Luận văn Khảo sát thực trạng sử dụng chất bảo quản acid benzoic trong một số thực phẩm ở thanh phố Cần Thơ

c tương này và kiến nghị các cơ quan chức năng làm việc với cơ sở sản xuất nước tương Lộc Thành. Kiểm nghiệm mẫu của nhãn hiệu tàu vị yểu Vị Tâm cũng cho thấy, nồng độ đạm chỉ đạt 18.5°N trong khi ghi trên nhãn bao bì là 20°N. Tỷ lệ chất bảo quản natri benzoat đến 4.06 g/kg. Trong những năm qua, công tác vệ sinh thực phẩm ở nước ta đang đứng trước nhiều thách thức. Nhiều vụ ngộ độc cấp tính gây chết người đã xảy ra rất đáng tiếc ở các bữa ăn gia đình và tập thể làm xôn xao dư luận xã hội. Đấy là chưa kể tình trạng ngộ độc mãn tính do thức ăn bị nhiễm các hoá chất độc tích lũy, gây hại trong cơ thể chưa ai lường hết được. Sức khỏe và thực phẩm có mối quan hệ gắn bó hữu cơ mật thiết với nhau và chất lượng của thực phẩm cũng ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe của con người. Chính từ tính chất quan trọng của thực phẩm đối với sức khỏe của con người nên việc kiểm tra được chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng trở nên quan trọng và cấp bách. CHƯƠNG 2: ACID BENZOIC I. Cấu trúc hóa học 18, 22 Hình 2: Công thức cấu tạo của acid benzoic CTPT C6H5COOH KLPT 122.2 g/mol Tên hệ thống Acid benzoic, acid benzencarboxylic, acid phenylcarboxylic Tên khác Acid benzenformic, acid benzenmethanoic, carboxybenzen, acid phenyl formic, E210,….. Khối lượng riêng 1.32 g/cm3 Điểm nóng chảy 122.4°C (395 K) Điểm sôi 249°C (522 K) Điểm bốc cháy 121°C (394 K) II. Tính chất 18, 22 Acid benzoic có dạng tinh thể hình kim hoặc tấm lá nhỏ, màu trắng lụa óng ánh trắng, dễ tan trong rượu và ete, ít tan trong nước (ở nhiệt độ phòng tan không quá 0.2%), tan trong nước nóng (3.4 g/lít ở 25°C). Trong tự nhiên, acid benzoic được tìm thấy ở các loại cây như: mận, quế và hầu hết các quả mọng. Acid benzoic và muối natri của nó từ lâu đã được sử dụng để ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Tính chất hóa học của acid benzoic bao gồm tính chất của vòng thơm và của gốc carboxylic: II.1. Tính chất của vòng thơm II.2. Tính chất của gốc carboxylic Acid benzoic có tất cả các tính chất như acid carboxylic. III. Sản xuất acid benzoic 18, 22 III.1. Trong công nghiệp Acid benzoic được sản xuất thương mại bởi phản ứng oxi hóa mạch nhánh của toluen với oxy, quá trình được xúc tác bởi coban hoặc mangan naphthenat. Quá trình này sử dụng những nguyên liệu rẻ, đạt năng suất cao và được xem là không gây ô nhiễm môi trường. III.2. Tổng hợp trong phòng thí nghiệm Phản ứng thủy phân: Giống như các nitril hoặc amid khác, benzonitril và benzamid cũng bị thủy phân tạo acid benzoic hoặc bazơ liên hợp của nó trong môi trường acid hoặc bazơ. Từ benzaldehyde: Từ bromobenzen: Bromobenzen trong dietyl ete kết hợp với Mg tạo phenylmagie bromid (C6H5MgBr). Tác nhân Grignard này được thêm từ từ nước đá khô (CO2) tạo ra benzoat. Acid loãng được thêm vào để tạo thành acid benzoic. Do acid benzoic tan rất ít trong nước nên hiện nay người ta thường sử dụng các muối benzoat hơn là sử dụng acid benzoic. Muối benzoat thường được dùng là natri benzoat. Natri benzoat (Sodium benzoate), là dạng muối của acid benzoic, dạng bột hoặc hạt mịn, màu trắng, không mùi, có tính hòa tan trong nước cao. Độ tan của natri benzoat là 550 – 630g/l nước ở 20°C (gấp 200 lần độ tan của acid benzoic), nó cũng tan trong etanol (0, 81g/100ml ở 15°C), metanol và dietyl ete. Natri benzoat cũng có thể được tìm thấy trong tự nhiên, trong các loại trái cây như Việt quất (cranberry), mận Đà Lạt (prune), mận lục (greengage plum), quế, táo…. IV. Ứng dụng của acid benzoic 18,20,21,22 VI.1. Trong sản xuất chế biến thực phẩm Trong công nghiệp thực phẩm, acid benzoic và natri benzoat là các hóa chất dùng để bảo quản thực phẩm (thường được dùng trong xì dầu, tương, chao, các loại nước giải khát, thực phẩm chế biến từ thịt) để khỏi bị hư và có tính chống mốc. Hóa chất này sẽ giúp thực phẩm không bị đổi màu, giữ mùi nguyên thủy và bảo quản các thành phần cấu tạo sản phẩm. Đối với acid benzoic: hầu hết nấm men và nấm mốc có thể bị kiểm soát ở nồng độ acid trong sản phẩm là 0.05 – 0.1%. Trong khi một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm bị ức chế ở nồng độ 0.01 – 0.02% thì sự ức chế các vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm đòi hỏi nồng độ cao hơn rất là nhiều. Acid này có tác dụng ức chế mạnh với nấm men và nấm mốc nhưng tác dụng yếu đối với vi khuẩn. Tác dụng bảo quản chỉ xảy ra ở môi trường acid có pH = 2.5 – 3. Đối với các muối benzoat: các muối này có tác dụng bảo quản tốt nhất ở pH = 2.5 – 4 và kém nhất ở pH > 4.5. Thường dùng làm chất bảo quản trong các loại mứt, nước hoa quả, nước có gas, các loại xốt, nước chấm. Đến nay, cơ chế tác dụng của acid benzoic vẫn chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn. Một vài nhà nghiên cứu cho rằng acid benzoic có tác dụng ức chế sự hấp thụ amino acid trong nấm mốc và vi khuẩn. Các muối benzoat cũng ức chế các enzym trong tế bào vi khuẩn. Đối với con người, khi vào cơ thể acid benzoic tác dụng với glucocol chuyển thành acid purivic không độc, và được thải ra ngoài. Tuy nhiên nếu ăn nhiều acid benzoic cơ thể sẽ bị ảnh hưởng vì glucocol dùng để tổng hợp protein sẽ bị mất do tác dụng với acid benzoic để giải độc. Theo Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), mức chấp nhận của các hóa chất này trong thực phẩm là dưới 0.1%, ở nồng độ 600mg/kg thể trọng có thể gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe. VI.2. Trong y học Acid benzoic được dùng để điều chế dược phẩm đối với thuốc trị nấm ngoài da, lang ben, nấm chân, thuốc sát trùng. Ví dụ như: Thuốc cổ điển dùng để trị hắc lào, lang ben là dung dịch cồn BSI (acid benzoic + acid salicylic + Iod), Antimycose (acid benzoic + acid salicylic + acid boric), dung dịch ASA (Aspirin, natri salicylat). Cồn Benzosali là dung dịch (acid benzoic + acid salicylic + etanol 96° + nước) trị hắc lào (lác), lang ben, nước ăn chân tay và các loại nấm ngoài da khác.  DOXERY là thuốc đặc trị bệnh gan thận có mủ, xuất huyết, đỏ vòm miệng ở cá, thành phần gồm có: doxycyclin,Vitamin K, acid benzoic ,β- galactopyranosyl-D-glucose. VI.3. Trong công nghiệp Acid benzoic là nguồn nguyên liệu được sử dụng để tạo ra một số lượng lớn các hóa chất quan trọng như: Benzoyl clorua, C6H5C(O)Cl, sinh ra do phản ứng của acid benzoic với thionyl clorua, phosgen hoặc một trong những muối clorua của phôtpho. C6H5C(O)Cl là nguyên liệu ban đầu quan trọng tổng hợp một vài dẫn xuất của acid benzoic như benzyl benzoat được sử dụng như hương liệu tổng hợp và thuốc diệt côn trùng. Benzoyl peroxid, [C6H5C(O)O]2, sinh ra do phản ứng của acid benzoic với peroxid. Benzoyl peroxid là chất khơi màu trong phản ứng trùng hợp và cũng là một thành phần trong các sản phẩm mỹ phẩm. Phenol, C6H5OH, là nguyên liệu quan trọng trong công nghiệp hóa học, sản xuất các chất dẻo (nhựa phenolformandehyde), để tổng hợp phẩm nhuộm, chất tẩy rửa, acid salicilic, phenolphtalein, metyl eugenol, acid-2,4- diclophenoxiaxetic,... Ngoài ra acid benzoic còn được dùng để bảo quản thuốc lá, keo dính; sản xuất phẩm nhuộm và chất thơm. Nó còn được tìm thấy trong kem đánh răng, nước súc miệng, các loại mỹ phẩm và các chất khử mùi. V. Nghiên cứu độc tính 18, 22 Acid benzoic và các muối benzoat có độc tính thấp đối với con người và động vật. Ở người liều lượng gây độc qua da là 600mg/kg thể trọng. Tuy nhiên, đối với liều lượng 5 – 10mg trong vài ngày thông qua đường miệng vẫn không gây ra ảnh hưởng bất lợi nào đối với cơ thể. Đó là do con người và động vật có cơ chế giải độc rất tốt đối với các muối benzoat. Những hợp chất này kết hợp với glycin trong gan để tạo thành acid hippuric và được thải ra ngoài qua nước tiểu. Cơ chế này loại bỏ 65 – 95% acid benzoic từ các thực phẩm được đưa vào cơ thể. Các muối benzoat còn lại trong cơ thể sẽ được giải độc bằng con đường kết hợp với acid glucoronic. Tuy nhiên, nếu dùng quá giới hạn cho phép thì acid benzoic và các muối bezoat sẽ gây nên các độc tính như : V.1. Nguy cơ hình thành độc chất gây ung thư trong nước ngọt Cơ quan Kiểm soát tiêu chuẩn thực phẩm của nước Anh đã phát hiện các loại nước giải khát có chứa chất chống mốc natri benzoat có thể phóng thích benzen với hàm lượng cao hơn mức độ cho phép 8 lần. Benzen, một chất gây ra ung thư da và ung thư máu, phát sinh do hai thành phần hiện nay vẫn thường gặp trong nước giải khát là chất bảo quản natri benzoat và ascorbic acid (vitamin C), phản ứng với nhau tạo thành. Natri benzoat, ký hiệu E211, hay 211 thường được dùng làm chất bảo quản trong công nghiệp thực phẩm. Ascorbic acid, hay vitamin C, có trong rau quả, nước ép trái cây, thường cũng được cho thêm vào thực phẩm và thức uống như một chất kháng oxy hóa kéo dài tuổi thọ của sản phẩm. Cơ chế phản ứng được Glenn Lawrence - một trong những nhà hóa học đã từng thử nghiệm benzen cho FDA đầu thập niên 1990, giải thích: • Thoạt tiên, ascorbic acid tác dụng với kim loại sắt, đồng có trong nước để tạo thành những gốc tự do hydroxyl. • Cùng lúc sodium benzoat trong môi trường acid của nước ngọt, cho ra acid benzoic. • Các gốc hydroxyl sẽ tác kích acid benzoic, tách CO2 tạo thành benzen. Theo Lawrence, phản ứng này có thể xảy ra trong thức uống cũng như thức ăn có chứa sodium benzoat và vitamin C, kể cả vitamin C tự nhiên có trong nước ép trái cây. Vì vậy, nước ép trái cây cũng như nước ngọt có dùng vitamin C không được dùng chất bảo quản là sodium benzoat. Hiện nay, vấn đề này đang là cơn sốt ở Mỹ và các nước châu Âu. Cơ quan tiêu chuẩn thực phẩm Anh quốc - Food Standards Agency (FSA) đang tiến hành điều tra sau kết quả kiểm nghiệm 230 mẫu nước ngọt cho thấy hàm lượng benzen trung bình cao hơn mức cho phép trong nước uống. V.2. Natri benzoat gây hại cho gan và thận Thạc sĩ Đào Mỹ Thanh, Trưởng khoa vệ sinh thực phẩm Trung tâm y tế dự phòng thành phố Hồ Chí Minh, cho biết: natri benzoat gây hại cho gan và thận. Thử nghiệm trên chuột, sau 13 ngày tiêm một lượng nhỏ natri benzoat vào cơ thể, 50% số lượng chuột xuất hiện triệu chứng co giật, động kinh và chết. Nhiều trường hợp chuột còn bị rối loạn tổng hợp prôtein. Thí nghiệm trên chó, khi sử dụng chất natri bezoat dưới 1g/kg thì không ảnh hưởng nhưng khi cho chó dùng quá liều lượng này, nó bắt đầu có các biểu hiện co giật thần kinh, một vài trường hợp có thể chết. V.3. Ảnh hưởng đến hệ thần kinh Một nghiên cứu mới đây của Anh cho thấy, một số phẩm màu và chất bảo quản thực phẩm có thể làm trẻ em trở nên hung hăng và lười suy nghĩ hơn. Những chất này có tác động từ từ nên rất khó xác định mức độ gây hại của chúng. Trong 2 tuần, các nhà nghiên cứu cho gần 300 cháu bé 3 tuổi uống nước ép trái cây có pha 20mg màu thực phẩm và 45mg chất bảo quản E211 (natri benzoat). Hậu quả là các cháu khó tập trung ý nghĩ hơn, dễ nổi cáu và rất khó ngủ. Khi không dùng các chất trên nữa, những biểu hiện tiêu cực ở trẻ giảm hẳn, chỉ còn khoảng 1/3 so với trước đó. Theo quy trình sản xuất natri benzoat, một phế phẩm độc hại là phenol luôn hiện diện trong thành phẩm. Do đó, natri benzoat sau khi sản xuất cần phải khử phenol trước khi tung ra thị trường cho công nghệ thực phẩm. Nếu không, nguy cơ bị nhiễm độc do phenol rất lớn. Hóa chất này ảnh hưởng đến hệ thần kinh, nhất là đối với trẻ em và thai nhi trong bụng mẹ khi bị tiếp nhiễm qua đường thực phẩm. VI. Phương pháp xác định hàm lượng acid benzoic18,19,22,8-15 Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định hàm lượng acid benzoic trong thực phẩm bao gồm: phương pháp chuẩn độ, phương pháp quang phổ, phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS) và phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC), trong đó phương pháp sắc ký lỏng cao áp hiện nay đang được ứng dụng rộng rãi. VI.1. Phương pháp quang phổ VI.1.1. Phạm vi và lĩnh vực áp dụng Phương pháp này chỉ được áp dụng để xác định hàm lượng acid benzoic của các loại rau quả và các sản phẩm từ rau quả. Vì các acid clorobenzoic bền vững đối với sự oxi hóa, nên phương pháp này không thể áp dụng khi có mặt của acid P.clorobenzoic, vì quang phổ hấp thụ của acid này gần với quang phổ hấp thụ của acid benzoic. Phương pháp này cũng không thể áp dụng được khi có mặt của acid cinamic vì nó được chuyển thành acid benzoic bởi sự oxi hóa acid cromic. VI.1.2. Nguyên tắc Làm đồng nhất hóa sản phẩm, sau đó pha loãng và acid hóa phần mẫu thử, chiết acid benzoic bằng dietyl ete, sau đó chiết lại acid này bằng kiềm và sau đó acid benzoic được tinh chế bằng cách dùng chất oxi hóa mạnh là kali dicromat trong môi trường acid. Xác định bằng cách đo quang phổ của acid benzoic tinh khiết được hòa tan trong dietyl ete. VI.1.3. Cách tiến hành a. Chuẩn bị mẫu thử Các sản phẩm lỏng (dịch quả, các sản phẩm lỏng có thịt quả, siro) và các sản phẩm đặc (mứt cam, mứt nhuyễn). Làm đồng nhất mẫu sau khi trộn. Dùng pipet lấy 20ml mẫu thử không có các chất ở dạng huyền phù, pha loãng với khoảng 50ml nước và chuyển vào một phễu chiết dung tích 500ml. Sản phẩm rắn (rau, quả) Cắt mẫu thí nghiệm ra thành nhiều miếng nhỏ, bỏ hạt, nghiền trộn đồng nhất một cách cẩn thận khoảng 40g mẫu. Để sản phẩm đông lạnh tan giá trong một bình kín và cho dịch tan chảy này vào sản phẩm trước khi nghiền trộn mẫu. Cân khoảng 10g mẫu thử chính xác đến 0.01g, và dùng 30-40ml nước, chuyển mẫu vào bình cầu 250ml. Thêm khoảng 50mg natri hydrocacbonat. Lắc rồi đặt trên nồi cách thủy, điều chỉnh nhiệt độ lên 70-80oC, và để trong 15-30 phút. Lọc phần chứa trong bình cầu và tráng hai lần bằng nước, mỗi lần dùng 15-20ml. Thu toàn bộ dịch lọc vào phễu chiết dung tích 500ml, để nguội. Các sản phẩm lỏng chứa thịt quả: Lấy 20ml mẫu thử cho vào cối và nghiền với 20ml nước. Lọc chất lỏng sau khi gạn. Làm hai lần liên tiếp, cho bã vào 20ml nước rồi gạn, lọc lấy chất lỏng. Thu toàn bộ dịch lọc trực tiếp vào phễu chiết dung tích 500ml. b. Chiết acid benzoic Cho 1g acid tartaric vào phễu chiết chứa phần mẫu thử đã được pha loãng, thêm 60ml dietyl ete và lắc kỹ. Để cho tách lớp rồi hứng lớp ete vào phễu chiết thứ hai dung tích 500ml (phễu chiết B). Sau đó rửa phần dịch trong phễu chiết thứ nhất (A) bằng 60ml dietyl ete. Để cho tách lớp, rối hứng lớp ete vào phễu chiết (B) có chứa lớp ete thu được lần thứ nhất. Tiếp tục tương tự lần chiết thứ ba bằng 30ml dietyl ete và dồn lớp ete thu được vào cùng hai lần đầu trong phễu chiết (B). Chiết acid benzoic từ dung dịch ete bằng cách thêm liên tiếp 10ml và tiếp 5ml dung dịch natri hydroxyt, và sau đó hai lần, mỗi lần 10ml nước. Sau mỗi lần cho thêm, lắc rồi để cho tách lớp và hứng lấy phần dịch. Hứng dịch vào một đĩa, đặt đĩa lên nồi cách thuỷ, điều chỉnh nhiệt độ lên 70-80oC và để đó cho đến khi thể tích dung dịch kiềm giảm khoảng một nữa, lấy phần dietyl ete đã hòa tan còn sót lại. c. Tinh chế acid benzoic Sau khi để nguội, rót dịch ở đĩa vào một bình cầu dung tích 250ml có chứa hỗn hợp 20ml dung dịch acid sunfuric và 20ml dung dịch kali dicromat. Đậy nắp bình cầu, lắc và để đó ít nhất một giờ. Chú thích: Các chất bảo quản khác có nguồn gốc từ acid benzoic có thể có mặt. Trong trường hợp này, để bình cầu ít nhất 3 giờ để oxi hóa hoàn toàn ba acid hydroxybenzoic và loại trừ bất cứ sự cản trở nào trong việc xác định. Sự kéo dài thời gian phản ứng tạo ra không ảnh hưởng gì vì acid benzoic chịu được hỗn hợp oxi hóa này. Khi sản phẩm ban đầu cũng chứa acid sorbic thì cần phải kéo dài thời gian oxi hóa 24 giờ nhằm đảm bảo phân huỷ hoàn toàn acid này. Chiết acid benzoic tinh khiết: Chiết acid benzoic bằng cách xử lý dung dịch trên hai lần với 20-25ml dietyl ete, thu lấy dung dịch ete. Rửa dung dịch ete hai lần bằng một vài ml nước. Sau khi gạn rất cẩn thận, lọc qua giấy lọc khô và thu dịch lọc vào bình định mức dung tích 50ml. Sau đó rửa giấy lọc bằng một vài ml dietyl ete, thêm đủ dung môi rửa này vào dịch lọc để pha loãng tới vạch. d. Xác định Dùng máy đo quang phổ đo độ hấp thụ của dung dịch ete liên quan đến độ hấp thụ của dietyl ete tinh khiết ở bước sóng 267.5nm đến 272nm và 276.5nm. Độ hấp thụ do acid benzoic được tính bằng công thức dùng đo sự chênh lệch xuất hiện ở bước sóng 272nm. A − A1 + A3 Trong đó: 2 2 A1 là độ hấp thụ ở 267.5nm A2 là độ hấp thụ ở 272nm A3 là độ hấp thụ ở 276.5nm Chú thích: Việc xác định quang phổ hấp thụ của dung dịch ete chứa acid benzoic tinh khiết cho phép biểu thị đặc điểm của sản phẩm này bởi sự có mặt của hai đỉnh ở 272nm và 279nm. Acid benzoic đã được chiết bằng dietyl ete được xác định bằng cách đo chiều cao của đỉnh (pic) ở bước sóng 272nm liên quan tới đoạn thẳng nối các điểm trên trục hoành giữa 267.5nm và 276.5nm. e. Dựng đường chuẩn Lấy một loạt 6 bình định mức dung tích 50ml lần lượt cho vào từng bình 5 – 7.5 – 10 – 12.5 – 15 – 20ml dung dịch chuẩn acid benzoic. Pha loãng tới vạch bằng dietyl ete. Các dung dịch thu được chứa tuần tự 10 – 15 – 20 – 25 – 30 – 40mg acid benzoic/l. Tiến hành đo sự chênh lệch của các dung dịch trên. Vẽ đường cong biểu thị các lần đo sự chênh lệch liên quan đến số mg acid benzoic/l nêu trên. VI.1.4. Biểu thị kết quả • Phần mẫu thử được lấy bằng cách dùng pipet: Hàm lượng acid benzoic sản phẩm tính bằng mg/l theo công thức: m * 50 = 2.5m 2 20 2 Trong đó m2 là khối lượng của acid benzoic đọc trên đồ thị chuẩn tính bằng mg. • Phần mẫu thử được lấy bằng cách cân: Hàm lượng acid benzoic tính bằng mg/kg sản phẩm theo công thức: Trong đó: m * 50 2 m1 m1 là khối lượng của mẫu thử tính bằng gam. m2 là khối lượng của acid benzoic đọc trên đồ thị chuẩn tính bằng mg. VI.2. Phương pháp chuẩn độ VI.2.1. Nguyên tắc Chiết acid benzoic hoặc natri benzoat từ mẫu bằng nước và từ nước bằng chlorofom, sau đó chuẩn độ bằng kiềm. VI.2.2. Tiến hành thử Cân 50g mẫu chính xác đến 0.001g, chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, dùng NaOH 10% trung hòa đến trung tính (thử bằng giấy đo pH). Thêm tiếp: o 10ml K4Fe(CN)6 15% o 12ml ZnSO4 30% o Nước cất đến vạch Lắc đều, để lắng, lọc. Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCl 10% (thử bằng giấy đo pH), sau đó thêm tiếp 5ml HCl 10%. Thêm 30ml chlorofom vào phễu chiết, lắc trong 5 phút, để phân lớp, chiết phần dung dịch nước sang một phễu chiết khác, cho thêm 15ml chlorofom và chiết lại 2 lần nữa. Gộp toàn bộ chlorofom, có thể cho vào bộ cất để thu hồi bớt chlorofom ở 65oC đến còn lại 1/4 thể tích. Chuyển phần cặn còn lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp cách thủy ở 50oC, để nguội. Dùng 50ml etanol hòa tan cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0.05N. VI.2.3. Tính kết quả Hàm lượng acid benzoic hoặc natri benzoat (X) tính bằng % theo công thức: Trong đó :  1 V.K .V .100 X = m.V2 V : Thể tích NaOH 0.05N dùng để chuẩn độ, ml. V1 : Thể tích bình định mức pha mẫu,ml. V2 : Thể tích dịch lọc mẫu hút để chiết, ml. m : Khối lượng mẫu cân, g. K : Độ chuẩn của chất cần xác định theo NaOH 0.05N với : Acid benzoic K = 0.0061g Natri benzoat K = 0.0071g Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định song song tính chính xác đến 0.001%. Chênh lệch kết quả của hai lần xác định song song phải không lớn hơn 5% kết quả trung bình. VI.3. Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) Có nhiều phương pháp xác định hàm lượng acid benzoic nhưng hiện nay phương pháp sắc ký lỏng cao áp đã và đang được sử dụng rộng rãi do các ưu điểm như: độ chính xác và tính đặc hiệu rất cao, lượng mẫu phân tích ít và đặc biệt có thể xác định nhiều chất bảo quản trong cùng một hệ dung môi nếu có chất chuẩn. IV.3.1. Nguyên tắc Mẫu chứa acid benzoic được hòa tan vào trong nước, và được khử tạp bằng hỗn hợp Carrez I (K4[Fe(CN)6].3H2O) và Carrez II (ZnSO4 .7H2O). Sau đó, lần lượt cho chuẩn và dịch lọc của mẫu cần kiểm tra phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) bằng cột sắc ký pha đảo RP-18 với đầu dò UV-Vis. Dựa vào diện tích của pic chuẩn và của mẫu thu được ta sẽ tính toán nồng độ của acid benzoic trong mẫu. IV.3.2. Cách tiến hành a. Chuẩn bị mẫu Cân 5g mẫu cho vào bình định mức 50ml, nước cất, 2ml Carrez I, 2ml Carrez II, cho vào bể siêu âm 10 phút. Lọc qua giấy lọc, lọc lại lần nữa bằng phin lọc dùng cho HPLC. Đưa vào máy đo. b. Chuẩn bị chuẩn Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: 0.25g acid benzoic cho vào bình định mức 250ml, dung môi là nước cất siêu sạch. Dung dịch chuẩn làm việc: pha chuẩn hỗn hợp của hai chất bảo quản acid benzoic và acid sorbic với nồng độ 50, 25, 5, 0.5ppm để xây dựng đường chuẩn. Đối với chuẩn 50ppm, lấy 1.25ml acid sorbic gốc và 1.25ml acid benzoic gốc cho vào bình định mức 25ml, cho nước cất đến vạch. ¶Điều kiện HPLC: • Detector UV – Vis, λ = 230 nm. • Cột sắc ký: RP – 18 (250mm x 4.6µm) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 10µl. • Pha động: CH3COONH4 0.02M : MeOH – 70 : 30 v/v. IV.3.3. Tính toán kết quả Trong đó:  Cmau  = Smau * Cchuan * K * A Schuan Cmau: Hàm lượng acid benzoic có trong 1kg hoặc 1lít mẫu. Smau: Diện tích pic mẫu đo được trên máy. Schuan: Diện tích pic chuẩn đo được trên máy. Cchuan: Nồng độ của chuẩn đem đo. K: Hệ số pha loãng của mẫu (50ml định mức/5g mẫu). A: Hệ số chuyển sang kalibenzoat (1.34) nếu dùng. PHẦN THỰC NGHIỆM o*o A. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Khảo sát phương pháp HPLC định lượng acid benzoic . Xác định hàm lượng acid benzoic của các sản phẩm chả, nước chấm, bánh ngọt và các loại nước giải khát đang lưu thông trên thị trường thành phố Cần Thơ. So sánh hàm lượng acid benzoic của các mẫu kiểm tra với hàm lượng acid benzoic đăng ký chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm ở Trung tâm y tế dự phòng Thành phố Cần Thơ, từ đó sẽ đánh giá được thực trạng sử dụng acid benzoic của các cơ sở sản xuất. B. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. Phương pháp chuẩn độ I.1. Phương pháp tham chiếu: TCVN 4714 : 1989 I.2. Nguyên tắc Chiết acid benzoic hoặc natri benzoat từ mẫu bằng nước và từ nước bằng chlorofom, sau đó chuẩn độ bằng kiềm. I.3. Dụng cụ, hóa chất • Bình định mức, dung tích 100, 250, 500ml. • Phễu chiết có chia độ, 250ml. • Dung dịch ZnSO4 30% • Dung dịch K4Fe(CN)6 15%. • Dung dịch HCl 10%. • Dung dịch NaOH 0.05N và 10%. • Etanol 95%. • Chlorofom. • Phenolphtalein 0.1%. I.4. Tiến hành thử Cân 50g mẫu chính xác đến 0.001g, chuyển toàn bộ vào bình định mức 250ml, dùng NaOH 10% trung hòa đến trung tính (thử bằng giấy đo pH). Thêm tiếp: o 10ml K4Fe(CN)6 15% o 12ml ZnSO4 30% o Nước cất đến vạch Lắc đều, để lắng, lọc. Hút 50ml dịch lọc chuyển vào phễu chiết chia độ, trung hòa bằng HCl 10% (thử bằng giấy đo pH), sau đó thêm tiếp 5ml HCl 10%. Thêm 30ml chlorofom vào phễu chiết, lắc trong 5 phút, để phân lớp, chiết phần dung dịch nước sang một phễu chiết khác, cho thêm 5ml chlorofom và chiết lại 2 lần nữa. Gộp toàn bộ chlorofom, có thể cho vào bộ cất để thu hồi bớt chlorofom ở 65oC đến còn lại 1/4 thể tích. Chuyển phần cặn còn lại trong cốc sứ và làm bốc hơi trên bếp cách thủy ở 50oC, để nguội. Dùng 50ml etanol hòa tan cặn trong cốc, thêm 2 giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng NaOH 0.05N. I.5. Tính kết quả Hàm lượng acid benzoic hoặc natri benzoat (X) tính bằng % theo công thức: Trong đó :  1 V.K .V .100 X = m.V2 V : Thể tích NaOH 0.05N dùng để chuẩn độ, ml. V1 : Thể tích bình định mức pha mẫu,ml. V2 : Thể tích dịch lọc mẫu hút để chiết, ml. m : Khối lượng mẫu cân, g. K : Độ chuẩn của chất cần xác định theo NaOH 0.05N với : Acid benzoic K = 0.0061g Natri benzoat K = 0.0071g Kết quả là trung bình cộng của hai lần xác định song song tính chính xác đến 0.001%. Chênh lệch kết quả của hai lần xác định song song phải không lớn hơn 5% kết quả trung bình. II. Phương pháp HPLC xác định hàm lượng acid benzoic II.1. Phương pháp tham chiếu AOAC Official Method 994.11 (1997). Hiện nay có nhiều chương trình chạy HPLC như: Chương trình HPLC 1 : • Detector UV – Vis, λ = 223 nm. • Cột sắc ký: RP – 18 (250mm x 4.6µm) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 20µl. • Pha động: Acetonitrile – acid citric 80/20 (v/v) Chương trình HPLC 2: • Detector UV – Vis, λ = 230nm. • Cột sắc ký: RP – 18 (250mm x 4.1mm, 10µm) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 20µl. • Pha động: Acetonitril : Đệm photphat - 40/60 (v/v) Chương trình HPLC 3: • Detector UV – Vis, λ = 254nm. • Cột sắc ký: Bondapak C18 (15cm x 4.6mm, 5µm) • Tốc độ dòng: 2ml/phút. • Thể tích bơm: 10µl. • Pha động: Metanol : Đệm acetat - 36/65 (v/v) Chương trình HPLC 4: • Detector UV – Vis, λ = 254nm. • Cột sắc ký: Supelco 516 C18 (15cm x 4.6mm, 5µm) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 20µl. • Pha động: Metanol : Đệm acetat - 36/65 (v/v) Chương trình HPLC 5: • Detector UV – Vis, λ = 227 nm. • Cột sắc ký: C-18 Spherisorb ODS-1 (250mm x4.6mm, 5µ m) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 20µl. • Pha động: 8% metanol trong dung dịch đệm photphat Chương trình HPLC 6: • Detector UV – Vis, λ = 227 nm. • Cột sắc ký: Supelcosil LC-18 (250mm x 4.6mm, 5µ m) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 20µl. • Pha động: Amonium acetat – acetonitril 90/10 (v/v). Chương trình HPLC 7: • Detector UV – Vis, λ = 230 nm. • Cột sắc ký: RP – 18 (250mm x 4.6µm) • Tốc độ dòng: 1ml/phút. • Thể tích bơm: 10µl. • Pha động: CH3COONH4 0.02M : MeOH – 70 : 30 v/v. Trong các chương trình HPLC trên thì chúng tôi chọn chương trình HPLC 7 do phù hợp với trang thiết bị của phòng thí nghiệm. II.2. Nội dung phương pháp Mẫu chứa acid benzoi