Tóm tắt Luận án Tổng hợp và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của các dẫn xuất tubulysin

pháp nghiên cứu và thực nghiệm (37 trang), Chương 3: Kết quả và thảo luận (55 trang), kết luận (1 trang), danh mục các công trình công bố liên quan luận án (1 trang). Phần tài liệu tham khảo có 97 tài liệu về lĩnh vực liên quan đến luận án được cập nhật đến năm 2020. Phần phụ lục 81 trang gồm phổ của các chất tổng hợp được. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Niêm khuẩn, các hoạt chất và hoạt tính sinh học 1.2. Vi ống và vai trò trong nghiên cứu thuốc 1.3. Tubulysin: Phân lập, xác định cấu trúc, hoạt tính sinh học Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của các tubulysin thiên nhiên 4 1.4. Tổng hợp các ɤ-amino acid của tubulysin 1.5. Tƣơng quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất tubulysin CHƢƠNG 2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Phương pháp tổng hợp hữu cơ 2.1.2. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu cơ 2.1.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào 2.2. Thực nghiệm 2.2.1. Hóa chất và dung môi 2.2.2. Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide Hình 1.17. Tương quan hoạt tính - cấu trúc của các tubulysin 5 2.2.3. Tổng hợp tubuphenylalanine 2.2.4.. Tổng hợp tubuvaline 2.2.5. Loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của Tup và Tuv 2.2.6. Tổng hợp dipeptide 2.2.7. Tổng hợp tripeptide 2.2.8. Tổng hợp dẫn xuất tubulysin 2.2.9. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin 2.2.10. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các tetrapeptide. Sơ đồ 2.1: Sơ đồ tổng quát tổng hợp các tetrapeptide 6 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Định hƣớng tổng hợp các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin 3.2. Tổng hợp tubuphenylalanine Phản ứng tổng hơp tubuphenylalanine acid (Tup) 47a được bắt đầu từ L-phenylalanine methyl ester hydrochloride (68), thông qua quy trình 7 bước phản ứng như được mô tả trong sơ đồ 3.2. Đầu tiên, nhóm amino của chất 68 được bảo vệ bằng nhóm tert-butoxycarbonyl qua phản ứng với Boc2O trong dung môi THF và NaHCO3 ở nhiệt độ phòng trong 16 h thu được sản phẩm 45 (94%). Sự chuyển hóa ester 45 thành aldehyde 52 được tiến hành qua hai bước phản ứng liên tục, bằng phản ứng khử hóa với NaBH4 trong dung môi MeOH ở nhiệt độ phòng trong Sơ đồ 3.1. Định hướng tổng hợp các dẫn xuất và chất tương tự tubulysin 7 thời gian 20h thu được hợp chất trung gian N-Boc-phenylalaninol (45a) mà không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel, với hiệu suất 96%. Sơ đồ 3.2. Phản ứng tổng hợp Tup 47a Sự chuyển hóa nhóm hydroxyl về aldehyde được tiến hành với tác nhân oxy hóa DMP (Dess Martin Periodinane) dưới điều kiện hồi lưu trong các dung môi DCM, EtOAc hoặc dung môi DMSO ở nhiệt độ phòng. Tuy nhiên, quá trình oxy hóa với tác nhân DMP đều không có sự chuyển hóa hoàn toàn thành aldehyde. Sản phẩm thu được đạt hiệu suất khoảng 74%. Bằng cách sử dụng tác nhân oxi hóa IBX (2-iodoxybenzoic acid) trong dung môi DCM hoặc EtOAc dưới điều kiện đun hồi lưu, sản phẩm aldehyde 52 đã thu được hiệu suất cao hơn. Kết quả cho thấy phản ứng sử dụng IBX và đun hồi lưu trong EtOAc cho hiệu suất cao nhất (94%) và sản phẩm có thể dùng trực tiếp cho phản ứng bước tiếp theo mà không cần tinh chế qua cột sắc ký silica gel. Từ sản phẩm aldehyde 52, alkene 42 dễ dàng thu được qua phản ứng ngưng tụ theo Horner-Wadsworth-Emmons giữa hợp chất 52 với triethyl-2-phosphonopropionate và NaH ở nhiệt độ từ 0-25 oC trong thời gian 14h (0 oC 5 phút, nhiệt độ thường 14h). Phản ứng tạo sản phẩm alkene 42 (75%) với cầu hình E ưu tiên (tỷ lệ E/Z  75/25). Cấu hình E 8 của sản phẩm 42 được xác định dựa trên phân tích dữ liệu của phổ 1H-, 13C-NMR và phổ hai chiều NOESY, kết hợp so sánh với các phổ của chất đã được công bố. Sản phẩm 42 được chuyển thành acid 69 và gắn mạch ester với menthol qua phản ứng Steglich giữa 69 và menthol, sau đó hydro hóa sản phẩm tạo thành nhận được các đồng phân lập thể không đối quang với tỷ lệ 47a/47b = 4,5/1, có thể tách được sản phẩm mong muốn 47a bằng phương pháp sắc ký cột thông thường . Cấu trúc của hợp chất 47a được khẳng định thông qua phân tích các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR, kết hợp so sánh phổ đã được công bố. 3.3. Tổng hợp tubuvaline 3.3.1. Tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy) methyl)thiazole (14) Để tổng hợp 2-bromo-4-((tert-butyldimethylsilyloxy)methyl) thiazole (14) chúng tôi lựa chọn thiourea làm tác nhân ban đầu theo phản ứng Hantzsch. Phản ứng được tiến hành giữa thiourea với ethyl bromopyruvate dưới điều kiện hồi lưu 4 h trong dung môi ethanol thu được hợp chất thiazole 70 ở dạng tinh thể sau khi sử lý phản ứng, với hiệu suất 75% (Sơ đồ 3.6). Sự chuyển hóa nhóm amine của chất 70 thành 2-bromothiazole 71 thông qua phản ứng Sandmeyer bằng cách xử lý với các tác nhân NaNO2, CuSO4 và KBr trong môi trường 30% H2SO4 ở 0 oC trong 1 h; sau đó được đưa về nhiệt độ phòng và khuấy thêm 15h, xử lý thu được sản phẩm 71 với hiệu suất 65%. Ester 71 được khử hóa thành hợp chất hydroxyl bằng phản ứng với NaBH4 trong MeOH hoặc NaBH4 và CaCl2 trong hỗn hợp dung môi EtOH/THF (với tỷ lệ 2/1) 16h ở nhiệt độ phòng. Kết quả cho thấy, sử dụng tác nhân NaBH4 trong hỗn hợp dung môi EtOH/THF và CaCl2 cho sản phẩm (2-bromothiazol-4-yl)methanol (72) đạt hiệu suất cao nhất (95%). 9 Từ sản phẩm 72 thu được, sự bảo vệ của nhóm hydroxyl với TBSCl với xúc tác imidazole/DMAP trong dung môi DCM ở nhiệt độ phòng nhận đươc sản phẩm 14 với hiệu suất 97%. 3.3.2. Tổng hợp N-methyltubuvaline-OMe (79) Quy trình tổng hợp Tuv-OMe 79 được thực hiện qua 10 bước phản ứng, sử dụng L-valine amino acid làm nguyên liệu đầu, như trình bày trong sơ đồ 3.14. Chất tert-butoxycarbonyl-L-valine được tăng mạch thêm 1 nhóm methylene qua phản ứng Arndt-Eistert. Hợp chất N- Boc-Val-OH trước hết được xử lý với ethyl chloroformate ở 0 oC trong 1h, sau đó sử lý với diazomethane trong ether. Sản phẩm diazoketone 21 tạo thành được phản ứng với với N,O-dimethylhydroxylamine với xúc tác C6H5COOAg trong dung môi THF thu được sản phẩm chính Weinreb amide 22a, với tổng hiệu suất đạt 54 %. Phản ứng N-methyl hóa của chất 22a được xử lý với NaH và MeI trong 24 h nhận được 73 với hiệu suất 95% . Phản ứng gắn mạch carbon-carbon giữa Weinreb amide 73 và dẫn xuất thiazole 14 tạo thành sản phẩm 74 là phản ứng quan trọng nhất trong quy trình tổng hợp dẫn xuất tubuvaline. Phản ứng được tiến hành dưới các điều kiện yêu cầu nghiêm ngặt về nhiệt độ cũng như độ khan, dưới tác dụng của tác nhân nBuLi. Sơ đồ 3.6. Tổng hợp dẫn xuất thiazole 14. 10 Hợp chất thiazole 14 trước hết được xử lý với nBuLi ở -78 oC trong 1h, sau đó Weinreb amide 73 được thêm vào. Phản ứng được khuấy ở -78 oC thêm 1h sau đó khuấy ở nhiệt độ phòng 12h. Ketone 74 thu được ở dạng chất lỏng màu vàng nhạt đạt hiệu suất 55%. Sản phẩm 74 được xác định qua phân tích phổ 1H- và 13C-NMR. Phản ứng khử hóa ketone 74 thành hợp chất hydroxyl 15a được khảo sát với các tác nhân khử khác nhau như: sử dụng NaBH4 trong hỗn hợp dung môi MeOH/THF; tác nhân LiAlH4 trong THF hoặc tác nhân khử chọn lọc BH3.Me2S/CBS. Kết quả cho thấy, sử dụng sử dụng 1 eq BH3.Me2S và 10% mol xúc tác CBS trong dung môi THF thu được chất 15a với độ chọn lọc lập thể lên đến 85% và hiệu suất chuyển hóa đạt 90%. Hợp chất alcohol 15a được bảo vệ với nhóm acetyl bằng phản ứng với acetic anhydride trong TEA và xúc tác DMAP ở nhiệt độ phòng sau 14 h thu được sản phẩm 75 với hiệu suất đạt 97%. Sơ đồ 3.14: Phản ứng tổng hợp hợp chất 79 11 Các dung môi dùng cho phản ứng acetyl hóa như dichlomethan, acetonitrile hay tetrahydrofuran được sử dụng. Kết quả cho thấy, phản ứng với dung môi DCM sản phẩm 75 thu được sạch, không cần tinh chế trên cột sắc ký silica gel và được sử dụng để thực hiện phản ứng tiếp theo. Từ hợp chất 75, nhóm bảo vệ tert-butyl-dimethylsilan (TBS) được loại bỏ bằng phản ứng với tetra-n-butylammonium fluoride (TBAF) trong dung môi dichloromethane tạo thành hydroxyl 76. Tiếp theo, hợp chất 76 được chuyển hóa thành aldehyde trung gian bằng phản ứng đun hồi lưu với tác nhân Dess-Martin (IBX) trong dung môi ethylacetate. Acid 78 thu được bằng phản ứng với các tác nhân oxi hóa khác nhau. Dưới các điều kiện của phản ứng Pinnick, sử dụng các tác nhân NaOCl2/NaH2PO4 trong dung môi DCM đã thu được sản phẩm đạt hiệu suất thấp và phải tinh chế sản phẩm trên cột sắc ký silica gel. Bằng cách thay đổi các điều kiện của phản ứng oxi hóa sử dụng tác nhân oxone trong dung môi DMF ở điều kiện nhiệt độ phòng trong thời gian 12h. Sản phẩm acid 78 thu được đạt hiệu suất 95% mà không cần tinh chế trên cột silica gel. Hợp chất 78 được xử lý với diazomethane trong dung môi diethylete ở 0 oC trong thời gian 3h và giữ thêm ở nhiệt độ phòng 12 h thu được methyl ester 79 với hiệu suất 96%. Cấu trúc của các sản phẩm trung gian, các ɤ- amino acid được khẳng định thông qua phân tích các phổ 1H-, 13C-NMR. 3.4. Loại bỏ nhóm bảo vệ boc của tuv và tup Các sản phẩm 79, 47a, 42 được xử lý với lượng dư TFA trong dung môi DCM với sự có mặt của triisopropylsilane (TIPS) và nước theo tỷ lệ thể tích TFA/TIPS/H2O = 95/2,5/2,5 (Sơ đồ: 3.15). Phản ứng được thực hiện ở 0 oC trong 2h, nhận được các muối trifluoroacetic 80, 81, 82 với hiệu suất cao (95%). 12 Công thức các muối 80, 81, 82 được khẳng định bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- và 13C-NMR. 3.5. Tổng hơp dipeptide Dipeptide 84 được tổng hợp từ muối 80 với một đương lượng chất Boc-Ile-OH trong dung môi DMF có mặt bazơ diisopropylethylamin và tác nhân ghép mạch amide HATU (1.2 eq). Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h (Sơ đồ 3.17). Sản phẩm 84 được khẳng định qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C-NMR. Ester 84 tạo thành được loại bỏ nhóm methyl thu được acid 85 bằng phản ứng với LiOH 5% trong hỗn hợp dung môi THF/H2O (2/1) ở nhiệt độ phòng trong 12h. Trong quá trình này nhóm bảo vệ acetyl cũng dễ dàng bị thủy phân và sản phẩm 85 thu được với hiệu suất 90%. Sản phẩm 85 được khẳng định qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C. Phổ 1H-NMR chất 85 có các tín hiệu cộng hưởng tương tự phổ chất 84, ngoài ra phổ chất 85 đã mất tín hiệu singlet cộng hưởng tại tại 3,73 ppm là tín hiệu đặc trưng của ba proton methoxy (OMe-3H), và mất tín hiệu singlet tại 2,19 ppm tín hiệu đặc trưng proton nhóm acetyl (OAc, 3H). Để tránh tạo thành sản phẩm phụ cho các phản ứng tiếp theo, nhóm hydroxyl trong sản phẩm 85 được acetyl hóa với acetic anhydride nhận được sản phẩm acetyl hóa 86. Sơ đồ 3.15. Phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ Boc của 42, 47a, 79 13 3.6. Tổng hợp tripeptide 3.6.1. Tổng hợp tripeptide 88 Dipeptide 84 được loại bỏ nhóm bảo vệ bằng phản bằng TFA trong sự có mặt của TIPS/H2O thu được muối trifluoroacetic. Phản ứng giữa muối trifluoroacetic với N-methylpipecolinic acid (Mep) trong dung môi DMF, dưới tác dụng tác nhân ghép nối HATU (1.2 eq) và DIPEA (10 eq) ở nhiệt độ phòng trong 14h (Sơ đồ 3.18) thu được sản phẩm 88 với hiệu suất đạt 55% sau khi tinh chế trên cột silica gel. Sản phẩm 88 được khẳng định nhờ các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR. 3.6.2. Tổng hợp tripeptide 89 Hợp chất 89 được tổng hợp bằng phản ứng acyl hóa giữa dipeptide 86 với hợp chất 82 (1 eq) trong dung môi DMF, dưới tác dụng của tác nhân HATU (1.2 eq) và DIPEA (10 eq) (Sơ đồ 3.19). Sau 14 h Sơ đồ 3.17: Quy trình tổng hợp dipeptide 84, 85, 86 Sơ đồ 3.18: Phản ứng tổng hợp tripeptide 88 14 khuấy ở nhiệt độ phòng, sản phẩm sạch thu được bằng cách tinh chế trên cột sắc ký silica gel nhận được chất 89 với hiệu suất 60%. Trên phổ 1H-NMR chất 89 ở vùng trường thấp thể hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton vòng thiazole ở 8,05 ppm singlet (1H, H-9), các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton vòng phenyl ở 7,29 -7,21 ppm (5H). Tín hiệu doublet đặc trưng của proton E-olefin (H-4) cộng hưởng tại 6,67 ppm (J = 9 Hz). Tín hiệu singlet của CH3-N tại 3,01 ppm (3H). Tín hiệu singlet cộng hưởng tại 2,16 ppm của 3 proton nhóm acetyl (OAc). Tín hiệu singlet tại 1,41 ppm cuản nhóm Boc (9H) 3.6.3. Tổng hợp tripeptide 90, 90b Để tổng hợp các dẫn xuất mà sự thay thế của nhóm Mep ở đầu N của tetrapeptide bằng các acid khác, các tripeptide 90 và 90b được tổng hợp từ phản ứng ngưng tụ giữa các hợp chất 85/86 với hợp chất 81 trong dung môi DMF, dưới tác dụng của HATU và DIPEA ở nhiệt độ phòng trong 14 h (Sơ đồ 3.20). Sản phẩm tripeptide 90, 90b thu được với hiệu suất phản ứng đạt 60-65%. Sản phẩm 90, 90b được khẳng định qua phân tích các phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR. Sơ đồ 3.19: Phản ứng tổng hợp tripeptide 89 Sơ đồ 4.20: Phản ứng tổng hợp tripeptide 90, 90b 15 3.6.4. Tổng hợp các tripeptide 91, 92 Tương tự, từ dipeptide 85 và 86 các tripeptide 91 và 92 đã được tổng hợp bằng phản ứng với phenylalanine methyl ester hydrochloride trong dung môi DMF, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 14h (Sơ đồ 3.21). Các sản phẩm được tinh chế trên cột sắc ký silica gel (n- Hexan/EtOAc; 1/1) thu được sản phẩm sạch tương ứng 91 và 92 với hiệu suất 55- 60%. Sơ đồ 3.21: Phản ứng tổng hợp các tripeptide 91, 92 Các sản phẩm 91, 92 được khẳng định nhờ các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR. 3.7. Tổng hợp dẫn xuất tubulysin N-Methyltubulysin U (95) được tổng hợp qua 4 phản ứng (Sơ đồ 3.22). Tripeptide 90b, 90 được loại bỏ nhóm bảo vệ Boc trong TFA tiếp sau là phản ứng amide hóa với N-methylpipecolinic acid trong dung môi DMF và HATU có mặt DIPEA thu được các tetrapeptide 93 và 93a. Sản phẩm ester 93 sau đó được thủy phân nhóm menthyl để tạo ra các dẫn xuất tubulysin. Để có cơ sở cho phản ứng thủy phân các dẫn xuất ester chứa nhóm menthyl, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện phản ứng thủy phân trên dẫn xuất 93, với tác nhân LiOH và KOH trong hỗn hợp dung môi THF/H2O. Kết quả cho thấy nhóm menthyl chỉ bị thủy phân dưới tác dụng của bazơ mạnh KOH ở nhiệt độ 45-50 oC trong thời gian từ 48 giờ, sản phẩm 94 (N-Methyltubulysin V) thu được với hiệu suất 92 %. Cấu trúc của 94 được xác định dựa trên phân tích phổ HRMS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và so sánh với phổ các chất đã được công bố [11,48]. Tetrapeptide 94 tiếp tục được acetyl hóa nhóm 16 OH tự do bằng phản ứng với acetic anhydride trong DCM, TEA và 1% mol DMAP thu được sản phẩm N-Methyltubulysin U (95) với hiệu suất phản ứng đạt 90%. Phổ khối lượng HRMS-ESI chất 95 xuất hiện ion giả phân tử m/z = 728.4051 [M+H]+, (Tính cho C38H58N5O7S: 728.4057), kết quả này phù hợp với CTPT C38H57N5O7S. Trên phổ 1H-NMR chất 95 thể hiện đầy đủ các tín hiệu của các proton tương ứng. Ở vùng trường thấp tín hiệu proton của vòng thiazole cộng hưởng singlet tại 8,10 ppm (H-9), các tín hiệu proton của vòng phenyl ở 7,26-7,17 ppm (5H). Tín hiệu cộng hưởng doubtlet-doublet tại 5,73-5,70 ppm đặc trưng của proton H-11 liên kết OAc. Tín hiệu singlet của proton nhóm CH3-N trên Tuv tại 3,10 ppm (H-17), và CH3-N trên vòng pipecolinic (H-6’) tại 2,40 ppm. Ngoài ra, tín hiệu singlet đặc trưng của nhóm CH3-acetyl tại 2,15 ppm. Phổ 1H-NMR chất 95 có các tín hiệu tương đồng với phổ các chất đã được công bố trước đó [11,48,49]. 3.8. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin 3.8.1. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế isoleucine bằng leucine. Sơ đồ 3.22: Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 93a,93,94,95 17 Phản ứng được thực hiện từ tripeptide 87 qua phản ứng loại bỏ nhóm bảo vệ Boc trong TFA và hai phản ứng ghép nối liên tiếp với N- methylpipecolinic và muối trifluoroacetic 81, sản phẩm ester tạo thành được acetyl hóa nhóm OH tự do thu được 96 với hiệu suất chung đạt 45%. Sản phẩm 96 được xác định qua phân tích phổ ESI-MS, 1H, 13C- NMR 3.8.2. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N-terminal. Các hợp chất 97, 98 được tổng hợp từ tripeptide 90 qua 4 phản ứng liên tiếp (Sơ đồ 3.25). Các phản ứng được thực hiện tương tự như tổng hợp N-Methyltubulysin U (95). Các sản phẩm 97, 98 được khẳng định thông qua phân tích phổ ESI-MS, 1H-, 13C-NMR. Sơ đồ 3.25: Phản ứng tổng hợp các dẫn xuất 97, 98 Sơ đồ 3.24: Phản ứng tổng hợp hợp chất 96 18 Phổ 1H-NMR chất 97, 98 có các tín hiệu cộng hưởng tương tự phổ chất 95 (N-Methyltubulysin U), ngoài ra trên phổ chất 97, 98 xuất hiện thêm các tín hiệu proton của các dị vòng picolinic hoặc isoquinoline ở vùng trường thấp, đồng thời mất đi tín hiệu đặc trưng của 3 proton nhóm methyl liên kết nitơ ở 2,21 ppm và các tín hiệu của proton methylene no của vòng pipecolinic ở 1,2-1,7 ppm. Các hợp chất 99, 100, 101 là ester của menthol tạo thành trong phản ứng ghép mạch tripeptide 90 hoặc 90b với 5-methylpyrazine-1- carboxylic và N- allylpipecolinic acid (Sơ đồ 3.26, 3.27). Cấu trúc của 99, 100, 101 được khẳng định dựa vào phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR. Trên phổ 1H-NMR chất 100 thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các proton dị vòng thơm, proton vòng thiazole và nhóm phenyl. Các tín hiệu cộng hưởng trong vùng trường thấp gồm: tín hiệu proton của vòng pyrazine tại 9,11 ppm (singlet) được quy cho proton H-4’, tín hiệu proton H-2’ singlet tại 8,59 ppm. Tín hiệu proton của vòng thiazole cộng hưởng tại 8,10 ppm (H-9). Các tín hiệu proton của vòng phenyl cộng hưởng tại 7,27-7,18 ppm. Sơ đồ 3.26. Phản ứng tổng hợp hợp chất 99 Sơ đồ 3.27. Phản ứng tổng hợp hợp chất 100, 101 19 3.8.3. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu C-terminal Các tetrapeptide 102, 103 được tổng hợp từ muối trifluoroacetic của tripeptide 89, qua phản ứng ghép nối với N-Methylpipecolinic acid, ester 102 nhận được với hiệu suất đạt 60%. Ester 102 tiếp tục được xử lý với LiOH trong hỗn hợp dung môi THF/H2O thu được acid 103 với hiệu suất phản ứng 92% (Sơ đồ 3.28). Sản phẩm ester 102 và acid 103 được xác định qua phân tích các phổ ESI-MS, 1H, 13C-NMR. Phổ 1H-NMR chất 102 có các vùng tín hiệu tương tự phổ chất 89, ngoài ra trên phổ chất 102 không xuất hiện tín hiệu của nhóm bảo vệ Boc tại 1,4 ppm mà xuất hiện tín hiệu singlet tại 2,21 ppm đặc trưng của 3 proton H-6’ trên vòng pipecolinic. Trong một hướng tổng hợp khác, hợp chất 104 được tổng hợp từ tripeptide 88 qua 3 phản ứng liên tiếp (Sơ đồ 3.29), sản phẩm 104 nhận được với hiệu suất chung đạt 43 % sau khi tinh chế trên sắc ký cột silica gel. Sơ đồ 3.28: Phản ứng tổng hợp hợp chất 102, 103 Sơ đồ 3.29. Phản ứng tổng hợp dẫn xuất 104 20 3.8.4. Tổng hợp các chất tƣơng tự tubulysin với thay thế amino acid ở đầu N- và C-terminal 3.8.4.1. Tổng hợp các các chất tương tự tubulysin từ tripeptide 89 Muối trifluoroacetic của 89 được phản ứng với 5- methylpyrazin-1-carboxylicvà isoquinoline-1-carboxylic acid trong dung môi DMF với tác nhân ghép mạch amid HATU, trong sự có mặt của bazơ DIPEA (Sơ đồ 3.30). Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12 h. Sản phẩm được tinh chế trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi nHexan/EtOAc (1/1) nhận được các ester 105, 106 với hiệu suất đạt từ 55-65%. Các sản phẩm 105, 106 được khẳng định thông qua việc phân tích các phổ cộng hưởng từ hạt nhân ESI-MS, 1H-, 13C-NMR, DEPT90. Trên phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất 105 thể hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của các proton. Ester 106 được xử lý với 10 đương lượng LiOH trong hỗn hợp dung môi THF/H2O, phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 12h, nhận được các axit 107 với hiệu suất đạt 93% (Sơ đồ 3.31). Sản phẩm tetrapeptide 107 được khẳng định nhờ các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR Sơ đồ 3.30: Phản ứng tổng hợp hợp chất 105, 106 Sơ đồ 3.31. Phản ứng tổng hợp acid 107 21 Phổ 1H-NMR chất 107 xuất hiện đầy đủ các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng tương tự như phổ chất 105. Ngoài ra trên phổ chất 107 đã mất đi các tín hiệu singlet đặc trưng của ba proton nhóm acetyl ở 2,19 ppm và tín hiệu multiplet của 2 proton nhóm ethoxy tại 4,21-4,16 ppm (2H). 3.8.4.2. Tổng hợp các chất tương tự tubulysin từ tripeptide 91 Muối trifluoroacetic của 91 được phản ứng với 5-methylpyrazin cacboxylic acid (1eq) trong dung môi DMF, với sự có mặt của tác nhân HATU và DIPEA (Sơ đồ 3.32). Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong khoảng 12h, tinh chế sản phẩm thô trên cột sắc ký silica gel được sản phẩm sạch 108. Ester 108 tiếp tục được thủy phân với LiOH trong hỗn hợp dung môi THF/H2O. Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 24h thu được sản phẩm tetrapeptide 109 với hiệu suất 90%. Trên phổ 1H-NMR chất 108 ở vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton vòng pyrazin tại 9,21 ppm (1H, s, H-4’), tín hiệu singlet tại 8.46 ppm tương ứng với proton H-2’. Tín hiệu singlet proton vòng thiazole tại 8.06 ppm (1H, H-6), các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng của proton vòng phenyl ở 7.30 -7.16 ppm (5H). Tín hiệu (td) đặc trưng tại 5.68-5.66 ppm của proton H-8 (1H). Tín hiệu công hưởng của 2 proton H-2 và H-16 tại 5.06-4.99 ppm (2H, m). Sơ đồ 3.32. Phản ứng tổng hợp các hợp chất 108, 109 22 Trong một hướng tổng hợp khác, muối trifluoroacetic của 92 được phản ứng với 5-methylpyrazin cacboxylic acid (1 eq) trong điều kiện tương tự như trên (Sơ đồ 3.34). Sản phẩm tetrapeptide 110 thu được với hiệu suất 64 % sau khi được tinh chế trên cột sắc ký silica gel. Sản phẩm 110 được xác định qua phân tích phổ ESI-MS, phổ 1H-NMR . 3.9. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tƣơng tự tubulysin Các tetrapeptide tổng hợp được được thử nghiệm gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư ở người gồm: tế bào ung thư vú- MCF7 (Human breast carcinoma), tế bào ung thư phổi ở người-A549 (human lung adenocarcinoma), tế bào ung thư ruột kết ở người- HT29 (human colorectal adenocarcinoma), tế bào ung thư bạch cầu cấp ở người- HL60 (human acute leukemia), tế bào ung thư đại tràng ở người- SW480 (human colon carcinoma), với chất đối chứng là ellipticine. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào (Bảng 3.1) cho thấy các tubulysin khi nhóm Mep được thay thế bởi các dị vòng như 3- methylpicolinic acid, 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid và 2- quinolinecarboxylic acid đều thể hiện hoạt tính gây độc tế bào yếu hơn so với hợp chất có gắn nhóm Mep từ 20-50 lần; hoặc không thể hiện độc tế bào (IC50 > 50 M). Ví dụ có thể thấy giữa chất 100 và 93a, sự khác nhau ở nhóm Mep và 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid khác biệt tới 34 lần; hay giữa chất 97 và 95, hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào Sơ đồ 3.34. Phản ứng tổng hợp hợp chất 110 23 ung thư HT29 giảm trên 50 lần khi nhóm Mep được thay thế bằng 3- methylpicolinic acid. Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các dẫn xuất và chất tương tự tubulysin * n.d: Không xác định So sánh giữa 3 acid dị vòng, các hợp chất gắn 2- quinolinecarboxylic acid có hoạt tính mạnh hơn so với các hợp chất được gắn 3-methylpicolinic acid, 5-methyl-2-pyrazinecarboxylic acid (chất 98 so với 97; 99). Kết quả này cho thấy việc thay thế Mep bởi các amino acid được methyl-N hóa ở vị trí α (tạo thành các amine bậc 3) so STT Hợp chất IC50 (µM) HT29 A549 MCF-7 SW480 HL-60 1 93a 1.45 1.46 3.26 0.91 0.43 2 94 4.38 4.61 4.83 1.99 1.47 3 95 0.56 0.42 0.68 0.25 0.14 4 96 4.76 6.82 9.88 n.d n.d 5 97 32.37 44.75 34.53 33.28 26.54 6 98 15.12 17.91 13.34 13.13 10.57 7 99 >50 >50 >50 n.d n.d 8 100 >50 >50 >50 n.d n.d 9 101 24.38 25.87 29.84 n.d n.d 10 102 0.27 0.30 0.23 0.11 0.08 11 103 2.60 3.33 4.49 2.32 1.21 12 104 >50 >50 >50 >50 >50 13 105 28.57 39.14 27.13 19.37 15.98 14 106 >50 >50 >50 n.d n.d 15 107 >50 >50 >50 n.d n.d 16 108 >50 >50 >50 n.d n.d 17 109 7.57 9.38 12.46 n.d n.d 18 110 42.91 29.20 29.45 n.d n.d 19 Ellipticine 0.32 0.36 0.35 0.31 0.33 24 với nhóm carboxylic có vai trò quan trọng trong việc duy trì hoạt tính gây độc tế bào của tubulysin. Kết quả độc tế bào của 3 chất 93a, 94 và 95 trên 5 dòng tế bào ung thư cho thấy vai trò quan trọng của nhóm OAc trên mạch tubuvaline. Khi không có nhóm acetyl, hoạt tính gây độc của 94 trên các dòng tế bào ung thư HT29, A549, MCF7, SW480 và HL-60 tương ứng là IC50: 4.38, 4.61, 4.83, 1.99, 1.47 M, yếu hơn so với dẫn xuất được acetyl hóa 95 từ 7 đến 11 lần (IC50 của 95 trên các dòng tế bào ung thư tương ứng 0.56, 0.42, 0.68, 0.25 và 0.14 M). Đặc biệt, sự thay thế của nhóm Tup đầu C bằng hợp chất không no (dẫn xuất 102 và 103) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn so với các dẫn xuất tubulysin chứa nhóm Tup. Điều này được thể hiện khi so sánh kết quả gây độc tế bào với 93a, 94 và 95. So với chất 94, chất 103 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào không khác nhiều trên các dòng SW480 và MCF7. Tuy nhiên, trên dòng A549, HT29 và HL60, dẫn xuất 103 có hoạt tính mạnh hơ