Luận án Khảo sát thành phần hóa học và khả năng kích thích hệ miễn dịch của cỏ sữa lá lớn (euphorbia hirta l.) vùng đồng bằng sông Cửu Long trên đối tượng cá tra

(C-4), 6 nguyên tử carbon bậc bốn ở δC [164.6 (C-2), 164.4 (C-7), 162.0 (C-5), 157.8 (C-9), 150.2 (C-4), 146.2 (C-3)]; ngoài ra còn có hai nguyên tử carbon bậc bốn khác ở 122.1 (C-1) và 104.2 (C- 10). Tín hiệu của 6 nhóm methine còn lại ở δC [119.4 (C-6), 116.5 (C-5), 113.9 (C-2), 103.4 (C-3), 99.3 (C-6) và 94.3 (C-8)]. Các dữ liệu phổ trên, cùng với việc so sánh với chất tham khảo trong tài liệu [208] cho phép kết luận hợp chất Eup08 là luteolin. Cùng với các hợp chất flavonoid khác, luteolin được xem là một trong những hợp chất quan trọng quyết định hoạt tính kháng oxi hóa, kháng vi sinh vật, kháng ung thư. Hợp chất này cũng đã được phân lập từ nhiều loài trước đó trong thiên nhiên [209]. 80 Bảng 4.7 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup08 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup08 (DMSO-d6) Luteolin (DMSO-d6) [208] δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz 2 164.6 163.9 3 6.65 (1H, s) 103.4 6.67 (1H, s) 102.9 4 182.1 181.7 5 162.0 161.5 6 6.19 (1H, s) 99.3 6.19 (1H, d, 2.0) 98.9 7 164.4 164.2 8 6.44 (1H, s) 94.3 6.45 (1H, d, 2.0) 93.9 9 157.8 157.3 10 104.2 103.7 1 122.1 121.6 2 7.39 (1H, s) 113.9 7.42 (1H, m) 113.4 3 146.2 145.8 4 150.2 149.7 5 6.90 (1H, d, 8.4) 116.5 6.90 (1H, d, 8.0) 116.1 6 7.40 (1H, d, 8.4) 119.4 7.42 (1H, m) 119.0 5-OH 12.95 (1H, s) 12.98 (1H, s) Hợp chất Eup09: quercetin Phổ 1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6, phụ lục 7.1) của hợp chất Eup09 xuất hiện các tín hiệu tại δH 6.88 (d, J = 9.0 Hz); 7.54 (d, J = 9.0 Hz) và 7.68 (s) gợi ý sự mặt của hai nhóm thế vào vòng B ở vị trí C-3 và C-4. Trên phổ còn có sự hiện diện của hai tín hiệu tại δH 6.19 (s) và δH 6.41 (s), là dấu hiệu nhận biết của một hợp chất flavonol. Phổ 13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6, phụ lục 7.2) và DEPT (phụ lục 7.3) có tín hiệu của 15 carbon, trong đó có tín hiệu δC 176.3 đặc trưng cho nhóm >C=O; năm nhóm =CH– đặc trưng cho các =CH– nhân thơm ở δC [98.7 (C-6); 93.8 (C-8); 115.5 (C-2); 116.1 (C-5); 120.4 (C-6)]; 9 carbon bậc bốn, trong đó có sáu carbon bậc bốn kề nối đôi và mang nhóm thế oxy tương ứng với các vị trí 2, 3, 5, 7, 9, 3, 4; tín hiệu carbon bậc bốn có độ dịch chuyển tại δC 145.5; 147.3; 161.2; 164.4 đặc trưng cho dạng liên kết của nhân thơm với nhóm –OH của các carbon C-3, C-4, C-5, C-7. Tại δC 103.5 và δC 122.4 là 2 tín hiệu đặc trưng cho carbon bậc bốn kề nối đôi >C= ứng với C-10 và C-1. 81 Dữ liệu phổ 1H-NMR kết hợp với phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất Eup09 có 5 nhóm =CH– thơm, đồng thời các nhóm thế vào vòng thơm là các nhóm –OH và 1 tín hiệu của nhóm >C=O dự đoán được đây là đặc trưng cho hợp chất thuộc khung flavonol. Phân tích các dữ kiện phổ NMR của Eup09 cùng với giá trị phổ HR-ESI-MS cho đỉnh ion giả phân tử [M-H] ̄ m/z = 301.0388 (phụ lục 7.4) và kết hợp so sánh với các số liệu phổ của hợp chất quercetin trong tài liệu công bố [210] thấy hoàn toàn phù hợp, từ đó có thể kết luận hợp chất Eup09 là quercetin (3,3′,4′,5,7-pentahydroxyflavone). Hợp chất này đã được chứng minh có nhiều hoạt tính sinh học đáng quý và tồn tại khá phổ biến trong nhiều nguồn thực vật trong tự nhiên [211, 212]. Bảng 4.8 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup09 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup09 (DMSO-d6) Quercetin (DMSO-d6) [210] δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz 2 148.2 147.9 3 136.2 135.9 4 176.3 176.0 5 161.2 160.9 6 6.19 (1H, s) 98.7 6.17 (1H, d, 2.0) 98.4 7 164.4 164.1 8 6.41 (1H, s) 93.8 6.39 (1H, d, 2.0) 93.5 9 156.6 156.3 10 103.5 103.2 1 122.4 122.1 2 7.68 (1H, s) 115.5 7.66 (1H, d, 2.0) 115.2 3 145.5 145.2 4 147.3 147.0 5 6.88 (1H, d, 9.0) 116.1 6.87 (1H, d, 8.5) 115.8 6 7.54 (1H, d, 9.0) 120.4 7.53 (1H, dd, 8.0 và 2.0) 120.2 82 HO OH O O OH OH Eup08: luteolin O OH OH OH OOH HO Eup09: quercetin Hình 4.9 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup08 và Eup09 Hợp chất Eup11: (+)-catechin Hợp chất Eup11 thu được dưới dạng bột màu trắng ngà. Khác với các hợp chất trên, phổ NMR của Eup11 gợi ý hợp chất này có cấu trúc dạng khung flavan-3-ol. Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 8.1) có hai tín hiệu mũi đôi của hai proton vòng thơm ghép cặp meta tại δH 5.95 (1H, d, J = 2.5 Hz); 5.88 (1H, d, J = 2.5 Hz) của vòng A và ba tín hiệu mũi đôi khác đặc trưng cho ba proton vòng thơm B tại tại vị trí 1, 3, 4 tại δH 6.86 [(1H, d, Jmeta = 2.0 Hz, H-2); 6.79 (1H, d, Jorto = 8.0 Hz, H-5) và 6.74 (1H, dd, Jmeta và orto = 2.0/8.0 Hz, H-6)]. Ở phía trường cao hơn xuất hiện hai tín hiệu cộng hưởng tại H 4.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-2) và H 4.01 (1H, m, H-3) đặc trưng cho hai nhóm methine mang oxy; hai tín hiệu cộng hưởng tại H [2.89 (1H, dd, J = 16.0/5.5 Hz, H-4a); 2.55 (1H, dd, J = 16.0/8.5 Hz, H-4b)] thể hiện sự có mặt của một nhóm methylene. Ngoài ra còn có các tín hiệu của 1 vòng benzene 4 lần thế tại 1, 2, 3, 5 ở δH [5.95 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-8) và 5.88 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6)]. Tương ứng, trên phổ 13C-NMR và DEPT (phụ lục 8.2 và phụ lục 8.3) của Eup11 cho tín hiệu của 15 nguyên tử carbon, gồm 12 carbon của 2 vòng benzene, 2 carbon nhóm oxymethine δC [82.9 (C-2) và 68.8 (C-3)] và 1 carbon methylene –CH2– tại [δC 28.5 (C-4)], không thấy xuất hiện nhóm carbonyl. Trên phổ HMBC (phụ lục 8.4), proton methine ở δH 4.59 (1H, d, J = 8.0 Hz) cho tương quan với 4 carbon vòng benzene gồm 2 carbon bậc ba ở δC 120.1 và δC 115.3, một carbon bậc ba mang oxy ở δC 157.8 và 1 carbon bậc bốn ở δC 132.2 chứng tỏ proton này phải là H-2, bốn carbon benzene lần lượt là C-6, C-2, C-9 và C-1. Ngoài ra, proton H- 2 còn cho tương quan HMBC với 1 carbon oxymethine ở δC 68.8 và một carbon methylene ở δC 28.5 xác nhận hai carbon này lần lượt là C-3 và C-4. Proton H-4 cho 83 tương quan với 2 carbon bậc ba mang oxy ở δC 157.6 và δC 157.8 và một carbon bậc bốn ở δC 100.9 khẳng định 3 carbon này lần lượt là C-5, C-9, và C-10. Proton ở δH 5.95 (1H, d, J = 2.5 Hz) cho tương quan HMBC với C-9 chứng tỏ proton này phải là H-8. Suy ra, proton ghép meta với H-8 ở δH 5.88 (1H, d, J = 2.0 Hz là H-6. Proton H-6 ngoài tương quan với C-5, C-8, C-10 còn cho tương quan HMBC với 1 carbon bậc ba mang oxy ở δC 156.9 nên carbon này là C-7. Proton vòng benzene còn lại ở δH 6.79 (1H, d, J = 8.0 Hz) ghép ortho với H-6 chỉ có thể là H-5. Mặt khác, proton H-6 cho tương quan với carbon bậc ba mang oxy ở δC 146.3 và proton H-2 cho tương quan với carbon bậc ba mang oxy ở δC 146.2 trên phổ HMBC nên các carbon này là C-4 và C-3. Phân tích hằng số ghép cặp J của proton H-2 ở H 4.59 (1H, d, J = 8.0 Hz) và hằng số ghép cặp của H-2 và H-3 là 3J2-3 = 8.0 Hz (ghép trục-trục), cho thấy 2 proton này phải nằm ở vị trí trục ứng với 1 trong 2 đồng phân: (+)-catechin (-)-catechin Từ những dữ liệu phổ nghiệm, kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo [213] hợp chất Eup11 được đề nghị là catechin. Mặt khác, độ quay cực của Eup11 là [α]30 D + 25.7 (c 0.01, MeOH) phù hợp với tài liệu tham khảo [214], chứng tỏ hợp chất này là (+)- catechin. Hợp chất này khá phổ biến trong tự nhiên với hoạt tính kháng oxi hóa mạnh [215-217], nhưng đây là lần đầu tiên hợp chất được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn. Bảng 4.9 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup11 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup11 (CD3OD) (+)-Catechin (CD3OD) [213] δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz HMBC (H → C) δH ppm (J, Hz) 400 MHz C ppm 100 MHz 2 4.59 (d, 8.0) 82.9 C-3, 4, 9, 1', 2', 6' 4.58 (d, 6.7) 82.9 3 4.01 (m) 68.8 3.99 (m) 68.8 4 2.89 (dd, 5.5; 16.0) 2.55 (dd, 8.5; 16.0) 28.5 C-2, 3, 5, 9, 10 2.85 (dd, 5.5; 16.1) 2.52 (dd, 8.4; 16.1) 28.5 O HO H H (S) (R) 2 3 HO HO OH OH 84 5 157.6 157.6 6 5.88 (d, 2.5) 95.5 C-5, 7, 8, 10 5.93 (d, 2.3) 96.3 7 157.8 157.8 8 5.95 (d, 2.5) 96.3 C-7, 9, 10 5.87 (d, 2.3) 95.6 9 156.9 156.9 10 100.9 100.9 1' 132.3 132.3 2' 6.86 (d, 2.0) 115.3 C-2, 4', 6' 6.85 (d, 2.0) 115.3 3' 146.3 146.3 4' 146.2 146.2 5' 6.79 (d, 8.0) 116.1 C-1', 3' 6.77 (d, 8.1) 116.2 6' 6.74 (dd, 2.0; 8.0) 120.1 C-2, 2', 4' 6.72 (dd, 2.0; 8.1) 120.1 Hợp chất Eup14: afzelin Hợp chất Eup14 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng. Dữ liệu phổ 1D-NMR, 2D-NMR cho thấy có sự giống nhau với các hợp chất Eup01 và Eup15 ở các tín hiệu vòng thơm của khung flavonoid và các tín hiệu của đường α-L-rhamnopyranosyl. Phổ 1H-NMR hợp chất Eup14 (500 MHz, CD3OD, phụ lục 9.1) xuất hiện tín hiệu của 2 proton vòng thơm 4 lần thế tại δH [6.22 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6); 6.39 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8)] của vòng A và bốn proton vòng thơm thế ở vị trí para tại δH [7.78 (2H, d, J = 8.25 Hz, H-2, H-6); 6.95 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-3, H-5)] của vòng C. Ngoài ra, tín hiệu của phân tử đường cũng được xác định khi tín hiệu của một proton anomer xuất hiện tại δH 5.39 (1H, d, J = 1.5 Hz), tín hiệu proton của nhóm methyl tại δH 0.94 (3H, d, J = 5.5 Hz) và các tín hiệu của các nhóm oxymethine xuất hiện tại vùng δH 3.34-4.24. Dữ liệu phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 9.2) phù hợp với dữ liệu phổ 1H-NMR khi xuất hiện nhiều carbon thơm có gắn với nhóm hydroxyl, một nhóm carboxyl tại δC 179.6 (C-4), một nhóm methyl tại δC 17.7 (C-6). Xem xét trên phổ HMBC (phụ lục 9.3) thấy có tương quan giữa proton anomer H-1 tại δH 5.39 với carbon C-3 tại δC 136.2, chứng tỏ cấu tử đường được gắn vào vị trí C-3 của khung flavonoid. 85 Bảng 4.10 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup14 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup14 (CD3OD) Afzelin (CD3OD) [218] δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz HMBC (H → C) δH ppm (J, Hz) 400 MHz C ppm 100 MHz 2 158.6 158.6 3 136.2 136.2 4 179.6 179.4 5 163.2 163.2 6 6.22 (1H; d; 2.0) 99.9 C-5, 7, 8, 10 6.19 (2H; d; 2.44) 100.1 7 166.0 166.6 8 6.39 (1H; d; 2.0) 94.8 C-6, 7, 9, 10 6.36 (1H; d; 2.2) 94.9 9 159.3 159.2 10 105.9 105.7 1' 122.7 122.6 2, 6 7.78 (2H; d; 8.25) 131.9 C-3, 5, 2, 6, 4, 2 7.76 (2H; d; 8.76) 131.9 3, 5 6.95 (2H; d; 8.5) 116.5 C-3, 5, 4, 1 6.93 (2H; d; 8.88) 116.5 4' 161.6 161.6 1 5.39 (1H; d; 1.5) 103.5 C-3 5.36 (1H; d; 2.2) 103.5 2 4.24 (1H; dd; 3.5 và 1.5) 72.2 4.21 (1H; dd; 3.42 và 1.7) 72.1 3 3.73 (1H; dd; 9.0 và 3.5) 72.0 3.71 (1H; m) 72.0 4 3.34 (1H; m) 73.2 3.60 (1H; m) 73.2 5 3.34 (1H; m) 71.9 3.47 (1H; m) 71.9 6 0.94 (3H; d; 5.5) 17.7 0.91 (3H; d; 5.6) 17.7 Kết hợp với tài liệu tham khảo [218], hợp chất Eup14 tương ứng với công thức phân tử C21H20O10 và được xác định là afzelin. Đây là một flavonoid phân lập được từ nhiều loại thực vật trong thiên nhiên như loài Pinus koraiensis, Cornus macrophylla với hoạt tính kháng khuẩn Pseudomonas aeruginosa hiệu quả, hay từ lá của loài Kalanchoe tomentosa với khả năng gây độc tế bào trên dòng tế bào P-388 gây bệnh bạch cầu [218- 220]. 86 Tương quan HMBC trong vòng B và vòng A của Eup14 được minh hoạ ở Hình 4.10 và Hình 4.11 O OOH HO OH 2 4 6 3 1' 2' 6' 5' 4' 3' 10 9 8 7 5 H H H H Hình 4.10 Tương quan HMBC trong vòng B của hợp chất Eup14 O OO HO 2 4 6 310 9 8 7 5H H H Hình 4.11 Tương quan HMBC trong vòng A của hợp chất Eup14 Hợp chất Eup15: myricitrin Hợp chất Eup15 thu được dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy là 197- 199ºC (MeOH). Các phổ NMR của hợp chất Eup15 có dạng phổ của một hợp chất flavonoid glycoside: hai tín hiệu mũi đôi đặc trưng cho 2 proton ghép meta tại δH [6.24 (1H, d, J = 2 Hz); 6.40 (1H, d, J = 2 Hz)] trên phổ 1H- NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 10.1) và tương ứng với tín hiệu của 2 nguyên tử carbon tại δC 99.8 và 94.7 trên phổ HSQC (phụ lục 10.5), đặc trưng cho sự có mặt của hai proton ở vị trí 6 và 8 của vòng A. Hơn nữa, trên phổ HSQC tín hiệu của 2 proton thơm khác tại δH 6.99 (2H, s, H-2, H-6) tương quan với tín hiệu =CH– tại δC 109.6 có cường độ tích phân cao gấp đôi các tín hiệu =CH– khác trên phổ HSQC tại δC 109.6 đặc trưng cho 2 proton ở vị trí C-2 và C-6 của vòng B đã bị thế 4 vị trí. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 10.2) có một tín hiệu carbon của nhóm carbonyl tại δC 179.6 (C-4). Các tín hiệu proton nằm trong vùng δH 3.33-4.23 trên phổ 1H-NMR cùng với sự xuất hiện một tín hiệu mũi đơn của proton anomer tại δH 5.36 (1H, s) và một tín hiệu mũi đôi của nhóm methyl tại δH 1.00 (3H, d, J = 6.0 Hz) cho thấy sự có mặt của một cấu tử đường α-L- rhamnopyranosyl. Mối tương tác giữa C-3 (δC 136.2) với proton anomer trên phổ HMBC (phụ lục 10.4) chứng tỏ cấu tử đường được gắn vào khung flavonoid tại vị trí 87 C-3. Các dữ liệu phổ NMR phù hợp với công thức phân tử C21H20O12. Dựa vào các kết quả phổ NMR đã phân tích và đối chiếu với tài liệu tham khảo [221] xác định hợp chất Eup15 là myricitrin (myricetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside). Hợp chất này thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quan trọng như kháng oxi hóa, kháng viêm, khả năng bảo vệ gan và cũng được phân lập trước đó từ nhiều loài thực vật như Myrcia splendens, Myrcia palustris, Syzygium samarangense[222-224]. Bảng 4.11 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup15 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup15 (CD3OD) Myricitrin (CD3OD) [221] δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz 2 159.3 159.2 3 136.2 136.2 4 179.6 179.5 5 163.2 163.1 6 6.24 (1H, d, 2.0) 99.8 6.17 (1H, d, 2.0) 100.3 7 166.8 167.4 8 6.40 (1H, d, 2.0) 94.7 6.32 (1H, d, 2.0) 95.0 9 158.4 158.6 10 105.6 105.5 1' 121.9 121.9 2, 6 6.99 (1H, s) 109.6 6.96 (1H, br s) 109.6 3, 5 146.9 146.9 4 137.9 138.0 1 5.36 (1H, s) 103.5 5.33 (1H, br s) 103.6 2 4.23 (1H, s) 71.8 4.24 (1H, br s) 71.9 3 3.81 (1H, dd, 9.3 và 3.3) 72.1 3.81 (1H, d, 7.5) 72.0 4 3.33 (1H, m) 73.3 3.36 (1H, m) 73.4 5 3.52 (1H, m) 72.0 3.54 (1H, m) 72.1 6 1.00 (3H, d, 6.0) 17.8 0.99 (3H, d, 6.5) 17.7 88 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup11, Eup14 và Eup15 được trình bày ở Hình 4.12 OHO OH OH 2 5 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' OH OH Eup11: (+)-catechin O OH HO HO H3C (Eup14: afzelin): R1 = R2 = H (Eup15: myricitrin): R1 = R2 = OH OHO OH R1 OH O 2 45 6 7 8 9 10 1' 2' 3' 4' 5' 6' O R2 Hình 4.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup11, Eup14 và Eup15 Hợp chất Eup19: hymenoxin Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, phụ lục 11.1) xuất hiện tín hiệu của 18 proton. Trong vùng từ trường thấp xuất hiện 1 tín hiệu proton của nhóm –OH kềm nối tại δH 12.74 (s, 1H, 5-OH); 4 tín hiệu proton tại δH [7.68 (1H, dd, J = 9.0/2.0 Hz, H-6'); 7.56 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'); 7.18 (1H, d, J = 9.0 Hz, H-5') và 6.97 (1H, s, H-3)]. Ngoài ra còn có tín hiệu mũi đơn của nhóm –OH ở vị trí 7 tại δH 10.45 (s), và ở vùng từ trường cao hơn, tại δH 3.78-3.88 có 4 tín hiệu proton đặc trưng của 4 nhóm methoxy. Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, phụ lục 11.2) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 11.3) xuất hiện tín hiệu 15 carbon của khung flavon (trong đó có δC từ 103.0 đến 182.3) và bốn nhóm methoxy (δC từ 55.7 đến 61.2) tương thích với phổ proton đã phân tích. Khung flavon gồm 1 carbon carbonyl tại δC 182.3 (C-4); 10 carbon bậc bốn khác tại δC [123.0 (C-1'); 150.9 (C-3'); 149.0 (C-4'); 163.0 (C-2); 148.3 (C-5); 131.5 (C-6), 152.2 (C-7), 127.9 (C-8), 145.4 (C-9), 103.0 (C-10)]; ngoài ra còn 2 nhóm –OH gắn lần lượt trên C-5 (148.3) và C-7 (152.2). Trên phổ HMBC (phụ lục 11.4) nhận được các tương quan của proton tại δH 6.97 với các carbon tại δC 163.0 (C-2) và δC 182.3 (C-4); proton tại δH 12.74 với các carbon tại δC 103.0 (C-10) và δC 131.5 (C-6) cũng chứng minh 2 proton này lần lượt là H-3 và H-5. Ngoài ra, proton taị vòng B chiụ ảnh hưởng của nhóm methoxy nên tı́n hiêụ dao đôṇg ở vùng từ trường thấp (δH từ 7.18 đến 7.56), proton taị δH 6.97 gắn với C-3 tương 89 quan với nhóm carbonyl nên dic̣h chuyển về vùng trường thấp hơn so với bı̀nh thường. Nhóm proton tại δH 7.68 (H-6) tương quan với carbon tại δC 163.0 (C-2) của vòng C và tại δC 149.0 (C-3) trên vòng B kế cạnh. Bên cạnh đó, proton tại δH 7.56 (1H, d, 2.0 Hz, H-2) xuất hiện tương quan lần lượt với carbon tại δC 149.0 (C-3) và δC 119.8 (C-6). Từ những dữ liêụ trên, so sánh với tài liệu đã công bố [225] có thể xác điṇh hơp̣ chất Eup19 là hymenoxin (5,7-dihydroxy-6,8,3',4'-tetramethoxyflavone). Hợp chất này cũng đã được phân lập trước đó từ các loài Viguiera decurrens, V. rosei, V. hypargyrea, Limnophila heterophylla và Hymenoxys scaposa với hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm [225, 226]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn. Bảng 4.12 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup19 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup19 (DMSO-d6) Hymenoxin (DMSO-d6) [225] δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz 2 163.0 163.0 3 6.97 (1H, s) 103.3 6.98 (s) 103.3 4 182.3 182.3 5 148.3 148.3 6 131.5 131.6 7 152.2 151.1 8 127.9 128.0 9 145.4 145.5 10 103.0 102.8 1 123.0 123.0 2 7.56 (1H, d, 2.0) 109.2 7.57 (d, 2.0) 109.2 3 149.0 149.0 4 150.9 152.1 5 7.18 (1H, d, 9.0) 111.9 7.18 (d, 8.0) 111.9 6 7.68 (dd, 9.0 và 2.0) 119.8 7.68 (dd, 2.8) 119.8 6-OMe 3.78 (s) 60.1 3.79 (s) 60.1 8-OMe 3.85 (s) 61.2 3.86 (s) 61.1 3′-OMe 3.88 (s) 55.7 3.89 (s) 55.7 4′-OMe 3.88 (s) 55.7 3.89 (s) 55.7 5-OH 12.74 (s) 12.76 (s) 90 Hợp chất Eup21: cynaroside Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR (phụ lục 12.1 và 12.2) cho thấy phần aglycon của Eup21 có khung sườn dạng luteolin với 15 carbon. Phổ 13C-NMR (150 MHz, CD3OD, phụ lục 12.2) cho một tín hiệu đặc trưng tại δC 99.9 – tín hiệu của carbon acetal C-1 của phân tử đường. Phổ DEPT 90 (phụ lục 12.3) xuất hiện 5 mũi ở các vị trí δC [73.0; 76.3; 69.5; 77.1; 60.6]; kết hợp với dữ liệu phổ HMBC, HSQC và TOCSY (phụ lục 12.4, 12.5 và 12.6) cho biết đó là 5 nhóm >CH–OH của gốc đường. Với độ dịch chuyển hóa học của các carbon vòng đường C-1′′>C-5′′>C-3′′>C-2′′>C-4′′>C-6′′ cho biết đây là đường D-glucose kết hợp với tín hiệu proton anomer có J = 7.2 Hz (ghép dạng trục-trục trên vòng đường của H-1′′ và H- 2′′) cho thấy đơn vị đường glucose có cấu hình β. Phổ HMBC cho thấy có sự tương tác giữa proton H-1 với C-7 trong khung aglycon. Vậy trong phân tử Eup21 có 1 đơn vị đường β-glucose gắn vào khung aglycon ở vị trí C-7. Từ các dữ liệu phổ và so sánh với tài liệu đã công bố [227] giúp nhận danh được hợp chất Eup21 là luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside (cynaroside). Hợp chất này thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa tốt, kháng khuẩn Salmonella typhimurium và Serratia marcescens hiệu quả, được phân lập trước đó từ nhiều loài thực vật trong thiên nhiên như Cynara scolymus L., Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm., Vitex agnus-castus L. [228-230], song đây là lần đầu tiên hợp chất được tìm thấy trong loài Cỏ sữa lá lớn. Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup19 và Eup21 được trình bày ở Hình 4.13 O OMe OMe OMe HO MeO OH O 2 45 7 8 6 9 3' 4' 6' 1' Eup19: hymenoxin 4 OH O O OH OH Eup21: cynaroside 2 7 5 1' 3' 4' 1'' O HO HO OH O OH Hình 4.13 Cấu trúc hóa học của hợp chất Eup19 và Eup21 91 Bảng 4.13 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup21 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup21 (CD3OD) Cynaroside (CD3OD) [227] δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz HMBC (H → C) δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz 2 164.4 164.6 3 6.61 (1H, s) 103.1 6.59 (1H, s) 103.0 4 181.8 181.9 5 161.1 161.1 6 6.50 (1H, d, 2.4) 99.5 C-5, 7, 8, 10 6.49 (1H, d, 2.2) 99.5 7 162.9 162.9 8 6.80 (1H, d, 2.4) 94.6 C-6, 7, 9, 10 6.78 (1H, d, 2.2) 94.7 9 156.9 157.0 10 105.3 105.3 1' 121.3 120.9 2' 7.41 (1H, d, 1.8) 113.5 C-2, 3', 4', 6' 7.39 (1H, d, 2.3) 113.3 3' 145.7 146.0 4' 149.8 150.6 5' 6.91 (1H, d, 8.4) 115.9 C- 1', 3', 4' 6.90 (1H, d, 8.3) 116.0 6' 7.42 (1H, dd, 8.4 và 1.8) 119.1 C-2, 1', 2', 4' 7.40 (1H, dd, 8.3 và 2.3) 119.3 1 5.07 (1H, d, 7.2) 99.9 C-7, 5' 5.06 (1H, d, 7.5) 99.8 2 3.50 (1H, m, 9.2 và 7.2) 73.0 3.50 (1H, m, 9.5 và 7.5) 73.1 3 3.50 (1H, m, 9.2 và 9.0) 76.3 3.50 (1H, m, 9.5 và 9.0) 76.4 4 3.41 (1H, t, 9.6 và 9.0) 69.5 3.41 (1H, t, 9.7 và 9.0) 69.5 5 3.55 (1H, m, 9.6; 6.0 và 2.4) 77.1 3.54 (1H, m, 9.7; 5.8 và 2.3) 77.1 6 3.93 (1H, dd, 12.0 và 2.4); 3.72 (1H, dd, 12.0 và 6.0) 60.6 3.94 (1H, dd, 12.0 và 2.3); 3.73 (1H, dd, 12.0 và 5.8) 60.6 92 Các hợp chất phenol Hợp chất Eup10: caffeic acid Hợp chất Eup10 tồn tại dưới dạng chất rắn vô định hình màu vàng. Phổ HR-ESI- MS (phụ lục 14) cho tín hiệu ion giả phân tử [M-H] ̄ m/z = 179.0614 phù hợp với công thức phân tử C9H7O4 (lý thuyết: 179.0350). Dữ liệu phổ NMR (phụ lục 13) của hợp chất Eup10 xác nhận trong cấu trúc Eup10 mang 1 vòng benzene 3 nhóm thế tại vị trí –1, 2, 4, một liên kết đôi cấu hình trans và một nhóm carboxyl. Cấu hình trans của liên kết đôi được xác nhận bằng giá trị J của proton olefin. Hai proton olefin cho tương quan HMBC với carbon carboxyl cho thấy hợp chất mang nhánh (1E)-propenoyl-3-oic, và nhóm này được gắn vào vòng benzene dựa trên tương quan trong phổ HMBC giữa proton olefin với carbon bậc bốn. Phân tích chi tiết hằng số ghép của các proton vòng benzene ba nhóm thế và dựa trên độ dịch chuyển hóa học của C-3 và C-4, các nhóm thế là các nhóm hydroxyl. Từ các phân tích trên có thể kết luận hợp chất Eup10 là caffeic acid phù hợp với tài liệu công bố [231]. Hợp chất này đã được chứng minh có hoạt tính kháng oxi hóa, tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư và cũng hiện diện khá phổ biến từ các loài thực vật [232-234]. Bảng 4.14 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup10 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup10 (DMSO-d6) Caffeic acid (DMSO-d6) [231] δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz 1 126.2 125.7 2 7.02 (1H, s) 115.1 7.02 (1H, d, 1.8) 115.1 3 146.0 145.7 4 148.6 148.4 5 6.76 (1H, d, 8.4) 116.2 6.76 (1H, d, 7.8) 115.4 6 6.96 (1H, d, 8.4) 121.6 6.97 (1H, dd, 7.8 và 1.8) 121.4 7 7.41 (1H, d, 15.6) 145.0 7.43 (1H, d, 16.2) 144.9 8 6.17 (1H, d, 15.6) 115.6 6.18 (1H, d, 16.2) 115.8 9 168.3 168.0 93 Hợp chất Eup12: protocatechuic acid Hợp chất Eup12 thu được dưới dạng bột màu nâu. Các dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, acetone-d6, phụ lục 14.1) và 13C-NMR (125 MHz, acetone-d6, phụ lục 14.2) cho biết Eup12 là một acid phenolic đơn giản. Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất Eup12 có 7 carbon trong đó có 6 carbon vòng thơm và 1 carbon của nhóm carboxyl tại δC 167.6 (C-7). Trong 6 carbon vòng thơm có 2 carbon bậc bốn gắn oxy tại δC 145.6 (C-3) và δC 150.7 (C-4). Phổ 1H-NMR cho thấy ba tín hiệu proton của Eup12 xuất hiện tại δH [7.53 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2); 6.90 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5) và 7.48 (1H, dd, J = 8.5/2.0 Hz, H- 6)]. Từ các dữ liệu phổ thu được có thể kết luận Eup12 có ba nhóm thế trong vòng benzene trong đó có một nhóm carboxyl và hai nhóm hydroxyl, kết hợp tài liệu tham khảo [235], có thể xác định Eup12 là protocatechuic acid. Hợp chất này đã được các nhà khoa học Ấn Độ nghiên cứu về hoạt tính kháng oxi hóa, kháng vi sinh vật, kháng ung thư và được phân lập từ Helianthemum sessiliflorum Pers., Cinnamomum aromaticum, Hibiscus sabdariffa [236, 237]. Bảng 4.15 Các dữ liệu phổ NMR của hợp chất Eup12 và số liệu tham khảo Vị trí Hợp chất Eup12 (acetone-d6) Protocatechuic acid (acetone-d6) [235] δH ppm (J, Hz) 500 MHz C ppm 125 MHz δH ppm (J, Hz) 600 MHz C ppm 150 MHz 1 123.1 123.2 2 7.53 (1H, d, 2.0) 117.5 7.53 (1H, d, 2.0) 117.6 3 145.6 145.5 4 150.7 150.6 5 6.90 (1H, d, 8.5) 115.7 6.90 (1H, d, 8.3) 115.8 6 7.48 (1H, dd, 8.5 và 2.0) 123.6 7.48 (1H, dd, 8.3 và 2.0) 123.7 7 167.6 167.7 94 Hợp chất Eup13: gallic acid Hợp chất Eup13 thu được dưới dạng chất rắn không màu, nhiệt độ nóng chảy 237–239ºC (MeOH). Trên phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD, phụ lục 15.1) xuất hiện duy nhất một tín hiệu mũi đơn ở vùng thơm tại δH 7.08 (2H, s) cho thấy hợp chất Eup13 có chứa vòng thơm 4 lần thế có trục đối xứng. Trên phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD, phụ lục 15.2) xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 6 nguyên tử carbon thuộc vòng thơm bao gồm 2 nhóm =CH– và 4 carbon bậc bốn, bên cạnh đó có một tín hiệu cộng hưởng của một nguyên tử carbon thuộc nhóm carbonyl tại δC 170.6 (C-7). Tín hiệu cộng hưởng của =CH– tại δC 110.3 (C-2, C-6) và của carbon bậc bốn tại δC 146.4 (C-3, C-5) có cường độ tích phân cao gấp đôi các tín hiệu cộng hưởng khác, điều này khẳng định lại hợp chất Eup13 chứa một vòng thơm 4 lần thế có trục đối xứng, trong đó có một nhóm thế carboxyl. So sánh dữ liệu phổ của hợp chất Eup13 với tài liệu tham khảo [238], cho phép kết luận hợp chất Eup13 là gallic aci