Luận văn Xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

trong nghiên cứu này có khả năng chịu axit và muối mật tốt so với với các chủng vi khuẩn lactic trong một số nghiên cứu trƣớc. Nghiên của Nguyễn Văn Thanh và cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng trong môi trƣờng pH 3 – 4, tỷ lệ sống của các chủng L. acidophilus và L. casei là 41- 65% [70]. Trong điều kiện pH 2, tỷ lệ sống sót của 2 chủng vi khuẩn lactic L. casei VTCC186 và D3– L. pentosus trong sản phẩm kefir chanh dây là 39,36- 52,01%. Các chủng này cũng có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có sự hiện diện của muối mật với nồng độ 0,3% [37]. Năm 2012, Hassanzadazar và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chịu axit của một số 46 chủng vi khuẩn lactobacilli phân lập từ phô mai Koozeh trong điều kiện pH 2 và 3. Họ đã quan sát thấy rằng khả năng sống của các chủng lactobacilli giảm đáng kể sau khi đƣợc ủ ở pH 3 và ở pH 2 không có tế bào vi khuẩn nào sống sót sau 1 giờ ủ [71]. Nhóm nghiên cứu của Deshpande cũng đã báo cáo kết quả thử nghiệm khả năng chống chịu dịch dạ dày của L. casei tại pH 2, 3, và 4. Kết quả của họ cho thấy rằng các chủng L. casei này có khả năng sống sót ở các mức pH thử nghiệm qua 90 phút [72]. Trong một số báo cáo trƣớc đây, ngƣời ta cho rằng Lactobacillus sp. không thể sinh trƣởng khi nồng độ muối mật trong môi trƣờng cao hơn 0,3% [73]. Nhƣng ở nghiên cứu của chúng tôi, khi ủ dƣới điều kiện kỵ khí, các chủng thử nghiệm đều cho thấy khả năng tồn tại với sự có mặt của muối mật ở nồng độ 0,7%. McAuliffe và cộng sự đã báo cáo rằng L. acidophilus NCFM không thể sinh trƣởng ở cả môi trƣờng MRS lỏng và trên đĩa thạch khi bổ sung vào môi trƣờng này muối mật ở nồng độ 0,3% và 0,5% [74]. Tƣơng tự với kết quả nghiên cứu trên, Gu và cộng sự cũng quan sát thấy rằng chủng L. plantarum CGMCC 8198 và L. casei 1.539 có khả năng sống sót thấp, lần lƣợt là 48% và 8% khi trải qua 4 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng MRS lỏng đƣợc bổ sung 0,3% muối mật [21]. Một nghiên cứu khác của Shehata et al. (2016) cho thấy trong môi trƣờng MRS có bổ sung 0,3% muối mật, tỷ lệ sống sót của các chủng vi khuẩn lactic dao động trong khoảng 69,8- 85%, các chủng này cũng có tỷ lệ sống sót từ 68- 88,3% sau 3 giờ ủ trong môi trƣờng dịch dạ dày nhân tạo ở pH 2,0 [75]. Nhƣ vậy có thể thấy, so với những chủng đã đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, 3 chủng Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 có khả năng chịu pH axit và muối mật vƣợt trội hơn hẳn. 47 3.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS 3.4.1. Khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus trong môi trƣờng nuôi cấy Sự tồn tại của vi sinh vật khi đi qua đƣờng tiêu hóa có tầm quan trọng rất lớn trong việc duy trì lợi ích cho sức khỏe của probiotic [76]. Nhiều yếu tố có thể ảnh hƣởng đến sự sống sót của vi khuẩn trong đƣờng tiêu hóa, bao gồm pH của môi trƣờng, thời gian tiếp xúc với pH, sự hiện diện và nồng độ nhất định của muối mật, vv. Trong môi trƣờng ruột non, sự hiện diện của muối mật là yếu tố không mong muốn nhất cho sự tồn tại của các sinh vật probiotic [77]. Do đó, vi khuẩn Lactobacillus có enzyme thuỷ phân muối mật đã đƣợc tìm thấy có khả năng sống sót cao hơn trong đƣờng tiêu hóa. Hơn nữa, hoạt động của BSH là một trong khả năng gián tiếp làm thế nào để giảm lƣợng cholesterol trong cơ thể con ngƣời [40]. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy trong số 9 chủng kiểm tra bao gồm Lac.VFE 04, Lac. VFE 08, Lac. VFE 09, Lac. VFE 11, Lac. VFE 14, Lac. VFE 17, Lac. VFE 48, Lac. VFE 72 và Lac. VFE 76, có 3 chủng cho thấy có khả năng phân giải muối mật SGDC. Khi quan sát trên đĩa thạch 3 chủng bao gồm Lac.VFE 04; Lac.VFE 08 và Lac.VFE 14 có xuất hiện vòng tủa trắng xung quanh khuẩn lạc ở đĩa thạch MRS có bổ sung muối mật SGDC. Trong khi đó ở đĩa thạch MRS không bổ sung muối mật và đĩa thạch có bổ sung muối mật SGC không thấy xuất hiện vòng tủa trắng xung quanh khuẩn lạc của cả 9 chủng nghiên cứu (Hình 3.7). 48 Hình 3.7. Khả năng phân giải muối mật của 9 chủng Lactobacillus Các đĩa đƣợc ủ trong môi trƣờng kỵ khí trong 48 giờ tại 37 ºC. (a) MRS; (b) MRS bổ sung 5 mM SGC (c) MRS bổ sung 5 mM SGDC; (1) Lac.VFE-04; (2) Lac.VFE-08; (3) Lac.VFE-09; (4) Lac.VFE-11; (5) Lac.VFE-14. Năm 2015, R.González Vázquez và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm về khả năng tồn tại và thủy phân muối mật của các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. dƣới các điều kiện áp lực trong đƣờng tiêu hóa. Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn L. casei J57 có khả năng sống sót trong đƣờng tiêu hóa và có hoạt tính thủy phân các sản phẩm muối mật chính và thứ cấp. Khả năng phân giải các loại muối mật glycocholate, taurocholate, glycodeoxycholate và taurodeoxycholate của chủng vi khuẩn này lần lƣợt là 44,91; 671,72; 45,27 và 61,57 U/mg. Tuy nhiên chủng đối chứng là L. casei Shirota lại không có khả năng phân giải muối mật liên hợp với glycine mà chỉ có khả năng phân giải các muối mật tauroconjugates [78]. Trong một nghiên cứu sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính làm giảm cholesterol, Dƣơng Nhật Linh và cộng sự đã tiến hành kiểm tra hoạt tính enzyme BSH của các chủng vi khuẩn trong môi trƣờng MRS bổ sung 0,5% muối natri taurocholate. Kết quả cho thấy có 32 chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme BSH tạo vòng kết tủa xung quanh khuẩn lạc. 32 chủng cho hoạt tính chung dao động trong khoảng từ 49 0,032-0,092 U/mg và hoạt tính riêng dao động trong khoảng 0,748-5,061 U/mg. Trong đó có chủng vi khuẩn lactic VN2.2 có hoạt tính riêng cao nhất đạt 5,061 U/mg [55]. Nghiên cứu của Ridlon et al. (2006), đã chứng minh đƣợc Lactobacillus spp. có thể thực hiện các hoạt động BSH khác nhau khi có các loại muối mật khác nhau. Cụ thể, muối mật hình thành từ glycine dễ dàng bị thủy phân hơn muối mật hình thành từ taurine [40, 79]. Rani và cộng sự cũng đã tiến hành kiểm tra khả năng phân giải của enzyme LgBSH từ vi khuẩn L. gasseri FR4 trên các loại muối mật GC, GDC, TC và TDC. Kết quả của họ chỉ ra rằng hoạt tính của LgBSH là mạnh nhất trên cơ chất GDC (~18 µmol/min/mg), LgBSH cũng cho thấy khả năng phân giải tốt hơn ở các muối mật glyco- conjugated (GC và GDC) so với các muối mật tauro-conjugated (TC và TDC) [80]. Một nghiên cứu khác từ Corzo và Gilliland (1999) cho thấy ba chủng L. acidophilus thể hiện hoạt tính thủy phân cao hơn trên muối natri của cholylglycine so với cholyltaurine [81]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 3 chủng Lactobacillus có khả năng phân giải đƣợc muối SGDC. Tuy nhiên không có chủng vi khuẩn nào có khả năng phân giải đƣợc muối SGC. 3.4.2. Kết quả xác định sự có mặt của các gen bsh Hoạt tính thủy phân muối mật của các vi khuẩn đƣờng ruột trong đó có cả Lactobacillus là cơ chế giúp chúng sống sót trong điều kiện khắc nghiệt của ruột và cũng là một trong những con đƣờng gián tiếp làm giảm mức độ cholesterol ở cơ thể ngƣời. Các enzyme BSH đƣợc mã hóa bởi các gen bsh tƣơng ứng, đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi axit mật. DNA tổng số đƣợc tách từ vi khuẩn Lactobacillus sau khi xác định đƣợc nồng độ thông qua máy quang phổ nanodrop đƣợc tiến hành PCR với 4 loại mồi bsh khác nhau. Các mồi bsh 1, 2, 3, 4 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự tƣơng đồng của gen bsh trên các chủng Lactobacillus khác nhau. Sản phẩm 50 PCR thu đƣợc một băng đặc hiệu rõ nét, các băng có kích thƣớc từ 500 bp – 650 bp tƣơng ứng kích thƣớc tính toán lý thuyết. Từ đó có thể khẳng định đƣợc sự có mặt của gen bsh ở các chủng vi khuẩn này. Ở cả 3 chủng vi khuẩn Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14, cả 4 gen mã hóa cho enzyme thủy phân muối mật (bsh1, bsh2, bsh3, và bsh4) đều đƣợc phát hiện. Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR các gen bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4 (lần lƣợt từ trái sang phải) của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. M: thang DNA chuẩn 1kb plus. L. plantarum WCFS1 là loài đầu tiên đƣợc dự đoán trong genome mang bốn gen bsh (bsh1, bsh2, bsh3 và bsh4). Để kiểm tra chức năng của các gen này, Lambert và cộng sự đã sử dụng một loài thiếu hụt các gen này là Lactococcus lactis, và biến nạp vào vi khuẩn từng loại trong bốn gen bsh biểu hiện quá mức. Sau các thử nghiệm và phân tích, nhóm nghiên cứu đã kết luận rằng chịu trách nhiệm phần lớn cho hoạt tính BSH của L. plantarum WCFS1 là gen bsh1. Ngoài ra, bsh1 cũng cho thấy sự liên quan đến khả năng hấp thụ các loại muối mật riêng biệt [61]. Các enzyme BSH của L. plantarum CGMCC 8198 cũng có vị trí xúc tác tƣơng tự nhƣ L. plantarum WCFS1, 51 nhƣng chúng chịu trách nhiệm thủy phân các cơ chất khác nhau. Trong khi BSH4 của L. plantarum CGMCC 8198 có hoạt tính thủy phân mạnh với TDCA thì BSH4 của L. plantarum WCFS1 lại ƣu tiên thủy phân cơ chất GDCA [21]. Trong nghiên cứu kiểm tra sự có mặt của BSH trong bộ gen Lactobacillus của 170 loài khác nhau, S. O’Flaherty và cộng sự đã thấy rằng 28% loài Lactobacillus mã hóa protein BSH, những loài này chủ yếu đƣợc tìm thấy trong hệ tiêu hóa của động vật có xƣơng sống. Điều này chứng tỏ các chủng Lactobacillus đã sản sinh enzyme BSH phân giải muối mật để thích nghi đƣợc với điều kiện sống khắc nghiệt [51]. Nghiên cứu của Thibault Allain và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm biểu hiện ba gen mã hóa cho enzyme BSH có trong bộ gen của L. johnsonii La1 bao gồm bsh47, bsh56, bsh12, phân tích mô hình cấu trúc các gen và thử nghiệm trên chuột nhiễm Giadia. Kết quả cho thấy BSH đã phát huy tác dụng đáng kể trong việc chống lại ký sinh trùng Giadia [52]. Nghiên cứu trên chủng L. fermentum MTCC 8711, S Jayashree và cộng sự đã xác định đƣợc hai gen bsh1 và bsh2 của chủng này mã hóa cho các protein tƣơng ứng là BSH1 và BSH2 với 26% trình tự axit amin giống nhau. Khi biến nạp các gen này vào chủng L. fermentum bản địa cho kết quả hoạt động của BSH đƣợc cải thiện rõ. [53]. 3.5. KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH S. AUREUS S. aureus là một trong những nhân tố chính gây nhiễm trùng ở ngƣời cũng nhƣ động vật [82, 83]. Do sử dụng kháng sinh liều cao để tiêu diệt vi khuẩn này có nguy cơ gây kháng kháng sinh, nên hiện nay probiotics đang đƣợc sử dụng nhƣ một liệu pháp thay thế kháng sinh để chống lại vi khuẩn này [30]. 52 Lactobacillus đã đƣợc biết đến từ lâu với khả năng sinh chất kháng khuẩn bao gồm H2O2, kháng sinh, các axit hữu cơ. Trong nghiên cứu này, dịch nuôi vi khuẩn đã loại bỏ tế bào của các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 đều thể hiện khả năng ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235, khả năng ức chế của mỗi chủng là khác nhau đƣợc thể hiện trên Hình 3.9. Hoạt tính ức chế sự sinh trƣởng của S. aureus của các chủng vi khuẩn này đƣợc xác định bằng cách đo đƣờng kính vòng kháng khuẩn trên đĩa petri. Kích thƣớc vòng kháng khuẩn thu đƣợc có đƣờng kính từ 11,7 ± 1,3 – 19,0 ± 1,0 mm. Trong đó chủng Lac.VFE-14 có đƣờng kính vòng kháng khuẩn lớn nhất là 19,0 ± 1,0 mm, tiếp theo là các chủng Lac.VFE-08 với đƣờng kính là 14,0 ± 1,0 mm và Lac.VFE-04 là 11,7 ± 1,3 mm. Hình 3.9. Khả năng ức chế sự sinh trƣởng với S. aureus của các chủng Lactobacillus Trong nghiên cứu của Fornitano et al. (2019), L. rhamnosus đã thể hiện khả năng ức chế sự sinh trƣởng của S. aureus cũng nhƣ làm giảm khả năng sản xuất enzyme gây độc coagulase (giảm từ 20,45 – 22,73%) [84]. Đối với probiotic L. rhamnosus HN001, sau 4 tuần thử nghiệm trên các đối tƣợng binh sĩ dƣơng tính với nhiễm S. aureus, số lƣợng S. aureus giảm đến 73- 83% 53 so với nhóm dùng giả dƣợc [30]. Nghiên cứu của Misaghi et al. (2017) cho thấy các vi khuẩn Lactobacillus gồm L. axitophilus, L. fermentum và L. paracasei ức chế sự sản xuất các Staphylococcal enterotoxin bao gồm SEA, SEC và SEE của vi khuẩn S. aureus [31]. Nhƣ vậy có thể thấy các chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 trong nghiên cứu này có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của S. aureus, có tiềm năng trong tƣơng lai để hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng do S. aureus. 3.6. ĐỊNH DANH VI KHUẨN rRNA 16S là một đoạn gen đa bản sao, bao gồm các vùng bảo tồn và biến đổi cao, là một phần của quá trình dịch mã do đó nó có mặt ở hầu hết các vi khuẩn, nên nó thƣờng đƣợc sử dụng để nhận dạng loài và phân biệt loài [85]. Hiện nay, phƣơng pháp định danh dựa theo sinh học phân tử dựa theo kỹ thuật giải trình tự đoạn gen rARN 16S đang đƣợc sử dụng phổ biến. 3.6.1. Kết quả tách DNA tổng số Những vi khuẩn đã xác định là Lactobacillus trong những thí nghiệm trƣớc đƣợc tiến hành tách chiết DNA theo quy trình trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Các mẫu DNA sau khi tách chiết đƣợc kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.10 cho thấy sự xuất hiện của 3 băng sáng và rõ nét do đó có thể kết luận đa thu đƣợc DNA. Các mẫu DNA sau đó đƣợc tiến hành kiểm tra nồng bằng máy quang phổ nanodrop với kết quả đƣợc trình bày trong Bảng 3.4. 54 Hình 3.10. Kết quả điện di các mẫu DNA của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. M: thang DNA chuẩn 1kb plus. Độ tinh sạch (A260/A280) là một chỉ số để xác định mức độ tinh khiết, không bị lẫn tạp chất của mẫu DNA. Do axit nucleic hấp thụ mạnh ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm, khi có lẫn tạp chất chúng sẽ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 280 nm. Xác định đƣợc tỉ số A260/A280 đồng nghĩa với việc xác định đƣợc lƣợng DNA trong mẫu có bị lẫn quá nhiều tạp chất hay không. Bảng 3.4. Kết quả đo nồng độ DNA của các mẫu Kết quả đo đã chỉ ra rằng, nồng độ DNA trung bình đạt đƣợc khoảng 500 ng/µL. Độ tinh sạch (A260/A280) đo đƣợc nằm trong khoảng 1,8 - 2,0 đảm Mẫu A260/A280 Nồng độ (ng/µl) Lac.VFE-04 1,89 541 Lac.VFE-08 1,81 495 Lac.VFE-14 1,88 571 55 bảo độ sạch cho phản ứng tiếp theo. 3.6.2. Kết quả PCR Đoạn gen rRNA 16S đƣợc khuếch đại bằng PCR với cặp mồi đặc hiệu (16S-F và 16S-R) theo quy trình đã đƣợc nêu trong phần phƣơng pháp nghiên cứu. Theo thiết kế, sản phẩm PCR thu đƣợc kích thƣớc là 1500 bp. Các sản phẩm tạo thành từ PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả điện di đƣợc trình bày nhƣ Hình 3.11. Hình 3.11. Kết quả sản phẩm PCR của các chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14. Kết quả cho thấy sự xuất hiện của 3 băng sáng và rõ nét, so với marker sử dụng trong hình, các băng của sản phẩm PCR đều có kích thƣớc khoảng 1500 basepair, phù hợp với kích thƣớc tính toán lý thuyết. Từ đó chúng tôi có thể kết luận: đã khuếch đại thành công đoạn gen rRNA 16S. 3.6.3. Kết quả giải trình tự Kết quả giải trình tự đƣợc xử lý với phần mềm BioEdit. Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh đƣợc so sánh với ngân hàng dữ liệu gen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). 56 Sau khi phân tích và so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI, cho thấy Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có mức độ tƣơng đồng cao (99-100%) so với chủng L. plantarum. Trong khi đó, Lac.VFE-08 có độ tƣơng đồng lên tới 98,65% so với L. rhamnosus NBRC 3425 (NR_113332.1). Từ đây xây dựng đƣợc cây phát sinh chủng loại đánh giá mối quan hệ di truyền các chủng phân lập với một số chủng thuộc chi Lactobacillus. Bảng 3.5. Kết quả so sánh với các trình tự 16S đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen (NCBI) của Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 và Lac.VFE -14 Kí hiệu chủng phân lập Tên chủng Mã số đăng ký trên NCBI Query cover (mức độ bao phủ) Identify (Tƣơng đồng) Lac.VFE -04 L. plantarum S7 GU195646.1 100% 99% L. plantarum T3R1C1 JX193637.1 100% 99% L. plantarum ST-III CP002222.1 100% 99% Lac.VFE -08 L. rhamnosus NBRC 3425 NR_113332.1 98% 98,65% L. rhamnosus JCM 1136 NR_043408.1 97% 98,38% L. rhamnosus JCM 1136 NR_043408.1 97% 98,38% Lac.VFE -14 L. plantarum ZZU 23 AB830324.1 100% 100% L. plantarum C KM507561.1 100% 100% L. plantarum KLB 416 KM670024.1 100% 100% Các chủng khảo sát dựa trên cây phát sinh chủng loại chia thành 2 nhóm rõ rệt. Trong đó, Nhóm 1 cho thấy chủng phân lập Lac.VFE-08 có mối 57 quan hệ di truyền gần nhất với chủng L. rhamnosus JCM 1136 và các chủng thuộc chi Lactobacillus nhƣ L. paracasei, L. casei, L. zeae (Hình 3.12). Nhóm 2, các chủng phân lập Lac.VFE-04, Lac.VFE-14 thể hiện mối quan hệ di truyền cao nhất với các chủng thuộc loài L. plantarum. Hình 3.12. Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S các chủng phân lập Lac. VFE-04, Lac. VFE-08, Lac. VFE-14 phân tích bằng phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree. Dựa trên kết quả cây phát sinh loài, 2 dòng Lac.VFE -04 và Lac.VFE - 14 có quan hệ gần với L. plantarum và Lac.VFE -08 là L. rhamnosus. L. plantarum là vi khuẩn Gram dƣơng, dạng que ngắn, vi hiếu khí, dung nạp axit, không hình thành bào tử, hàm lƣợng G + C thấp. Theo Tang và cộng sự, chủng L. plantarum MA2 có thể chịu đƣợc H2O2 lên tới 2 mM và quá trình lên men của nó có khả năng khử mạnh, ức chế peroxit hóa lipid [86]. Gần đây, chủng L. plantarum đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm bởi tính ứng dụng rộng rãi của chúng trong y tế, với các đặc tính chống oxy hóa, chống ung thƣ, chống viêm, chống nhiễm trùng, chống béo phì và chống đái Nhóm 1 Nhóm 2 58 tháo đƣờng [87]. L. rhamnosus là một loại vi khuẩn Gram dƣơng hình que, kỵ khí, có thể sống ở các bộ phận khác nhau trên cơ thể con ngƣời, bao gồm cả đƣờng tiêu hóa. L. rhamnosus một trong những chủng vi khuẩn probiotic đƣợc sử dụng rộng rãi nhất với các tác dụng có lợi đã đƣợc ghi nhận bao gồm phòng ngừa và điều trị nhiễm trùng dạ dày và tiêu chảy, kích thích phản ứng miễn dịch của cơ thể và ngăn ngừa một số triệu chứng dị ứng [88]. Nhƣ vậy, các chủng mà chúng tôi tuyển chọn đƣợc có tiềm năng sử dụng làm probitic và ứng dụng trong y học. 59 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Chúng tôi đã phân lập đƣợc 115 chủng vi khuẩn từ các mẫu phân. 3 chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-14 phân giải đƣợc muối mật SGDC nhƣng không phân giải đƣợc muối mật SGC, STC và STDC. 3 chủng này mang cả 4 gene bsh 1, bsh 2, bsh 3 và bsh 4. Lac.VFE-14 thể hiện khả năng sinh H2O2 mạnh hơn so với Lac.VFE-04, Lac.VFE-08. Chúng có khả năng sống sót cao trong môi trƣờng có muối mật 0,3% và ở pH 2-3. 3 chủng Lac.VFE-14, Lac.VFE-08 và Lac.VFE-04 có khả năng ức chế sự sinh trƣởng của vi khuẩn S. aureus ATCC-23235. Lac.VFE-08 có độ tƣơng đồng cao nhất là 98,65 % so với L. rhamnosus NBRC 3425. Trong khi đó, Lac.VFE-04 và Lac.VFE-14 có mức độ tƣơng đồng cao nhất với L. plantarum S7 (99%) và L. plantarum ZZU 23 (100%). 4.2. KIẾN NGHỊ Kết quả nghiên cứu trên nhằm bổ sung nguồn dữ liệu cho các nghiên cứu về vi khuẩn Lactobacillus sp có khả năng phân giải muối mật ở Việt Nam, là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm tìm ra các chủng Lactobacillus có tiềm năng trở thành các chủng probiotic ứng dụng trong y học. Từ các chủng vi khuẩn Lactobacillus đã tuyển chọn đƣợc ở trên, để chắc chắn chúng có đầy đủ khả năng để trở thành các chủng probiotic thích hợp cho con ngƣời sử dụng cần phải tiến hành thêm thí nghiệm khác. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Clarke S.F., Murphy E.F., Nilaweera K., Ross P.R., Shanahan F., O’Toole P.W., Cotter P.D., 2012, The gut microbiota and its relationship to diet and obesity: new insights, Gut microbes, 3(3), pp.186-202. 2. Koliada A., Syzenko G., Moseiko V., Budovska L., Puchkov K., Perederiy V., Gavalko Y., Dorofeyev A., Romanenko M., Tkach S., 2017, Association between body mass index and Firmicutes/Bacteroidetes ratio in an adult Ukrainian population, Vol. 17, pp. 120 3. Krajmalnik-Brown R., Ilhan Z.E., Kang D.W., DiBaise J.K. 2012, Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation, Nutrition in Clinical Practice, 27(2), pp. 201-214. 4. Fitzpatrick L.R., 2013, Probiotics for the treatment of Clostridium difficile associated disease, World journal of gastrointestinal pathophysiology, 4(3), pp. 47. 5. Denev S. 2006, Role of Lactobacilli Gastrointestinal Ecosystem, Bulgarian Journal of Agricultural Science, 12(1) pp 63. 6. Kumar R., Grover S., Batish V.K. 2011, Hypocholesterolaemic effect of dietary inclusion of two putative probiotic bile salt hydrolase- producing Lactobacillus plantarum strains in Sprague–Dawley rats, British Journal of Nutrition, 105(4), pp. 561-573. 7. Yuji A., Yasuhiro N., Yasuhiro K., Kenji T., Yasuhiko K., 2015, A highly acid-resistant novel strain of Lactobacillus johnsonii No. 1088 has antibacterial activity, including that against Helicobacter pylori, and inhibits gastrin-mediated acid production in mice, Microbiologyopen, 4(3), pp. 465–474. 8. Jeun J., Kim S., Cho S.Y., Jun H.J., Park H.J., Seo J.G., Chung M.J., Lee S.J., 2010, Hypocholesterolemic effects of Lactobacillus 61 plantarum KCTC3928 by increased bile acid excretion in C57BL/6 mice, Nutrition, 26(3), pp. 321-330. 9. Makarova K., Slesarev A., Wolf Y., Sorokin A., Mirkin B., Koonin E., 2006, Comparative genomics of the lactic acid bacteria, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(42), pp. 15611–15616. 10. Tannock G.W., 2004, A special fondness for lactobacilli, Applied and environmental microbiology, 70(6), pp. 3189-3194. 11. Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker S.C., 2008, Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72(4), pp. 728-764. 12. Goktepe I., Juneja V.K., Ahmedna M., 2005, Probiotics in food safety and human health, CRC Press. 13. Mukhtar H., 2006, Biosynthesis of protease from Lactobacillus paracasei: kinetic analysis of fermentation parameters. 14. Fekadu Mersha D., Pandita A Biotechnology Effect of Protease Enzyme Produced From Lactobacillus Species on the Milk. 15. Vonk R.J., Reckman G.A., Harmsen H.J., Priebe M.G., 2012, Probiotics and lactose intolerance, Intech, 7, pp. 149-160. 16. Narayanan N., Roychoudhury P.K., Srivastava A., 2004, L (+) lactic acid fermentation and its product polymerization, Electronic journal of Biotechnology, 7(2), pp. 167-178. 17. Wang J., Zhang H., Chen X., Chen Y., Bao Q., 2012, Selection of potential probiotic lactobacilli for cholesterol-lowering properties and their effect on cholesterol metabolism in rats fed a high-lipid diet, Journal of dairy science, 95(4), pp. 1645-1654. 18. Tomaro-Duchesneau C., Jones M.L., Shah D., Jain P., Saha S., Prakash S., 2014, Cholesterol assimilation by Lactobacillus probiotic bacteria: an in vitro investigation, BioMed research international 2014. 62 19. Choi E.A., Chang H.C., 2015, Cholesterol-lowering effects of a putative probiotic strain Lactobacillus plantarum EM isolated from kimchi, LWT-Food Science and Technology, 62(1), pp. 210-217. 20. Kim Y., Yoon S., Lee S.B., Han H.W., Oh H., Lee W.J., Lee S.M., 2014, Fermentation of soy milk via Lactobacillus plantarum improves dysregulated lipid metabolism in rats on a high cholesterol diet, PloS one, 9(2) pp. 88231. 21. Gu X.C., Luo X.G., Wang C.X., Ma D.., Wang Y., He Y.Y., Li W., Zhou H., Zhang T.C., 2014, Cloning and analysis of bile salt hydrolase genes from Lactobacillus plantarum CGMCC No. 8198, Biotechnology letters, 36(5), pp. 975-983. 22. Dong Z., Zhang J., Lee B., Li H., Du G., Chen J., 2012 A bile salt hydrolase gene of Lactobacillus plantarum BBE7 with high cholesterol-removing activity, European Food Research and Technology, 235(3), pp. 419-427. 23. Takemura N., Okubo T., Sonoyama K., 2010, Lactobacillus plantarum strain No. 14 reduces adipocyte size in mice fed high-fat diet, Experimental biology and medicine, 235(7), pp. 849-856. 24. Hertzberger R., Arents J., Dekker H.L., Pridmore R.D., Gysler C., Kleerebezem M., de Mattos M.J.T., 2014, H2O2 production in species of the Lactobacillus acidophilus group: a central role for a novel NADH-dependent flavin reductase, Appl. Environ. Microbiol, 80(7), pp. 2229-2239. 25. Edith L., Joseph L., Diane E. H., 2011, Glutathione peroxidase-1 in health and disease: from molecular mechanisms to therapeutic opportunities, Antioxidants & redox signaling, 15(7), pp. 1957-1997. 26. M.K. Boateng, S.L. Price, K.D., Huddersman, Susannah E. W., 2011, Antimicrobial activities of hydrogen peroxide and its activation by a novel heterogeneous Fenton’s‐like modified PAN catalyst, Journal of applied microbiology, 111(6), pp. 1533-1543. 63 27. Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 2013, Probiotic potential and safety properties of Lactobacillus plantarum from Slovak Bryndza cheese, BioMed research international 2013. 28. Kang D.K., Oh H., Ham J.S., Kim J., Yoon C., Ahn Y., Kim H. 2005, Identification and characterization of hydrogen peroxide-generating Lactobacillus fermentum CS12-1, Asian-australasian journal of animal sciences, 18(1), pp. 90-95. 29. Zsolt Z., Edina N., Ágnes B., Anna H., 2005, Influen