Đề tài Phân lập, tuyển chọn những chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase cao - Ứng dụng vào quá trình ủ phân hữu cơ từ vỏ trái ca cao

ị coi nhẹ trong quá trình sản xuất phân hữu cơ. Điều này thực chất rất quan trọng bởi vì độ ẩm thấp hơn sẽ kìm hãm hoạt động của vi khuẩn và tất cả vi khuẩn ngừng hoạt động tại độ ẩm 12 %. Nguyên liệu thô trước khi xử lý thường khô, các vi sinh vật không hoạt động và quá trình chuyển hoá phân hữu cơ không diễn ra. Giai đoạn đầu tiên của quá trình chế Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 19 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm biến phân hữu cơ là xử lý nước. Có nhiều phương pháp xử lý nước như: ngâm hoặc nhúng nguyên liệu vào nước, phun nước đều lên nguyên liệu. Để kích thích hoạt động của vi sinh vật, các nguyên liệu bổ sung được thêm vào khi xử lý nước như: phân gà, vỏ hạt bông, ammonium sulfate, urea Để cho quá trình phân tán nước đồng đều, cũng như phá vỡ phần nào cấu trúc cellulose của vỏ trái ca cao bằng biện pháp cơ học đó là băm nhỏ vỏ ca cao ra, khi đó một phần cấu trúc cellulose sẽ bị phá vỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân hủy vỏ ca cao. 2.4.5.6. Nhiệt độ Trong quá trình sản xuất phân hữu cơ quá trình bắt đầu từ nhiệt độ thường (20-400C), tăng nhiệt độ từ từ và đạt tới khoảng nhiệt độ cao (45-1220C), sau đó lại giảm xuống khoảng nhiệt độ nhiệt độ thường. Quá trình sản xuất phân hữu cơ nào cũng tăng và giảm nhiệt độ như vậy [19]. Sự thay đổi nhiệt độ cơ bản là một thông số phụ thuộc vào thời gian, nhiệt độ của nguyên liệu đưa vào sản xuất phân hữu cơ, sau một thời gian rất ngắn, bắt đầu tăng lên sau khi tạo lập những điều kiện cần thiết cho quá trình sản xuất phân hữu cơ. Sự thay đổi nhiệt độ ban đầu song song với giai đoạn ủ của quần thể vi khuẩn. Dưới những điều kiện thuận lợi, giai đoạn này sẽ được kế tiếp bởi giai đoạn gia tăng nhiệt độ gần như theo cấp số mũ tới nhiệt độ 600C đến khoảng 70-800C. Sự gia tăng nhiệt độ rất cao là kết quả phân huỷ những thành phần dễ phân hủy trong chất thải như: đường, tinh bột, một số protein đơn giản. Nhiệt độ này tiếp tục được duy trì qua một thời gian, độ dài của giai đoạn phụ thuộc vào loại hệ thống sản xuất phân hữu cơ sử dụng và bản chất của chất thải. Sau đó, nhiệt độ giảm dần xuống cho đến khi bằng môi trường xung quanh. Sau khi những thành phần dễ phân hủy đã được phân hủy và trong cơ chất chỉ còn những thành phần bền vững hơn, hoạt động của vi khuẩn cũng giảm đi và nhiệt độ bắt đầu giảm xuống. Nếu nhiệt độ của khối phân hữu cơ không tăng hoặc tăng chậm, mặc dù chất thải đã được đánh luống thì có thể một số điều kiện trong quá trình sản xuất phân hữu cơ chưa hợp lý. Trong trường hợp này, vấn đề có khả năng xảy ra cao nhất là độ ẩm cao quá 80 % hoặc thấp quá 12 %. Mùi hôi ngày càng nhiều là dấu hiệu của độ ẩm quá mức. Ngược lại, không có bất cứ mùi nào sẽ biểu thị cho độ ẩm quá thấp. Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 20 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm Độ ẩm cao quá có thể điều chỉnh bằng cách thêm vật liệu có nhiều chất xơ. Một giải pháp khác là tăng cường làm thoáng khí. Làm thoáng không chỉ cung cấp oxi cần thiết, mà còn làm hơi ẩm bay hơi. Thêm nước là biện pháp đương nhiên để điểu chỉnh độ ẩm quá thấp. Theo đó, trong những quá trình sản xuất phân hữu cơ thông thường, có thể nói rằng tại thời điểm nhiệt độ giảm xuống bằng hay gần bằng nhiệt độ môi trường, các thành phần chưa ổn định về mặt sinh học bắt đầu quá trình ổn định. Nhờ vậy, nguyên liệu được hoai mục thành phân hữu cơ đủ phẩm chất, cho phép lưu trữ hoặc sử dụng. Những kinh nghiệm đã qua cho thấy rằng sản phẩm phân hữu cơ có thể sử dụng an toàn hoặc có thể lưu trữ được sau khi nhiệt độ cuối cùng giảm đến mức 400C. 2.4.5.7. Sự thay đổi những tính chất vật lý [23] - Hình thức bề ngoài: Khối phân hữu cơ dần dần sậm lại, chứng tỏ quá trình phân hữu cơ diễn ra đúng hướng. Sản phẩm phân hữu cơ cuối cùng luôn luôn có màu đen, xám sẫm hoặc màu hơi nâu nâu. - Mùi: Chỉ vài ngày sau khi bắt đầu quá trình sản xuất phân hữu cơ một loạt các mùi khác nhau xuất hiện thay thế cho mùi vốn có ban đầu của cơ chất. Nếu quá trình tiến triển theo hướng tốt thì các mùi tiếp theo có thể được mô tả chung chung là gây buồn nôn. Mùi hôi là dấu hiệu của sự thiếu hụt oxi, thường là vì cơ chất có độ ẩm quá cao. Nếu điều kiện không thuận lợi tình trạng kỵ khí diễn ra thì mùi đặc trưng sẽ là mùi thối rữa. Nếu tỉ lệ C:N trong cơ chất thấp hơn 20:1 và pH khoảng 7,5 thì mùi chủ yếu là amoniac. Giai đoạn cuối cùng được đặc trưng bằng mùi đặc trưng của đất. - Kích cỡ hạt: Các hạt cơ chất có khuynh hướng ngày càng nhỏ vì sự phân rã và sự cọ sát giữa các hạt diễn ra trong quá trình đảo trộn. Ngoài ra, sự phân hủy làm cho các thớ sợi trở nên giòn, dễ gãy và làm cho vật chất không có hình dạng nhất định trở thành có dạng hạt. 2.5. Các chỉ tiêu xác định chất lượng phân thành phẩm Theo thông tư số 36/2010/TT-BNNPTNT về việc ban hành quy định sản xuất kinh doanh và sử dụng phân bón, thông tư này quy định chi tiết và hướng dẫn thực Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 21 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm hiện một số nội dung về quản lí chất lượng phân bón. Thông tư quy định các chỉ tiêu bắt buộc kiểm tra về hàm lượng dinh dưỡng được chấp nhận theo TCVN bao gồm một số chỉ tiêu như bảng 2.4: Bảng 2.4. Các chỉ tiêu phân hữu cơ Tên chỉ tiêu Mức Độ ẩm, % (không lớn hơn) 25 pH 6-8 Hàm lượng chất hữu cơ tổng số, % (không nhỏ hơn) 2,5 Acid humic 2,5 Hg, mg/kg (không lớn hơn) 2 Niken, mg/kg 100 Chì, mg/kg 200 Cadimi, mg/kg (không lớn hơn) 2,5 2.6. Chế phẩm sinh học [19] 2.6.1. Chế phẩm GEM GEM là chế phẩm sinh học bao gồm nhiều chủng vi sinh vật khác nhau trong đó 5 nhóm vi khuẩn lên men acid lactic, lên men rượu, vi khuẩn quang hợp, xạ khuẩn và nấm men. Năm nhóm vi khuẩn này tạo ra acid amin tự do, acid hữu cơ, vitamin hòa tan trong nước, kháng sinh tự nhiên và tạo ra các hoocmon tự nhiên. Vì thế các vi khuẩn này được sử dụng vào trong tự nhiên sẽ tạo ra mối liên kết nhằm khống chế các vi khuẩn gây hại đối với các loại cây trồng và vật nuôi. Chế phẩm GEM được tạo ra không phải bằng kỹ thuật di truyền và cũng không chứa các loài vi sinh vật được tạo ra bởi kỹ thuật di truyền. GEM rất an toàn, rẻ và ứng dụng có hiệu quả, cải thiện tốt môi trường. Các vi sinh vật tạo ra một môi trường sinh thái đồng nhất, sản sinh ra nhiều sản phẩm khác nhau cùng sinh trưởng, phát triển. Mỗi loại vi sinh vật trong chế phẩm GEM có chức năng năng hoạt động riêng của chúng. Các vi sinh vật này đều là những vi sinh vật có lợi chung sống trong cùng một môi trường, chúng sống cộng sinh với nhau, cùng hỗ trợ nhau do vậy hiệu quả của họat động tổng hợp của chế phẩm tăng lên rất nhiều. Trong bảo vệ môi trường: GEM có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây mùi thối do các loại khí H2S, SO2, NH3 gây ra, nên khi phun GEM vào rác thải, cống rãnh, Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 22 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm toilet, chuồng trại chăn nuôi....Sẽ khử được mùi hôi một cách nhanh chóng. Đồng thời số lượng ruồi muỗi, ve các loại côn trùng bay khác giảm hẳn số lượng. Chức năng phân hủy rác thải hữu cơ tiêu diệt các vi sinh vật gây thối, làm tốc độ hóa mùn diễn ra nhanh hơn. Đây là sản phẩm thân thiện môi trường. Chế phẩm GEM sử dụng: GEM- P, GEM-K 2.6.2. Chế phẩm Trichoderma Chế phẩm Trichoderma chứa thành phần chính là nấm Trichoderma và các enzyme thủy phân như cellulase, chitinase, xylanasegiúp cây trồng kháng bệnh. Khống chế và tiêu diệt các loại nấm bệnh như Rhizoctonia solani, Fusarium, Sclerotium gây bệnh thối rễ, chết yểu, héo rũ tạo điều kiện cho vi sinh vật trong đất phát triển, kích thích sự tăng trưởng của bộ rễ, phân giải các chất xơ, chitin, pectin, lignin trong phế thải hữu cơ thành đơn chất dinh dưỡng làm đất tơi xốp hơn, giúp cây dễ dàng hấp thu, tăng hàm lượng chất mùn và mật độ côn trùng có ích, giữ độ phì của đất. Dùng ủ phân chuồng có tác dụng phân hủy nhanh, mau hoai mục có thể bón trực tiếp cho cây trồng như rau, hoa, cây ăn quả, cây công nghiệp, tăng khả năng kháng một số nấm bệnh. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây. Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây có khả năng chịu được hạn hán. Nấm Trichoderma có khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan [30]. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Tuy nhiên, một số chế phẩm Trichoderma trên thị trường hiện nay chay theo thị hiếu, người nông dân do hạn chế về mặt kĩ thuật chuyên môn, sử dụng sản phẩm Trichoderma trên thị Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 23 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm trường tuy nhiên hiệu quả thật sự thì không như mong muốn, chính vì điều đó, chúng tôi tiến hành tự phân lập và tuyển chọn ra được hai dòng nấm mốc là T.viride và A.niger thử nghiệm nhân giống thay thế đối chứng với chủng Trichoderma thương mại. Chúng tôi cũng sử dụng một loại chế phẩm sinh học Trichoderma thương mại xuất phát từ nơi sản xuất có uy tín (vì lí do pháp lí không thể nêu tên công ty sản xuất và hình thực tế chế phẩm) để đối chứng với sản phẩm thuần gồm hai chủng nấm mốc kết hợp với nhau: T.viride và A.niger. 2.7. Hai chủng nấm mốc được tuyển chọn ứng dụng thực nghiệm 2.7.1. Trichoderma viride [3] Vị trí phân loại của T.viride: T.viride phân bố rộng rãi trong đất, xác bã thực vật. Theo Persoon et Gray (1801), thì T.viride thuộc ngành Ascomycota, lớp Euascomyces, bộ Hypocreae, giống Tricoderma. Các loài được nhận biết thông qua sự khác biệt về hình thái giữa các loài trong cùng giống. Tuy nhiên mức độ giống nhau về hình thái không liên quan mật thiết với quan về mặt phát sinh chủng loài. Trong trường hợp Trichoderma, rất khó phân biệt giữa các loài với nhau và với các loài có giai đoạn sinh sản hữu tính thuộc giống Hypocrea. Đặc điểm sinh học: khuẩn lạc ban đầu có màu trắng, sau đó có màu xanh lục do bào tử được hình thành. Cuống sinh bào tử có dạng chum, phân nhánh liên tục. Sinh ra các thể bình hình tam giác, mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình. Đính bào tử hình elip hoặc bầu dục, có màu xanh lục. Đặc điểm sinh hóa: T.viride có khả năng tổng hợp các enzyme như cellulase, xylanase, chitinase, protease, pectinase - Protease: T.viride có khả năng tạo ra hai loại protease. Protease thứ nhất phân giải protein thành polypeptide, pepton, còn protesea thứ hai tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm trên thành acid amin. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của chúng khoảng 500C. - Celulase: là phức hợp gồm nhiều enzyme, chủ yếu là cellulase C1, cellulase Cx và β-glucosidase hay cellobiase. Cellulase có tác dụng thủy phân cellulose thành cellobiose rồi thành glucose theo trình tự sau: Cellulse Cellobiase Cellulose Cellobiose Glucose Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 24 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm T.viride còn có khả năng tạo kháng sinh. Vì vậy T.viride còn được sử dụng làm nhân tố kiểm soát sinh học [28, 29]. 2.7.2. Aspergillus niger [3] Vị trí phân loại của A.niger: giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm này. Raper và Fennell chỉ dung một tên Aspergillus cho tất cả các loài bào tử trần. Như vậy A.niger có vị trí phân loại như sau: lớp Deuteromyces, bộ Moniliales, họ Moniliaceace, giống Aspergillus. Khuẩn ty phân nhánh, có vách ngăn, bào tử đính không nằm trong bọc bào tử, cuống sinh thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọng lớn hình cầu, màu nâu đen. Thể bình gồm hai lớp, lớp thứ nhất hình tam giác ngược, lớp thứ hai hình chai, bào tử đính xòe ra, có hình cầu xù xì, có màu nâu đen đến màu than. Đặc điểm sinh học của A.niger: sinh trưởng không cần ánh sáng. Nấm có thể phát triển tốt ở môi trường acid nhưng pH tối ưu là 4 – 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH> 9. Đặc điểm sinh hóa: A.niger có khả năng tổng hợp các enzyme như cellulase, α-amylse, protease, có khả năng lên men đường, đồng hóa tốt các loại đường đơn và đường đôi như glucose, fructose, maltose, saccharose. α-amylse: A.niger có khả năng tổng hợp α-amylse ngoại bào để thủy phân tinh bột tạo dextrin và một ít maltose và glucose. α-amylse của A.niger hoạt động tối ưu ở pH từ 4,5-4,7. Trong khi để đường hóa tinh bột, pH thích hợp nhất là 5-5,5 ở 500C. Enzyme bị mất hoạt tính sau 30 phút ở pH = 2,5. A.niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm. α-amylse Tinh bột Dextrin (nhiều) + Maltose (ít) + Glusose (ít) Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 25 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1. Thời gian và địa điểm - Thời điểm: 25/02/2013 đến ngày 12/07/2013. - Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh- Hóa sinh trường Đại học Bà Rịa - Vũng Tàu. Khuôn viên trường Đại học Bà Rịa- Vũng Tàu và Cty TNHH Ca cao Thành Đạt. 3.1.2. Nguyên vật liệu Vật liệu để phân lập chủng nấm mốc: vỏ ca cao tại xã Xà Bang, huyện Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu; mẫu đất tại khuôn viên Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu; mẫu đất tại Xã Bông Trang, Huyện Xuyên Mộc và xã Xà Bang, huyện Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu. Cám gạo, vỏ trấu, vỏ ca cao xay nhuyễn, bã mía phơi khô, vỏ lạc. Vật liệu để nghiên cứu xử lí phân hủy cellulose thành phân hữu cơ là vỏ ca cao của Cty TNHH Thành Đạt tại Xã Xà Bang, Huyện Châu Đức, Bà Rịa - Vũng Tàu. 3.1.3. Hóa chất - (NH4)2SO4; - KH2PO4; - CaCl2; - MgSO4; - MnSO4.7H2O; - FeSO4; - CoCl2; - Pepton; - Agar; - ZnSO4; - KCl; - NaOH; - H2SO4; - HCl; - Urea; - Glucose; - CMC; - Cồn; - Lactose; - KNO3; - Tartrat Kali Natri; - DNS; - Phân lân; - Sodium Acetate; - CuSO4; - K2SO4; - Đỏ metyl; - Xanh metylen; - Etanol 96 %; - Phenolphtalein; - CaO. 3.1.4. Môi trường nghiên cứu phân lập - Môi trường phân lập nấm mốc thạch - khoai tây PGA (phụ lục 1); - Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase bằng phương pháp đục lỗ trên thạch 2 % agar, 1 % CMC (phụ lục 1); - Môi trường phân lập Trichoderma sp trong đất M1 (phụ lục 1); Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 26 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm - Môi trường Czapeck xác định nhanh hoạt tính enzyme cellulase trực tiếp trên khuẩn lạc (phụ lục 1); - Môi trường bổ sung mandel bổ sung 10 ml dung dịch khoáng vi lượng (phụ lục 1). 3.1.5. Dụng cụ thí nghiệm Thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm: - Máy ly tâm, buồng đếm hồng cầu; - Máy đo pH; - Bộ chưng cất đạm; - Bình mircokjeldahl, buret, pipet, giấy lọc không tro, thước đo; - Bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, vortex, cân phân tích; - Bếp điện, ống nghiệm; - Đĩa petri, que cấy, que trang, đèn cồn, bông hút ẩm, bông không hút ẩm; - Đũa thủy tinh; - Máy khuấy từ; - Máy lắc ngang; - Máy phân tích độ ẩm; - Nồi khử autoclave; - Tủ cấy, tủ hút, tủ lạnh, tủ sấy, kính hiển vi; - Lamen, băng keo trong Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 27 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm 3.1.6. Thiết bị sử dụng Thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu thực nghiệm: Bảng 3.1. Dụng cụ cần sử dụng Dụng cụ Số lượng Dụng cụ Số lượng Cuốc 2 cái Bình xịt 1 cái Xẻng 2 cái Thùng ozoa 2 cái Thùng chứa nước 3 cái Bạt nilong 3 cái 3.2. Bố trí thí nghiệm 3.2.1. Thí nghiệm 1: phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao  Mục đích thí nghiệm: phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao.  Bố trí thí nghiệm: Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 28 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm Hình 3.1. Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 1 Bình tam giác + 90 ml nước cất Lắc đều trong 15 phút Cân 10g bột vỏ Giã nhỏ mẫu vỏ ca cao và đất Cân 10g bột đất Bình tam giác + 90 ml nước cất Lắc đều trong 15 phút Xác định đường kính vòng phân giải trên khuẩn lạc Tách dòng Quan sát Ủ 48 giờ Pha loãng đến 10-6 Pha loãng đến 10-6 Cấy vào môi trường PGA Cấy vào môi trường M1 Định danh sơ bộ Kết quả định danh Định danh tại trung tâm KHCN Sắc Ký Hải Đăng Giữ giống trên PGA Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 29 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm Nội dung theo dõi: - Phân lập; - Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao bằng phương pháp xác định đường kính vòng phân giải theo thời gian; - Định danh sơ bộ tại phòng thí nghiệm; - Định danh tại trung tâm KHCN Sắc Ký Hải Đăng. 3.2.2. Thí nghiệm 2: Phương pháp xác định ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase a. Mục đích thí nghiệm Xác định pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. b. Nội dung thí nghiệm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 30 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm Hình 3.2. Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 2 - Số nhân tố thí nghiệm: 2; - Số nghiệm thức:  Nhân tố B: 2 chủng nấm mốc;  Nhân tố C: 3 giá trị pH khác nhau; - Số lần lặp lại: 3; - Số đơn vị thí nghiệm: 2 x 2 x 3 x 3 = 36. Sau khi cấy chủng vi sinh vật thuần khiết trên môi trường PGA, tiến hành đếm số lượng bào tử theo thời gian, đến khi đạt số lượng 106 bào tử/ml, tiến hành cấy nuôi hai chủng nấm mốc này trong môi trường lỏng với pH = 5, pH = 6, pH = 7 cơ chất cảm ứng là bột vỏ ca cao, ứng với thời gian nhất định tiến hành lấy dịch chiết enzyme đem pH thích hợp B1: Trichoderma viride B2: Aspergillus niger C1: pH=5 C2: pH=6 C3: pH=7 Xác định đường kính vòng phân giải Đo hàm lượng đường khử C1 C2 C3 Czapeck+ bột vỏ ca cao Cấy trên môi trường PGA B1 B2 Chiết dịch enzyme Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 31 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm đi xác định sơ bộ nhanh tương quan giữa đường kính vòng tròn và thời gian phân giải trên môi trường thạch theo phương pháp đục lỗ thạch bằng khoan nút chai, đồng thời tiến hành xác định lại bằng phương pháp xác lượng đường khử (phụ lục 1). c. Chỉ tiêu theo dõi - Hàm lượng đường khử theo thời gian; - Đường kính vòng phân giải theo thời gian. 3.2.3. Thí nghiệm 3: xác định môi trường bán rắn thích hợp để các chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase a. Mục đích thí nghiệm Xác định môi trường bán rắn thích hợp để các chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase. b. Bố trí thí nghiệm Sau khi đã xác định được pH và thời gian tối ưu, tiến hành nuôi cấy trên môi trường bán rắn (phụ lục 2) với pH cho hoạt tính cao nhất. Sau đó theo thời gian, tiến hành chiết dịch enzyme và đem so màu ở bước sóng 540 nm và tính toán hoạt độ (phụ lục 2). Hình 3.3. Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 3 B1 B2 B1: Trichoderma viride B2: Aspergillus niger D1: Cám - Vỏ lạc D2: Cám - Trấu D3: Vỏ ca cao D1 D2 D3 Chiết dịch enzyme Đo đường khử Môi trường thích hợp Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 32 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm - Số nhân tố thí nghiệm: 2; - Số nghiệm thức:  Nhân tố B: 2;  Nhân tố D: 3; - Số lần lặp lại : 3; - Đơn vị thí nghiệm: 2 x 2 x 3 x 3 = 36. c. Chỉ tiêu theo dõi Hàm lường đường khử trong các môi trường bán rắn khác nhau theo thời gian. 3.2.4. Thí nghiệm 4: Xác định thời gian thu nhận bào tử nấm mốc thích hợp a. Mục đích thí nghiệm Xác định thời gian các chủng nấm mốc sinh ra lượng bào tử cao nhất. b. Bố trí thí nghiệm Hình 3.4. Sơ đồ khối bố trí thí nghiệm 4 - Số nhân tố thí nghiệm: 1; - Số nghiệm thức: 2; - Số lần lần lặp lại: 3; - Đơn vị thí nghiệm: 1 x 2 x 3 = 6. c. Chỉ tiêu khảo sát: Số lượng bào tử/1g môi trường nuôi cấy theo thời gian. Bột vỏ ca cao Đếm số lượng bào tử sinh ra theo thời gian Thời thời gian thích hợp thu bào tử B1 B2 B1: Trichoderma viride B2: Aspergillus niger Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 33 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm 3.2.5. Thí nghiệm 5: khảo sát sự biến đổi của các nhân tố chính trong quá trình ủ phân hữu cơ từ vỏ trái ca cao a. Mục đích: so sánh khả năng tốc độ hoai mục của ba đống ủ: - Sử dụng Trichoderma thương mại; - Sử dụng hai chủng nấm mốc phân lập; - Không bổ sung nấm mốc. Mục tiêu của đề tài là chuyển hóa vỏ trái ca cao thành phân bón hữu cơ, ứng dụng trực tiếp trên quy mô nhỏ, tại các hộ gia đình nông dân trên địa bàn tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu. Vì vậy chúng tôi lựa chọn mô hình ủ vỏ ca cao là mô hình dạng chóp cụt tròn xoay với chiều rộng đáy là 2 m, chiều cao là 1,1 m. Sau khi đánh đống vỏ tiến hành phủ lên trên bề mặt đống ủ bằng bạt nilông. Thực tế mô hình thuộc dạng sản xuất phân hữu cơ dạng luống, chiều dài của đống ủ có thể kéo dài tùy ý, tuy nhiên với quy mô nhỏ hộ gia đình khối lượng cơ chất không quá lớn, vì thế chúng tôi sử dụng giải pháp hình chóp cụt tròn xoay với kích thước như trên (có thế thay đổi kích thước đáy 2-3 m, chiều cao dao động từ 1,1-1,5 m tùy thuộc lượng vỏ sau thu hoạch). Để rút ngắn thời gian phân hủy của vỏ ca cao, tiến hành băm nhỏ vỏ ca cao với kích thước từ 4-6 cm. Sau đó sử dụng vi sinh vật dưới dạng chế phẩm và kết hợp với chủng nấm mốc chúng tôi nghiên cứu được từ thực nghiệm. Mô hình của chúng tôi nghiên cứu thực nghiệm có đặc điểm: - Quy trình kĩ thuật đơn giản; - Dễ dàng kiểm soát được các yêu tố diễn ra trong quá trình ủ phân; - Khắc phục được những hạn chế về mùi và vẻ mĩ quan; - Chi phí đầu tư thấp. Hình 3.5. Mô hình thí nghiệm Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 34 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm b. Bố trí thí nghiệm: Hình 3.6. Sơ đồ khối bố trí quá trình ủ phân hữu cơ từ vỏ trái ca cao Cắt nhỏ Chế phẩm GEM + Nước Phối trộn đều Đánh đống + Phủ bạt Đảo trộn đều Phối trộn Đảo trộn Ủ lên men hiếu khí Đảo trộn Phơi khô Phối trộn đều Đánh đống + Phủ bạt Bổ sung nước + Cám gạo Vỏ ca cao sau khi tách hạt Phân chuồng đã hoai sơ bộ A1 A2 A3 Nghiền Phân hữu cơ A1: Bổ sung chế phẩm nấm Trichoderma thương mại A2: Bổ sung nấm mốc được phân lập và xử lý tại phòng thí nghiệm A3: Không bổ sung thêm vsv Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 35 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm c. Thuyết minh quy trình Sau khi băm nhỏ vỏ ca cao, tiến hành phơi khô đến khi vật liệu còn độ ẩm khoảng 40-55 %. Tính toán xác định khối lượng nguyên liệu vỏ ca cao để phối trộn các thành phần dinh dưỡng theo tỉ lệ sau: - Phân dê 20 %; - Phân lân 5 %; - Vôi bột 0,5 %; - Phân Urea 1 %; - Đường cát vàng 0,2 %; - Men sinh học GEM-P1 0,2 %; - Men sinh học GEM-K 0,1 %. Sau đó tiến hành phối trộn với một số phụ gia và tiến hành các giai đoạn ủ. Trong suốt thời gian ủ phân, phải tiến hành xác định các yếu tố như: nhiệt độ, pH, độ ẩm, carbon, nitơ, tỷ lệ C:N, cellulose. Nguyên liệu: Bảng 3.2. Thành phần nguyên liệu cần chuẩn bị STT Tên nguyên liệu Khối lượng 1 Vỏ ca cao 500 kg 2 Phân Urea 5 kg 3 Đường cát (loại vàng) 2 kg 4 Phân lân 20 kg 5 Vôi bột 15 kg 6 Phân chuồng 50 kg 7 GEM-P 1kg 8 GEM-K 1 lít 9 T.viride 1 kg 10 A.niger 1kg 11 Bã mía hay rơm khô Lót dưới đáy đống ủ và phủ kín đống ủ Các bước thực hiện Trước khi ủ khoảng 12-15 tiếng, tiến hành hòa tan 4,5 kg urea, 0,5 kg đường vào 50 lít nước sạch, cho vào bình xịt, sau đó rải đều phân chuồng và vỏ ca cao thành từng lớp vừa phun dịch hòa tan trên sao cho ướt đều bề mặt vỏ ca cao, rải cho đến khi bề dày đống vỏ khoảng 10 cm, sau đó trộn đều. Sau 12 tiếng sau vỏ ca cao sẽ thấm nước Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Trường ĐHBRVT Sv Nguyễn Văn Tới – Lớp DH09H1 36 Khoa Hóa học và Công nghệ thực phẩm mềm ra. Trong quy trình ủ này, gia