Luận văn Nghiên cứu chọn chủng bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn cần giờ có hoạt tính diệt sâu

pháp sản xuất chế phẩm Bt Theo quy mô công nghiệp, chế phẩm Bt được sản xuất chủ yếu theo 2 phương pháp: + Lên men bề mặt: trong công nghiệp lên men thường dùng những hạt cơ chất rắn. Những hạt này có thể có hoặc không có vai trò hấp thụ chất dinh dưỡng trên bề mặt là nguồn dinh dưỡng như cám, lúa mì, bột ngôhoặc chỉ đóng vai trò như chất mang vô cơ. + Lên men chìm có sục khí là phương pháp nuôi VK trong môi trường dinh dưỡng dạng lỏng được thực hiện trong nồi lên men. Phương pháp này cho sản lượng cao, tận dụng được nguyên liệu, dễ cơ giới hóa và tự động hóa. Tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, tốn nhiều năng lượng và tuyệt đối vô trùng. Công nghệ lên men bề mặt đạt hiệu quả không cao nên hiện nay ở nước ta và trên thế giới chủ yếu dùng phương pháp lên men chìm. [24], [30]. 1.4.1. Tuyển chọn chủng Tùy thuộc vào đối tượng sâu hại phòng trừ mà nhà sản xuất sử dụng các chủng khác nhau để lên men. Có 2 cách để tuyển chọn chủng:  Nhà sản xuất có thể chọn chủng tự nhiên có độc lực cao phân lập từ đất bởi vì trong tự nhiên Bt phân bố rất rộng rãi. Tuy nhiên, Bt thường có xu hướng tồn tại trong môi trường có nhiều sâu bọ phát triển và giàu dinh dưỡng nên đây là nguồn cơ chất thích hợp để phân lập và tuyển chọn Bt có hoạt lực cao. Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 10 chủng Bt được phân lập để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Mỗi chủng VSV chỉ chứa 1 hoặc 1 vài gen tổng hợp protein gây độc với 1 loại sâu nhất định.  Tạo giống bằng gây đột biến và công nghệ gen: Để sản xuất được chế phẩm diệt được nhiều loại sâu, người ta tiến hành xác định (có chọn lọc) những đoạn gen rồi dùng kĩ thuật chuyển gen để đưa vào 1 chủng Bt. Chủng Bt này sau đó được cấy vào bình lên men, trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (28oC - 30oC). Sau khoảng 52 h - 54 h, dịch thể chứa các tinh thể protein độc đối với sâu hại sẽ được thu hoạch.[2], [3] 29 1.4.2. Lên men chìm Bước 1: Nhân giống + Mục đích: tạo lượng giống đủ hoạt hoá nhằm giúp giai đoạn pha lag phát triển nhanh. Nếu lag kéo dài tốn thời gian, môi trường. Thời gian pha lag phụ thuộc lượng giống, trạng thái sinh lý của giống: + Tỷ lệ giống được chọn: 3 – 10%. + Giống VK được tiếp vào khi VK đang ở giai đoạn phát triển log, tế bào chuyển hoá mạnh. Cuối pha log bắt đầu xảy ra tạo bào tử, kéo dài pha log.[37] Bước 2: Chọn môi trường lên men trên cơ sở môi trường với các thành phần dinh dưỡng sẵn có. Tùy thuộc vào chủng Bt cần lên men mà chọn môi trường phù hợp. [37] Bước 3: Lên men Với phương pháp lên men chìm, tiến hành trong nồi lên men 500 lít, 1000 lít , 2000 lít, ngoài môi trường dinh dưỡng ra, người ta phải chú ý tới các thông số khác như: chế độ thổi khí, chế độ nhiệt, chế độ nhân chuyển giống để làm sao hạn chế được các thực khuẩn thể làm phá hủy các BT và tinh thể độc tố Bt + Chế độ thổi khí: đây là chỉ tiêu quan trọng cho quá trình hình thành BT và tinh thể độc. Ngưỡng thổi khí tốt nhất trong quá trình lên men là 0,5 – 0,6 m3 môi trường/m3 không khí. Nếu độ thông khí ở mức thấp thì BT phát triển yếu, mật độ thưa. Nếu chế độ khí ở mức cao BT phát triển nhanh, thời gian lên men ngắn, tinh thể độc tố nhỏ, hiệu quả diệt sâu không cao. + Nhiệt độ: có ảnh hưởng đến quá trình hình thành BT. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp hoặc quá cao sẽ kéo dài hoặc rút ngắn quá trình lên men. + Các chế độ luân chuyển giống: đây là chỉ tiêu làm ảnh hưởng đến dự hình thành BT và tinh thể độc. Nếu sử dụng giống liên tục, sẽ xảy ra hiện tượng nhiễm thực khuẩn thể. Bình thường chỉ lên men khoảng 10 – 15 lần giống cũ thì cần phải thay giống mới. Tính ổn định của quá trình lên men được thể hiện ở kết quả lên men thông qua một số chỉ tiêu cơ bản sau: số lượng BT nhiều, độc tố endotoxin cao, kích thước tinh thể độc lớn, khối lượng sinh khối thu hồi trong quá trình lên men cao.[24] 30 1.4.3. Thu hồi sản phẩm Đây là giai đoạn quyết định sản lượng chế phẩm. Người ta li tâm dịch lên men sau đó bổ sung chất bảo quản, giá đỡ để tạo chế phẩm. + Điều chỉnh pH dịch lên men về 4,1 bằng H2SO4 5M + Li tâm liên tục dịch lên men ở ≥ 8000g và < 35ºC, vẫn khuấy trộn liên tục trong thùng lên men + Bổ sung từ từ chất phân tán với tỷ lệ 2% và 1% gam arabic hoặc 5% lactoza trong khi vẫn đảo trộn trong 5 phút để đảm bảo không vón cục. + Sấy phun đến hàm lượng nước 6 - 7% + Sàng qua lỗ < 50μm, nghiền các viên có kích thước lớn ở nhiệt độ < 35ºC + Thử hoạt tính của sản phẩm. [3] 1.4.4. Tạo chế phẩm Chế phẩm dạng hỗn dịch: yêu cầu của chế phẩm dạng hỗn dịch là chế phẩm phải bền vững trong một thời gian dài mà không có sự phân tách các hạt hay sự lắng tủa khi bảo quản và sử dụng. Chế phẩm dạng hỗn dịch thường giữ được hoạt tính trong vòng 6 tháng. Chế phẩm dạng bột: hỗn dịch BT, tinh thể sau khi lên men được li tâm loại nước đến thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu và hỗn dịch BT tinh thể sau li tâm được bổ sung các chất phụ gia. Chế phẩm dạng bột có thể bảo quản trong thời gian dài hơn so với chế phẩm hỗn dịch (1 năm). [2] 1.4.5. Kiểm tra chất lượng sản phẩm Sản phẩm sẽ được kiểm tra các chỉ tiêu như: hiệu lực diệt sâu, kích thước hạt, độ ẩm, pH, độ thấm ướt, độ phân tán, độ tạo huyền phù, độ nhớt Để kiểm tra hiệu lực sinh học cần xác định:  Số lượng tế bào: đếm trên kính hiển vi quang học.  Số lượng BT tự do: đếm số KL trên môi trường thạch.  Hiệu lực diệt sâu: liều lượng gây chết ấu trùng côn trùng.  Liều thử 25 - 50 ấu trùng, thời gian 24 h, số lần lặp lại 4-6 lần.  Trọng lượng phân tử protein tinh thể: xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (PAGE). [24] 31 32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng  Mẫu đất từ RNM Cần Giờ làm nguồn phân lập.  Chủng Bt phân lập từ chế phẩm của Đài Loan.  Sâu tơ (Plutella xylostella) gây hại bắp cải, nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam(Vipesco). 2.1.2. Hóa chất Tryptone, dịch chiết nấm men, tryptose, MnCl2, NaH2PO4, NaHPO4, KH2PO4, NaOH, peptone, glucose, MgSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, MnSO4.4H2O, FeSO4.7H2O, H2SO4 đậm đặc, CaCl2. 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ Nồi hấp vô trùng (ALP, Nhật), Tủ sấy (Memmert, Đức), Máy lắc (Gerhardt, Đức), Tủ cấy vô trùng (Việt Nam), Máy li tâm (Hettich, Đức), Tủ giữ giống (SANYO, Nhật), Tủ lạnh (National, Nhật), Kính hiển vi (Olympus, Nhật), Máy chụp ảnh kỹ thuật số (Olympus, Nhật), Cân phân tích điện tử (Sartorius, Đức), Tủ ấm (Sanyo, Nhật), Máy dập mẫu (Seward, Anh), Máy quang phổ (Amersham Biosciences, Thụy Điển), Máy PCR (Eppendorf, Đức) 2.1.4. Các môi trường nghiên cứu đã sử dụng Môi trường T3 đặc (môi trường phân lập): tryptone 3 g/l, dịch chiết nấm men 1,5 g/l, tryptose 2 g/l, MnCl2 0,005 g/l, NaH2PO4 6,9 g/l, Na2HPO4 8,9 g/l, agar 15 g/l. Môi trường T3 lỏng: thành phần tương tự môi trường T3 đặc nhưng không có agar. Môi trường H de Barjac (môi trường nhân giống): KH2PO4 6,8g/l, NaOH 2,4g/l, peptone 7,5 g/l, glucose 10 g/l, dung dịch A 10ml/l, dung dịch B 10 ml/l, dung dịch C 10 ml/l, nước cất 1 lít. Thành phần của các dung dịch như sau 33 - Dung dịch A: Thành phần Trọng lượng MgSO4.7H2O 12,3g/l MnSO4.4H2O 0,223g/l ZnSO4.7H2O 1,4g/l Nước cất 1 lít - Dung dịch B: Thành phần Trọng lượng FeSO4.7H2O 2g/l H2SO4 đậm đặc 3 ml/l Nước cất 1 lít Hòa 2g FeSO4.7H2O vào 100 ml nước cất, sau đó cho 3 ml dung dịch H2SO4 đậm đặc vào. Sau khi tan hết bổ sung nước cất cho đủ 1 lít. - Dung dịch C: Hòa 20g CaCl2 vào 1 lít nước.[19] 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bt 2.2.1.1. Phương pháp thu thập mẫu đất Thu thập mẫu đất từ các địa điểm khác nhau ở RNM Cần Giờ. Mỗi vị trí lấy 3 mẫu. Cách thu thập mẫu đất như sau:  Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 5 cm, dùng dụng cụ sạch thu lấy 100 gam đất.  Lấy đất cho vào túi vô trùng , dán kín, bảo quản trong thùng lạnh. Trên mẫu đất có nhãn ghi rõ địa điểm thu mẫu, thảm thực vật, ngày lấy mẫu.  Đất được đem về phòng thí nghiệm phân lập ngay hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4oC không quá 24 h. 34 2.2.1.2. Phương pháp phân lập (Traves, 1987)  Nguyên tắc  Tách rời các tế bào VSV.  Nuôi cấy các VSV trong MT dinh dưỡng đặc trưng để mọc thành các KL riêng rẽ, tách biệt nhau. [24]  Cách tiến hành  Cân 0,5g đất trộn với 5ml môi trường T3 lỏng chứa 0,25M đệm natri acetate (pH = 6,8).  Cho vào bình tam giác, nuôi lắc 150vòng/ phút, 30oC/ 4 h.  Mẫu được xử lý ở nhiệt độ 80oC trong 30 phút nhằm tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng .  Lấy 0,2 ml dịch nổi trải đều trên đĩa petri có môi trường T3 nuôi ở 30oC trong 3 ngày.  Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng VK phân lập được bằng kính hiển vi (x100).  Yêu cầu: Chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và có kí hiệu riêng biệt để nhận biết. [13], [14] 2.2.2. Phương pháp bảo quản giống bằng dầu khoáng  Nguyên tắc: bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống bằng cách tạo môi trường yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng của VK.  Cách tiến hành  Cho một ít dầu khoáng vào ống Eppendoft, khử trùng ở 1210C trong 30 phút, để nguội.  Chủng VK cần bảo quản được nuôi cấy trong ống nghiệm khoảng 24 h, dùng que cấy vô trùng lấy 1 ít vi khuẩn cho vào ống Eppendoft, đậy nắp và dùng keo paraffin quấn quanh miệng ống, bảo quản ở điều kiện lạnh - 200C. [16] 2.2.3. Định danh đến loài các chủng Bacillus bằng sinh học phân tử ∗ Thu nhận DNA - Phá màng tế bào và màng nhân bằng protein đặc hiệu (proteinase K) để giải phóng các DNA, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. - Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu: sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform (hỗn hợp này có tác dụng làm biến tính protein) để tách riêng pha có chứa DNA. - Làm kết tủa các acid nucleic bằng ethanol hoặc isopropanol, nhằm thu được các acid nucleic dạng cô đặc, dễ bảo quản. 35 ∗ Chạy PCR (polymerase chain reaction) Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước: - Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94oC-95oC trong vòng 30 giây - 1 phút. - Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút. - Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. ∗ Giải trình tự DNA Nguyên tắc hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh lệch nhau một nucleotide. Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau một nucleotide. Ở cả hai phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamide. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. Sau khi giải trình tự gen 16S rRNA, so sánh với ngân hàng gen NCBI để định danh đến loài chủng VK nghiên cứu. 2.2.4. Phương pháp nhân giống Sử dụng que cấy vòng lấy sinh khối từ môi trường thạch nghiêng cho vào bình tam giác 250 ml có chứa 50 ml môi trường H de Barjac. Nuôi lắc ở nhiệt độ từ 28oC – 30oC, lắc 220 vòng/phút, trong 24 h. 36 2.2.5. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái tế bào, BT, tinh thể Bt 2.2.5.1. Phương pháp nhuộm Gram  Nguyên tắc  Dựa trên khả năng bắt màu của TB chất và màng TB với thuốc nhuộm tím kết tinh và iod mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau.  Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu thuốc nhuộm do không bị rửa trôi khi xử lí bằng cồn. VSV có phức chất này thuộc Gram dương.  Loại phức chất thứ hai không giữ được màu thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lí bằng cồn và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung. VSV này thuộc Gram âm.  Cách tiến hành  Làm vết bôi với VK nuôi cấy từ 16 – 24 h trên ống thạch nghiêng.  Để vết bôi khô tự nhiên hoặc cố định nhẹ trên đèn cồn.  Đặt miếng giấy lọc lên vết bôi.  Nhuộm tiêu bản bằng tím gentian qua giấy lọc trong 1 phút.  Nhuộm lugol trong 1 phút.  Rửa bằng nước cất.  Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản, nhỏ từ từ giọt cồn đến khi tan hết màu.  Rửa bằng nước cất.  Nhuộm bổ sung Fuchsin từ 10 – 30 giây.  Rửa nước, làm khô và quan sát trên KHV với vật kính x100.  Đọc kết quả: VK Gram âm sẽ bắt màu hồng, VK Gram dương sẽ bắt màu tím. [24] 2.2.5.2. Nghiên cứu đặc điểm bào tử và tinh thể  Nguyên tắc:  Coomassie brilliant blue có khả năng tạo phức chất với protein.  Tế bào và tinh thể đều có thành phần cấu tạo từ protein. Vì vậy, có thể nhận biết TB, BT và tinh thể thông qua độ bắt màu với thuốc nhuộm này.  Cách tiến hành  Nhỏ 1 giọt nước cất vô trùng lên phiến kính sạch. 37  Dùng que cấy vô trùng lấy một phần KL mọc riêng rẽ trên ống thạch nghiêng hòa vào giọt nước.  Dàn đều, để khô tự nhiên. Hơ phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vết bôi.  Nhuộm bằng thuốc nhuộm Coomassie brilliant blue trong 3 phút để khô tự nhiên.  Quan sát hình thái tế bào, BT, tinh thể dưới vật kính dầu.  Đọc kết quả: BT không bắt màu, trong suốt; tinh thể bắt màu xanh; TB bắt màu xanh. [43] 2.2.6. Phương pháp xác định số lượng BT, tinh thể độc  Nguyên tắc: Mỗi tế bào của các chủng Bt khi bị phá vỡ giải phóng ra một BT và một tinh thể độc. Do đó đếm số lượng BT ta có thể ước tính số lượng BT, tinh thể độc, cũng như đánh giá được tốc độ sinh trưởng của chủng Bt trong môi trường lên men.  Cách tiến hành Để đếm số lượng BT ta tiến hành xử lý mẫu ở 70oC trong 10 phút rồi pha loãng mẫu. Lấy 0,1ml ở nồng độ pha loãng cuối (10-5) cấy gạt vào các đĩa thạch vô trùng chứa môi trường đếm số lượng BT (3 đĩa). Để vào tủ ấm ở 28oC trong 24h rồi đếm số lượng KL mọc trên mỗi đĩa. Số lượng BT trong 1ml dịch lên men sẽ được tính theo công thức: X = n.10/a (BT/ml) X: số lượng BT/ 1ml dịch lên men. n: số KL trung bình trong 1 đĩa a: nồng độ pha loãng mẫu. [2] 2.2.7. Định lượng mật độ TB bằng phương pháp đo mật độ quang  Nguyên tắc: Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới cũng làm môi trường trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ TB. Do vậy có thể định lượng mật độ TB một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 660 nm. 38  Cách tiến hành: Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa độ đục và mật độ TB bằng cách:  Pha loãng một huyền phù VK cần kiểm nghiệm có mật độ TB bất kỳ thành các huyền phù khác nhau có độ đục đo ở OD 660 nm đạt các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.  Đo OD ở bước sóng 660 nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận các số đo thực tế. Dùng phương pháp đếm trực tiếp dưới kính hiển vi (dùng buồng đếm hồng cầu) xác định mật độ TB (N/ml) của các huyền phù này. Tính giá trị log(N/ml) cho mỗi giá trị mật độ N/ml tương ứng với độ đục.  Vẽ đường tương quan tuyến tính giữa mật độ TB log(N/ml) và giá trị mật độ quang OD 660 nm, với trục tung là mật độ TB, trục hoành là giá trị mật độ quang. Xác định mật độ TB theo độ đục:  Đo độ đục của một huyền phù TB cần xác định mật độ.  Từ giá trị OD660 nm đo được, suy ra số log(N/ml) và trị số mật độ N/ml từ đường chuẩn. [16] 2.2.8. Phương pháp nuôi và nhân giống sâu tơ  Đối tượng: Sâu tơ (Plutella xylostella) gây hại bắp cải, nhận từ Công ty thuốc sát trùng Việt Nam (Vipesco).  Cách tiến hành Thức ăn của sâu là lá rau cải tươi, sẽ được thay mỗi ngày. Sâu tơ tuổi 4 sẽ được nuôi trong tủ ấm, nhiệt độ 220C – 250C, độ ẩm 75% - 80%. Sau 1 – 2 ngày tiến hành thu nhộng, cho vào đĩa Petri. Nhộng sau 2 ngày sẽ được cho vào hộp (trong đó có 1 lọ đựng dung dịch đường 10%), phía trên miệng hộp được bịt kín bằng giấy sạch. Lá cải tươi được vò cho dập và đặt lên phía trên miếng giấy để thu hút bướm đẻ trứng. Nhộng sau khoảng 3 – 4 ngày sẽ nở thành bướm. Bướm sẽ hút mật (dung dịch đường 10%) và sẽ đẻ trứng trên miếng giấy. Thu lấy trứng, sau 2 ngày trứng sẽ nở thành sâu non. Tiếp tục nuôi cho đến khi thành sâu trưởng thành.  Kết quả: Sâu tuổi 3 có màu xanh đậm, di chuyển linh hoạt, chuyển sang ăn cả phần biểu bì của lá. 39 2.2.9. Phương pháp thử hoạt tính diệt sâu  Nguyên tắc: Xác định hoạt tính diệt sâu của chủng Bt dựa trên khả năng tạo ra tinh thể độc, tiêu diệt nhiều loại sâu hại cây trồng  Cách tiến hành: Tiêu chuẩn sâu thí nghiệm: đồng đều về tuổi (đang ở giai đoạn tuổi 3). Thức ăn cho sâu: lá rau cải tươi Thí nghiệm được bố trí gồm 2 lô:  Lô đối chứng: thức ăn của sâu được nhúng vào môi trường lên men vô trùng đã chuẩn bị sẵn (không có VK Bt).  Lô thí nghiệm: thức ăn của sâu được nhúng vào dịch lên men VK Bt. Các lô thí nghiệm bố trí trong các đĩa petri vô trùng (mỗi lô 3 đĩa) với số lượng sâu như nhau (10 sâu/đĩa). Các đĩa petri bằng vải màn thưa để đảm bảo môi trường trong đĩa luôn được thoáng khí. Đặt các đĩa thí nghiệm trong phòng có nhiệt độ 250C. Theo dõi và thống kê số lượng sâu sống/chết; tình trạng sâu sau 24 h, 48 h, 72 h ở tất cả các lô thí nghiệm. Tính tỉ lệ sâu chết theo công thức Abbott: 𝐴 = 𝐶−𝑇 𝐶 𝑥 100 Trong đó: A: % sâu chết Hình 2.1. Sâu tơ (Plutella xylostella) Hình 2.2. Nhộng Hình 2.3. Bướm 40 C: Số sâu sống sót ở lô đối chứng. T: Số sâu sống sót ở lô thí nghiệm.  Yêu cầu kết quả: Sâu bị nhiễm Bt lúc đầu bị tê liệt toàn thân sau đó sâu có hiện tượng ngừng ăn, di chuyển chậm chạp, cuối cùng không hoạt động, cơ thể biến màu, sâu chết có màu đen, toàn thân khô cứng. [13], [14], [46] 2.2.10. Khảo sát ảnh hưởng của Mg2+ và Mn2+ đến khả năng sinh trưởng và hình thành tinh thể độc 2.2.10.1. Ảnh hưởng của Mg2+  Nguyên tắc: Mg2+ là nguyên tố có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp protein của vi khuẩn Bt.  Cách tiến hành Nuôi hai chủng Bt trong bình tam giác chứa 50 ml môi trường H de Barjac có bổ sung MgSO4 với nồng độ từ 0 đến 0.15 mM, mỗi bước nhảy 0.005. Sau 40 h nuôi cấy, ở nhiệt độ 30oC, tiến hành thu dịch lên men. Kiểm tra sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục OD660nm. Kiểm tra số lượng BT, tinh thể theo 2.2.6.  Yêu cầu: xác định nồng độ Mg2+ cho khả năng sinh trưởng và hoạt tính diệt sâu cao nhất. [10] 2.2.10.2. Ảnh hưởng của Mn2+  Nguyên tắc: Mn2+ là nguyên tố quan trọng có tác dụng làm ổn định cấu trúc của protein tinh thể và kích thích tạo BT của Bt.  Cách tiến hành Nuôi hai chủng vi khuẩn Bt trong bình tam giác chứa 50 ml môi trường H de Barjac có bổ sung MnSO4 với nồng độ từ 0 đến 2 mM, mỗi bước nhảy 0.5. Sau 40 h nuôi cấy, ở nhiệt độ 30oC, tiến hành thu dịch lên men. Kiểm tra sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục OD660nm. Kiểm tra số lượng BT, tinh thể theo 2.2.6.  Yêu cầu: xác định nồng độ Mn2+ cho khả năng sinh trưởng và hoạt tính diệt sâu cao nhất. [10] 41 2.2.11. Phương pháp kiểm tra sự hiện diện của gen sinh nội độc tố của Bt  Nguyên tắc: các tinh thể diệt côn trùng được mã hóa bởi rất nhiều gen Cry khác nhau. Các gen này được phát hiện dựa vào khả năng bắt cặp với mồi đặc hiệu.  Cách tiến hành:  Bước 1: Tách chiết DNA của chủng Bt nghiên cứu:  Nuôi chủng Bt trên môi trường thạch T3 ở 370C.  Lấy một KL thuần vào ống Eppendorf, sau đó bổ sung vào 1000µl PBS 1X.  Vortex dịch trong 5 phút đến khi sinh khối VK được trộn đều.  Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút.  Sốc nhiệt 1000C trong 15 phút, để tủ lạnh 40C trong 15 phút.  Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.  Hút lấy dịch nổi chuyển sang Eppendorf khác.  Bước 2: Chạy PCR  Nguyên tắc: Khuyếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng cặp mồi chuyên biệt. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kì nối tiếp nhau, mỗi chu kì gồm 3 bước: - Bước 1 (biến tính): trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường khoảng là 94oC-95oC trong vòng 30 giây - 1 phút. - Bước 2 (lai): nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này dao động khoảng từ 40oC – 70oC và kéo dài trong vòng 30 giây - 1 phút. - Bước 3 (tổng hợp): nhiệt độ được tăng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.  Cách tiến hành: Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µl đựng trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6µl, dNTP 2,5µl, buffer 2,5µl, primer 2µl, enzim Tag- polymeraza 0,4µl, MgCl2: µl, DNA 2µl ( nồng độ 50ng/µl). Bảng 2.1. Các cặp mồi được sử dụng [9], [13], [14], [48] Cặp Chuỗi nucleotide Gen Kích 42 mồi thước (bp) TY6 5’-GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’ Cry1Ab 238 TY14 5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’ TYIC 5’-CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC-3’ Cry1c 288 TYIUNI 5’-TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCT-3’  Bước 3: Điện di sản phẩm PCR  Nguyên tắc: acid nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy, chúng có thể dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường. Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích và chạy được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau.  Cách tiến hành:  Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE (Tris- acetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò viba (làm nóng chảy gel và không tạo bọt).  Làm nguội gel xuống 50°C - 55°C, thêm 1µl thuốc nhuộm DNA, đổ gel vào khuôn gel và lắp lược.  Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 - 5 mm.  Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực.  Điện di trong khoảng 30 phút với điện thế 100V - 120V.  Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả.  Bước 4: Đọc kết quả Bản gel được đặt quan sát trên bàn đèn UV. Chất nhuộm sẽ gắn xen các base của phân tử DNA nên sẽ phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại. Đối chiếu vạch sáng với thang DNA chuẩn và đọc kết quả. 43 2.2.12. Phương pháp tạo chế phẩm Bt - Hoạt hóa giống: từ giống được bảo quản trong ống Eppendoft ở tủ lạnh 40C, VK được cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, đặt trong tủ ấm 300C trong 24 h. - Nhân giống: giống phát triển tốt sẽ được cấy sang bình tam giác chứa 50 ml môi trường H de Barjac, nuôi lắc 220 vòng/ phút, ở nhiệt độ 300C trong 24 h. - Lên men thu sinh khối TB: + Tiến hành lên men trong bình tam giác (dung tích 250ml) có chứa 50ml môi trường H de Barjac, nuôi lắc 220 vòng/ phút, ở nhiệt độ 300C trong 40 h. + Sau thời gian thích hợp, ly tâm thu sinh khối TB với tốc độ 10000 vòng/20 phút/40C. + Rửa TB bằng nước cất. - Tạo chế phẩm: Dịch sinh khối sau khi ly tâm (có dạng paste) được trộn với chất mang. Chất mang giúp VK có thể tồn tại lâu, nó nhờ chất bảo quản chế phẩm. Chất mang thường là khô đậu tương, khô lạc, cám gạo, bột gạo, đường lactose, sucrose,. Cụ thể như sau: + Bổ sung 1 ml Tween 80/1g cặn BT tinh thể. + Trộn sinh khối TB với 50% bột diatomite đã thanh trùng ở 70oC. + Trộn thêm với 10% đường sucrose. + Sấy khô hỗn hợp trên bằng tủ sấy có quạt gió, ở nhiệt độ 40 – 45oC với thời gian thích hợp để đạt độ ẩm 8-12%. + Kiểm tra chất lượng chế phẩm sau khi sấy khô: kiểm tra mật độ TB bằng phương pháp đếm số KL và kiểm tra hoạt tính diệt sâu. + Đóng gói chế phẩm: 50g/gói. + Bảo quản: chế phẩm được bảo quản trong bao nhôm (hàn kín) và được giữ ở nhiệt độ phòng. + Trong thời gian bảo quản thường xuyên kiểm tra mật độ TB của chế phẩm. [2], [3], [4] 2.2.13. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Các thí nghiệm trong luận văn được lặp lại ít nhất 3 lần. Kết quả trình bày trong luận văn là số liệu trung bình ± sai số, được tính bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Stagraphic 3.0. 44 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng VK Bacillus từ đất RNM Cần Giờ Từ các mẫu đất được lấy ở những khu vực khác nhau trong RNM Cần Giờ, chúng tôi tiến hành phân lập theo phương pháp của Traves (1987), sử dụng tác nhân chọn lọc là natri acetate. Trước khi phân lập, các mẫu được gia nhiệt ở 800C trong 30 phút để diệt các tế bào sinh dưỡng và các tế bào không sinh BT. Kết quả thu được 28 dạng khuẩn lạc (KL) khác nhau, tạ