di nền là đệm borat 25 mM tại pH 9,2 chứa 5,0% acetonitril (ACN), v.v.. Các chất phân tích được bơm trong 5s ở áp suất 50 mbar. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp dao động từ 0,9 μg/mL (đối với ethylparaben) và cao nhất là 2,1 μg/mL (đối với methylparaben). Phương pháp điện di mao quản cũng được ứng dụng để phân tích 4 parabens là methylparaben, ethylparaben, propylparaben, và butylparaben trong nền mỹ phẩm [15], [22].Tác giả Shu Ping Wang và cộng sự [22] nghiên cứu phương pháp chiết mẫu bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE), và phân tích 4 parabens bằng phương pháp điện di (CE), còn Labat L.và cộng sự[15] tiến hànhnghiên cứu so sánh hai Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 10 phương pháp điện di mao quản (CE) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đối với quá trình phân tích parabens. Cả hainhóm tác giả đều sử dụng cột silica có kích thước hạt nhồi 75 µm. Chiều dài cột lần lượt là 60 cm và 70 cm; điện thế tương ứng là 25 kV và 20 kV; nhiệt độ mao quản tương ứng là 300C và 400C. ShuPing Wangsử dụng dung dich đệm natri tetraborate 30 mM trong 5% ACN. Labat L.dùng dung dịch đệm là hỗn hợp natri tetraborate 15 mM (pH 9,2) và methanol (MeOH) [15], [22]. Theo kết quả nghiên cứu củaLabat L.[15], khoảng tuyến tính của parabens khi phân tíchbằng phương pháp HPLC là từ 1-40 mg/mL, còn với phương pháp CE là 5-200 mg/mL. Giới hạn phát hiện trong phân tích CE (0,21 mg/mL) cao hơn trong HPLC (0,05 mg/mL). Nghiên cứu của Labat L. cho thấy cả 2 phương pháp HPLC và CE đều phù hợp để phân tích các parabens trong nền mỹ phẩm. Phương pháp điện di mao quản có ưu điểm tiết kiệm, lượng hóa chất sử dụng rất ít, có thể phân tích được nhiều nhóm chất khác nhau. Tuy nhiên, độ nhạy kém đồng thời tính ổn định không cao, thiết bị không phổ biến cho các phòng thí nghiệm 1.3.2. Phương pháp sắc ký lỏng 1.3.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detector UV-VIS Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong các lĩnh vực khác nhau, đặc biệt là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất phân tích sau quá trình rửa giải. Để phát hiện parabens, hai tác giả Kreuz D.M và Saad B. đều sử dụng detector UV- VIS[14],[21]. Tác giả Kreuz D.M và cộng sự[14]ứng dụng phương pháp HPLC để phân tích kali sorbat, methylparaben và propylparaben trong dung dịch huyền phù.Nhóm tác giảsử dụng cột Eclipse XDB-C8 (3,0 ×150 mm, 5 µm). Pha động gồm kênh A có thành phần 20% ACN, 80% dung dich muối citrate 0,02M, đệm pH 5,0 và kênh B là ACN. Chương trình gradient tuyến tính được thiết lập như sau: 0 phút, 100% kênh A; 35phút,70% kênh A và 30% kênh B; 36phút, 100% kênh A; 46phút, 100% kênh A. Tốc độ dòng là 0,5 mL/phút. Detector sử dụng UV tại bước sóng 260 nm. Thể tích bơm là 50 µL. Thời gian chạy là 35 phút để phân tích và 11 phút để tái cân bằng.Trong nghiên cứu này, methylparaben có giới hạn định tính (LOD) là 0,8 ng/mL, giới hạn định lượng (LOQ) là 3,0 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,3348-0,9917µg/mL. Propylparaben có giới hạn định tính là 1,0 ng/mL, giới hạn định lượnglà 4 ng/mL, khoảng tuyến tính từ 0,0339-0,1016 µg/mL. Tác giả Saad B.và các cộng sự[21] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tích một số chất bảo quản là acid benzoic, acid sorbic, methylparaben và propylparaben trong thực phẩm. Quá trình phân tích được tiến hành trên cột C18 (15 cm ×4,6 mm, 5 µm) ở điều kiện nhiệt độ phòng. Detector UV- Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 11 VIS được cài đặt ở 254 nm và thể tích bơmmẫu là 20 µL. Pha động tan trong nướclà dung dịch ammonium acetate 0,05M,pH 4,4. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sử dụng pha động methanol:dung dịch amoni acetate với tỉ lệ 35:65 cho kết quả tách tốt, tuy nhiên thời gian rửa giải propylparaben quá lâu (21 phút). Để khắc phục điều này, sau khi các chất acid benzoic, acid sorbic, methylparaben đã đi ra khỏi cột (9 phút), thành phần pha động được thay đổi là methanol-dung dịch amoni acetate với tỉ lệ 50:50. Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện (LOD) của methylparaben là 0,3 mg/L, của propylparaben là 0,1 mg/L. Khoảng tuyến tính của methylparaben từ 3,0-100 mg/L, của propylparaben từ 1,0-75 mg/L. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS có một nhược điểm là có thể có sự chồng chéo các pic khi phân tích parabens trong nền mẫu phức tạp. Những hạn chế này có thể được khắc phục khi kết hợp sắc ký lỏng với đầu dò khối phổ. 1.3.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) Đây là một phương pháp nhanh, nhạy và được phát triển nhiều hiện nay. Sau khi qua cột tách, chất phân tích được hóa hơi, các hợp chất hữu cơ trung hoà bị ion hoá thành các ion phân tử hay ion mảnh của phân tử mang điện dương hoặc âm, các gốc tự do. Sau đó, các ion đựơc đưa sang bộ phận tách theo khối lượng. Từ các tín hiệu thu được, dựa vào khối lượng ion phân tử, dựa vào đồng vị, dựa vào các mảnh ion phân tử, dựa vào cơ chế tách và dựa vào ngân hàng dữ liệu các ion và mảnh ion, người ta định tính và định lượng được chất phân tích một cách chính xác. Tác giả Chao Han và các cộng sự[8] tiến hành định lượng 4 parabens là methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben (đồng thời với 3 benzophenone) trong mẫu hải sản bằng sắc ký lỏng khối phổ. Nhóm tác giảsử dụng cột Waters XBridge TM C18 (150 mm × 2,1 mm, 5 µm), nhiệt độ 30 o C. Thể tích bơm mẫu là 10 µm. Pha động sử dụng là ACN (kênh A) và dung dịch acetate 0,1% (kênh B). Rửa giải bằng chế độ gradient với tốc độ dòng đặt cố định ở 30mL/phút. Thành phần pha động thay đổi theo tỷ lệ A:B như sau: 0 phút, 30:70; từ 2 đến 10 phút, 80:20; từ 10,1 đến 20 phút, 30:70. Các parabens được ion hóa bằng kỷ thuật ion hóa phun điện tử (ESI), sau đó được định lượng bằng kỹ thuật quét ion (MRM). Methylparaben, ethylparaben, propylparaben và butylparaben được định lượng với các mảnh ion có m/z lần lượt là 151, 165, 179, 193. Mô hình phân mảnh của các parabens được mô tả trong Hình 1.9. Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp đối với các parabens là 10,0 µg/kg. Luận văn Thạc sĩ Chuyên ngành: Hóa Phân tích Lê Thị Xuân Đại học KHTN Hà Nội 12 Hình 1. 9. Mô hình phân mảnh của các parabens trong phân tích LC-MS/MS Tác giảYe X. và các cộng sự[27] sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò khối phổ để phân tích các parabens (bao gồm: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, benzylparaben), triclosan và một vài phenol trong sữa mẹ. Nhóm tác giả sử dụng cột SPE là RP-18 ADS (25mm×4mm, đường kính 25 µm, kích thước lỗ trống là 60Å). Cột HPLC là cột XDB C8 (150 mm × 4,6mm, 5 µm). Quy trình tách parabens, triclosan và các phenol khác từ sữa được thực hiện qua ba giai đoạn. Giai đoạn đầu tiên (từ 0-3 phút), với các van 10 cổng tại vị trí 1-2, bơm 500 µL dung dịch mẫu vào cột SPE bằng bơm SPE với 20% MeOH:80% H2O và tốc độ dòng 1mL/phút. Giai đoạn thứ hai (từ 3-5phút), van 10 cổng được chuyển sang vị trí thay thế (từ 1-10), và các chất phân tích còn lại trong cột SPE được tách rửa lại bằng bơm HPLC, với 50% MeOH:50% H2O, tốc độ dòng 0,5 mL/phút. Sau khi chất phân tích ra khỏi cột, dung dịch tẩy rửa được bơm vào cột với tốc độ dòng 0,25 mL/phút bằng bơm SPE. Trong giai đoạn thứ ba (từ 5-15 phút), van 10 cổng chuyển trở lại vị trí ban đầu, và các chất phân tích được chuyển đến cột HPLC bằng bơm HPLC với tốc độ dòng là 0,75 mL/phút. Sử dụng chương trình gradient như sau: từ 5 đến 13phút, pha động từ 70% MeOH đến 90% MeOH; từ 13 đến 14 phút, pha động là 100% MeOH; từ 14 đến 15phút, pha động là 50% MeOH. Rửa giải cột SPE với100% MeOH từ 5 đến 10 phút và cân bằng cột với 20% MeOH: 80% H2O từ 10 đến 15 phút và tốc độ dòng là 1mL/phút. Giới hạn định lượng của phương pháp đối với 5 parabens phân tích là 0,1 ng/mL. Tác giả Cristina Moreta và cộng sự [10] sử dụng cột C18 (100 mm× 2,1 mm, 3 μm)và một tiền cột(dài 20 mm). Hệ thống HPLC được ghép nối với một máy khối phổ ba tứ cực để phân tích các parabens (bao gồm: methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, benzylparaben) trong dược phẩm. Cột được giữ ở nhiệt độ phòng, tốc độ pha động 0,3 mL/phút và thể tích bơm mẫu là 10 μL. Sử dụng pha động là MeOH (kênh A) và HCOOH 0,02% (kênh B). Chương trình gradient của cột được thiết lập như sau: 3 phút đầu tiên sử dụng pha động có 5% kênh A và sau đó tăng tuyến tính từ 5% đến 85% kênh A trong 2 phút, duy trì 85% kê